Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

Vi takker Dr. Yves L. Janin for hans frugtbare kommentarer og forslag. Vi vil gerne takke HH Gad for Chik / Ren og C. Combredet for hendes teknisk support. Dette arbejde blev støttet af Institut Pasteur, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Program STING til POV og HM- L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Program STING 2.0 til POV), og &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (kemisk Library Project, tilskud n ° I 06-222 / R og jeg 09-1739 / R til HM-L.). Arbejdet på CHIKV / Ren blev støttet af projektet ArbOAS (ANR tilskud 2010-INTB-1601-1602).

1. Fremstilling af 96-brønds afledte Plader med forbindelser <ol><li> Flyt 96-brønds mor-plader indeholdende 10 mM stamopløsninger af kemiske forbindelser i DMSO fra -20 ° C til stuetemperatur. Fortyndede forbindelser 5x i DMSO til opnåelse af mellemprodukter 96-brønds fortynding plader ved 2 mM. Fortynding er opnået ved at pipettere fem pi i 20 pi DMSO og blanding. </li><li> Afpipetteres 1 pi fra fortynding plader i tørre brønde hvidt, stregkode vævsdyrkningsplader med 96 brønde. Dette første sæt af datt...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

Screeningen pipeline her beskrevet sigter mod at udvælge forbindelser med en passende profil som bredspektrede inhibitorer af RNA-virus. Når et bibliotek på 10.000 forbindelser blev screenet med denne protokol og førnævnte filtrering kriterier blev anvendt, dvs hæmning af MV replikation overlegen til 75%, 40 forbindelser (0,4%) scorede positiv. Udover, omkring halvdelen af ​​dem viste nogle toksicitet i luciferase-baserede levedygtighedsassay, og blev der set bort af denne grund. Endelig blev et dusin...

RNA-virus er ansvarlig for en lang række infektioner hos mennesker, og har en enorm indflydelse på befolkningerne i hele verden, både hvad angår den offentlige sundhed og økonomiske omkostninger. Effektive vacciner er blevet udviklet mod flere humane RNA-virus, og er almindeligt anvendt som profylaktiske behandlinger. Imidlertid er der stadig en kritisk mangel på terapeutiske lægemidler mod RNA-virus-infektioner. Faktisk effektive vacciner er ikke tilgængelige mod større humane patogener som dengue-virus, Hepatitis C virus eller humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV). Udover, RNA-virus er ansvarlige for størstedelen af ​​nye sygdomme, som er steget i hyppighed på grund af den globale børser og menneskets påvirkning af økologiske systemer. Mod denne trussel, der repræsenterer RNA-vira, vores terapeutiske arsenal er yderst begrænset og relativt ineffektive 1-3. Nuværende behandlinger er hovedsagelig baseret på rekombinant type I interferoner (IFN-α / β) for at stimulere medfødte immunitet,eller administration af ribavirin. Selvom virkningsmekanismen af denne ribonucleosid analog er kontroversiel og formentlig beror på forskellige mekanismer, hæmning af cellulær IMPDH (inosinmonofosfatdehydrogenase), der udtømmer intracellulære GTP puljer, er helt klart afgørende 4.. Ribavirin i kombination med pegyleret IFN-α, er den vigtigste behandling mod hepatitis C-virus. Men IFN-α / β og ribavirin behandlinger er af forholdsvis ringe effektivitet in vivo mod de fleste RNA-vira, som de effektivt stump IFN-α / β signalering gennem ekspression af virulensfaktorer 5 og ofte undslippe ribavirin 3. Det tilføjes, at ribavirin er at hæve vigtige spørgsmål toksicitet, selv om det for nylig blev godkendt mod alvorlig HRSV sygdom med kontroversielle fordele 6.. For nylig har nogle virus-specifikke behandlinger blevet markedsført, især mod influenzavirus med udviklingen of neuraminidasehæmmere 3. Men den store mangfoldighed og permanente fremkomst af RNA-vira til hinder for udviklingen af ​​specifikke behandlinger mod hver af dem i en forholdsvis tæt fremtid. Tilsammen understreger dette behovet for effektive strategier til at identificere og udvikle potente antivirale molekyler i den nærmeste fremtid. Det er trivielt at sige, at et bredt spektrum inhibitor aktive mod et stort panel af RNA-vira ville løse dette problem. Selv om et sådant molekyle er stadig en virusspecialist drøm, vores bedre forståelse af cellulære forsvarsmekanismer og medfødte immunsystem tyder på, at nogle muligheder eksisterer 7,8. Flere akademiske og industrielle laboratorier søger nu molekyler, der stimulerer bestemte facetter af cellulære forsvarsmekanismer eller metaboliske veje til at sløve viral replikation. Selv om sådanne forbindelser, der sandsynligvis vil vise betydelige bivirkninger, vil behandlinger mod akutte virusinfektioner være administrereed for en relativ kort tid, hvilket gør dem acceptable trods nogle potentielle toksicitet på lang sigt. Forskellige strategier er blevet udviklet til at identificere sådanne bredspektrede antivirale molekyler. Nogle forskningsprogrammer sigter mod at finde molekyler, der er målrettet specifikke veje forsvar eller metabolisk. Dette omfatter for eksempel patogen anerkendelse receptorer fremkalder antiviral genekspression 9 og aktiverer antivirale faktorer såsom RNaseL 10 autofagi maskiner til fremme af virus nedbrydning 11 nukleosidsyntesen pathways 12,13 eller apoptotiske kaskader at udfælde død virusinficerede celler 14.. Andre grupper har udviklet fænotypiske skærme, der ikke målrette-baserede 13,15-17. I så fald er antivirale molekyler simpelthen identificeres ved deres evne til at blokere viral replikation i et givet cellulært system. Den generelle antagelse er, at en forbindelse, hæmme 2-3 uafhængige RNA-vira ville have en passende profil til et bredt spectrum antiviralt molekyle. Virkningsmekanismen hit forbindelser udvalgt med sådan en empirisk tilgang alene bestemmes i en anden tid og i sidste ende kan føre til identifikation af nye cellulære mål for antivirale lægemidler. Interessant nok har en retrospektiv analyse af nye lægemidler, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration mellem 1999 og 2008 vist, at i almindelighed, sådan fænotypiske screeninger har tendens til at klare sig bedre end målrettede tilgange til at opdage first-in-class lille molekyle narkotika 18 . Viral replikation i high-throughput cellebaserede assays bestemmes normalt ud fra virus cytopatiske effekter. Celler inficeret og dyrket i 96 - eller 384-brønds plader i nærværelse af testede forbindelser. Efter nogle dage, cellulære lag fikseres og farves med farvestoffer, såsom krystalviolet. Endelig er absorbans bestemmes med en plade læser og forbindelser hæmmer viral replikation identificeres ved deres evne til at bevare cellulære lag from virus-induceret cytopatisk virkning. Alternativt viralt medierede cytopatiske virkninger bedømmes under anvendelse af standard levedygtighed assays, såsom MTS reduktion. Sådanne assays er meget medgørlig og omkostningseffektiv, men lider tre store begrænsninger. Først, de kræver et virus-celle kombination hvor viral replikation er cytopatisk på kun få dage, men det er ikke altid muligt, og dermed opfordrer til alternative tilgange 19. For det andet er de dårligt kvantitativ da de er baseret på et indirekte mål for viral replikation. Endelig kan giftige forbindelser blive scoret som positive hits, og derfor skal fjernes med en tæller skærm måler cellulær levedygtighed. For at overvinde nogle af disse forhindringer har rekombinante vira eller replikoner blevet manipuleret af revers genetik til at udtrykke reporter-proteiner, såsom EGFP eller luciferase fra en yderligere transkriptionsenhed eller i ramme med virale protein-gener (få eksempler 20-23). Når disse vira kopiere, reporter PRoteins produceres sammen med virale proteiner selv. Dette giver en meget kvantitativ analyse for at måle viral replikation og evaluere den inhibitoriske aktivitet af kandidatmolekyler. Dette er især tilfældet for rekombinante vira, der udtrykker luciferase (eller andre enzymer, der kan bioluminescens), eftersom dette reportersystem udviser et bredt dynamikområde med en høj følsomhed og næsten ingen baggrund. Desuden er der ingen excitationslyskilde, hvilket forhindrer interferens med forbindelse fluorescens 24. Her har vi detalje en high-throughput-protokollen til at screene kemiske biblioteker for bredspektrede inhibitorer af RNA-virus. Forbindelser testes først på humane celler inficeret med et rekombinant mæslingevirus (MV), der udtrykker ildflueluciferase 25 (rMV2/Luc, figur 1, den primære skærm). MV tilhører Mononegavirales orden, og er ofte betragtes som et prototypisk medlem af negativt-strenget RNA-viruses. Som sådan er MV-genomet anvendt som en template med viruspolymerasekomplekset til syntese af mRNA-molekyler, der koder for virale proteiner. I den rekombinante MV stamme kaldet rMV2/Luc er luciferaseekspression udtrykkes fra en yderligere transkriptionsenhed indsættes mellem P-og M-gener (figur 2A). Sideløbende er forbindelser testet for deres toksicitet på humane celler ved hjælp af en kommerciel luciferase-baserede reagens, der vurderer, af ATP kvantificering, antallet af metabolisk aktive celler i kultur (figur 1, den primære skærm). Hele kemiske biblioteker kan let screenes med disse to analyser for at udvælge forbindelser, der ikke er toksiske og effektivt blokerer MV replikation. Derefter hits testes igen for dosis-respons-hæmning af MV replikation, mangel på toksicitet såvel som for deres evne til at forringe Chikungunya virus (CHIKV) replikation (figur 1, sekundær skærm). CHIKV er medlem af Togaviridae familien og dens genom er APositive enkeltstrenget RNA-molekyle. Som sådan, det er helt uden forbindelse med mæslinger og forbindelser hæmmer både MV og CHIKV stå en stor chance for at hæmme et stort panel af RNA-virus. CHIKV strukturelle proteiner er direkte oversat fra det virale genom, mens de strukturelle proteiner kodes af transkription og translation af en subgenomiske mRNA-molekyle. Vores replikation in vitro assay for CHIKV er baseret på en rekombinant stamme kaldet CHIKV / Ren, der udtrykker Renilla luciferase enzym som en spaltet del af det ikke-strukturelle polyprotein ved en insertion af reportergenet mellem NSP3 og nsP4 sekvenser 26 (figur 2B). Målestokken for Renilla luciferaseaktivitet tillader overvågning af viral replikation på det tidlige stadium af CHIKV livscyklus. Denne high-throughput protokol blev anvendt til hurtigt at identificere forbindelser med en passende profil til bredspektrede antivirale i en kommerciel bibliotek på 10.000 MolecESTEMMELSER beriget for kemisk mangfoldighed. Forbindelser blev hovedsagelig følgende Lipinski herredømme af fem, med molekylvægt, der varierer fra 250 til 600 dalton, og log D-værdier under 5. De fleste af disse molekyler var nye kemiske enheder, der ikke er tilgængelige i andre kommercielle biblioteker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA-virus er ansvarlig for større menneskelige sygdomme som influenza, bronkitis, denguefeber, Hepatitis C eller mæslinger. De repræsenterer også en ny trussel på grund af øgede verdensomspændende udvekslinger og befolkningsgrupper gennemtrængende flere og flere naturlige økosystemer. Et godt eksempel på en sådan en spirende situation Chikungunyavirus epidemier af 2005-2006 i Det Indiske Ocean. Nylige fremskridt inden for vores forståelse af cellulære mekanismer, der styrer virusreplikation tyder på, at stoffer til værten cellefunktioner, snarere end selve virus, kunne hæmme et stort panel af RNA-virus. Nogle bredspektrede antivirale forbindelser er blevet identificeret med værten målrettede analyser. Men måling af inhiberingen af ​​viral replikation i cellekulturer ved hjælp af reduktion af cytopatiske virkninger som en udlæsning stadig et altoverskyggende screening strategi. Sådanne funktionelle skærme er blevet kraftigt forbedret gennem udviklingen af ​​rekombinante vira, der udtrykker reporterenzymer capable af bioluminescens, såsom luciferase. I nærværende rapport, vi detalje en high-throughput screening rørledning, som kombinerer rekombinante mæslinger og Chikungunya virus med cellulær levedygtighed assays til at identificere forbindelser med en bredspektret antiviral profil.

Denne screening rørledning er først om udvælgelse af stoffer, som hæmmer MV replikation og viser ikke nogen signifikant cellulær toksicitet (figur 1, den primære skærm). Det drager fordel af luciferase-assays til at bestemme cellulær toksicitet og inhibering af viral replikation. Alle pipetteringstrin og dataopsamling kan udføres i en high-throughput indstilling med en robot platform. Cellulær toksicitet af forbindelserne vurderes ved anvendelse af en luciferase-ba...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

In vitro assays til at måle virus replikation er blevet kraftigt forbedret gennem udvikling af rekombinante RNA-virus, der udtrykker luciferase eller andre enzymer, der kan bioluminescens. Her har vi detalje en high-throughput screening rørledning, der kombinerer disse rekombinante stammer af mæslinger og Chikungunya virus at isolere bredspektrede antivirale fra kemiske biblioteker.

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fænotypisk analyse til kvantificering af intracellulære mycobakterier tilpasset til screening med højt gennemløb/højt indhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hurtig screening af HIV revers transkriptase og Integrase hæmmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-medieret Electrophoresis (NAME) Indhold Tillader hurtig identifikation af HIV-1 nucleocapsid inhibitorer

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering af en High-throughput Opsætning til screening små molekyler, der modulerer c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi assays for high-throughput screening af Host faktorer involveret i<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion af HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En Fluorescens-baserede lymfocyt Assay Egnet til high-throughput screening af små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System til Effekt og cytotoksicitet Screening af inhibitorer Målretning Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

En høj overførselshastighed Cre-Lox aktiveret Viral membran Fusion analyse for at identificere hæmmere af HIV-1 Viral membran Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...