Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

Wij danken dr. Yves L. Janin voor zijn vruchtbare opmerkingen en suggesties. Wij willen HH Gad bedanken voor CHIK / Ren en C. Combredet voor haar technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Institut Pasteur, het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), het Institut Carnot - Pasteur Maladies infectieuses (Programme STING naar POV en HM- L), de Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, programma STING 2,0 tot POV), en de &quot;Conseil Regional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemische Library Project, subsidies n ° 06-222 I / O en I 09-1739 / R naar HM-L.). Het werk aan CHIKV / Ren werd ondersteund door het project ArbOAS (ANR subsidie ​​2010-INTB-1601-1602).

1. Bereiding van 96-well platen met dochter Verbindingen <ol><li> Beweeg 96-well platen met moeder 10 mM voorraadoplossingen van chemische verbindingen in DMSO van -20 ° C tot kamertemperatuur. Verdun 5x verbindingen in DMSO tot gemiddeld 96-well platen verdunning verkrijgen tegen 2 mM. Verdunning wordt bereikt door pipetteren 5 ul in 20 ul DMSO en mengen. </li><li> Pipet 1 pi van verdunningsplaten in droge putten van wit, met streepjescode weefselkweek 96-well platen. Deze eerste reeks dochterplaten (D1) wordt gebru...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

De screening pijplijn hier beschreven beoogd selecteren verbindingen met een geschikt profiel als breed-spectrum remmers van RNA-virussen. Wanneer een bibliotheek van 10.000 verbindingen werd gescreend met dit protocol en voornoemde filtering criteria zijn toegepast, dwz remming van MV replicatie superieur is aan 75%, 40 verbindingen (0,4%) scoorden positief. Trouwens, ongeveer de helft van hen toonde enkele toxiciteit in de luciferase-gebaseerde levensvatbaarheid assay, en werden buiten beschouwing gelaten om ...

RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor een grote verscheidenheid van menselijke infecties, en hebben een enorme impact op de bevolking wereldwijd, zowel in termen van volksgezondheid en economische kosten. Efficiënte vaccins ontwikkeld tegen verschillende menselijke RNA-virussen en worden veel gebruikt als profylactische behandelingen. Er is echter nog een ern therapeutische middelen tegen RNA virusinfecties. Inderdaad, efficiënte vaccins beschikbaar zijn tegen belangrijke humane pathogenen zoals dengue-virus, hepatitis C-virus of menselijk respiratoir syncytieel virus (HRSV). Trouwens, RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van nieuwe ziekten, die zijn toegenomen in frequentie als gevolg van de wereldwijde uitwisseling en menselijke impact op ecologische systemen. Tegen deze dreiging dat RNA-virussen vertegenwoordigen, onze therapeutische arsenaal is uiterst beperkt en relatief inefficiënt 1-3. Huidige therapieën zijn voornamelijk gebaseerd op recombinant type I interferonen (IFN-α / β) naar aangeboren immuniteit te stimuleren,of de toediening van ribavirine. Hoewel het werkingsmechanisme van deze ribonucleoside analoge controversieel en waarschijnlijk afhankelijk van verschillende mechanismen, de remming van cellulaire IMPDH (inosine monofosfaat dehydrogenase), die intracellulaire GTP zwembaden put, moet uiteraard 4. Ribavirine in combinatie met gepegyleerd IFN-α, is de belangrijkste behandeling tegen hepatitis C-virus. Echter, IFN-α / β en ribavirine behandelingen zijn relatief slechte werkzaamheid in vivo tegen de meeste RNA-virussen doeltreffend stompe IFN-α / β signalering door expressie van virulentiefactoren 5, allemaal vaak ribavirine 3. Dit toegevoegd dat ribavirine opheft belangrijke toxiciteit kwesties, maar onlangs werd aangenomen tegen ernstige ziekte HRSV controversiële voordelen 6. Meer recent zijn een virus-specifieke behandelingen op de markt gebracht, in het bijzonder tegen influenzavirus met de ontwikkelinf neuraminidase remmers 3. Echter, de grote diversiteit en permanente ontstaan ​​van RNA-virussen zich verzet tegen de ontwikkeling van specifieke behandelingen tegen elk van hen in een relatief nabije toekomst. Al met al, dit benadrukt de noodzaak van efficiënte strategieën om krachtige antivirale moleculen in de nabije toekomst te identificeren en te ontwikkelen. Het is triviaal te zeggen dat een breed spectrum remmer werkzaam tegen een groot paneel van RNA-virussen dit zou oplossen. Hoewel een dergelijke molecule is nog steeds de droom van een viroloog&#39;s, ons beter begrip van cellulaire afweermechanismen en aangeboren immuunsysteem suggereren dat sommige mogelijkheden bestaan ​​7,8. Verschillende academische en industriële laboratoria zijn nu op zoek naar moleculen die specifieke facetten van cellulaire afweermechanismen of metabole routes om virale replicatie stomp stimuleren. Hoewel dergelijke verbindingen waarschijnlijk zal tonen significante bijwerkingen, zullen behandelingen tegen acute virale infecties toe te dienened voor een relatief korte tijd, waardoor ze aanvaardbaar ondanks enige mogelijke toxiciteit op lange termijn. Verschillende strategieën zijn ontwikkeld om dergelijke breed-spectrum antivirale moleculen identificeren. Sommige onderzoeksprogramma&#39;s gericht op het vinden van moleculen die specifieke afweer of metabole routes richten. Dit omvat bijvoorbeeld pathogeen herkenning receptoren antivirale genexpressie 9 wekken en op antivirale factoren zoals RNaseL 10, autofagie machines virus afbraak 11 te bevorderen, nucleoside synthesemethoden 12,13 of apoptotische cascades dood van virus-geïnfecteerde cellen precipiteren 14. Andere groepen hebben fenotypische schermen die niet zijn gericht op basis 13,15-17 ontwikkeld. In dat geval zijn antivirale moleculen eenvoudig geïdentificeerd door hun vermogen om virale replicatie te blokkeren in een bepaald cellulair systeem. Algemeen wordt aangenomen dat een verbinding remming 2-3 onafhankelijke RNA-virussen een geschikt profiel voor een breed-sp zouectrum antivirale molecule. Het werkingsmechanisme van hit verbindingen gekozen met dergelijke empirische benadering is alleen bepaald in een tweede tijd en uiteindelijk kan leiden tot de identificatie van nieuwe cellulaire doelwitten voor antivirale middelen. Interessant, een retrospectieve analyse van nieuwe geneesmiddelen door de Amerikaanse Food and Drug Administration goedgekeurd tussen 1999 en 2008 is gebleken dat in het algemeen, zoals fenotypische screenings vaak beter presteren dan-target-based benaderingen van first-in-class kleine synthetische molecules 18 ontdekken . Virale replicatie in high-throughput celgebaseerde proeven wordt meestal bepaald op virus cytopathische effecten. Cellen geïnfecteerd en gekweekt in 96 - of 384-well platen in de aanwezigheid van geteste verbindingen. Na enkele dagen worden cellagen gefixeerd en gekleurd met kleurstoffen zoals kristalviolet. Tenslotte wordt absorptie bepaald met een plaatlezer en verbindingen remmen virale replicatie worden geïdentificeerd door hun vermogen om cellulaire lagen weer behoudenm-virus-geïnduceerde cytopathische effect. Als alternatief zijn viraal-gemedieerde cytopathische effecten beoordeeld met behulp van standaard levensvatbaarheid testen zoals MTS reductie. Dergelijke assays zijn zeer handelbaar en kosteneffectief, maar lijden drie belangrijke beperkingen. Eerste plaats hebben zij een virus-cel kleurcombinatie virale replicatie cytopathische slechts enkele dagen, maar dit is niet altijd mogelijk, en pleiten voor alternatieve benaderingen 19. Ten tweede zijn ze slecht kwantitatieve aangezien zij gebaseerd zijn op een indirecte maat voor virale replicatie. Ten slotte kunnen toxische verbindingen worden als positief geteld hits, en daarom moet worden geëlimineerd met een teller scherm van cellulaire levensvatbaarheid. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben recombinante virussen of replicons gemanipuleerd door reverse genetica reporter eiwitten, zoals EGFP of luciferase expressie, een aanvullende transcriptie-eenheid of in frame met viraal eiwit genen (enkele voorbeelden 20-23). Wanneer deze virussen repliceren reporter proteins worden geproduceerd samen met virale eiwitten zelf. Dit verschaft een kwantitatieve bepaling van virale replicatie te meten en evalueren van de remmende activiteit van kandidaat moleculen. Dit geldt met name voor recombinante virussen luciferase tot expressie brengt (of andere enzymen die in staat bioluminescentie) aangezien deze reporter systeem vertoont een breed dynamisch bereik met een hoge gevoeligheid en vrijwel geen achtergrond. Bovendien is er geen excitatie lichtbron, waardoor wordt voorkomen interferentie met verbinding fluorescentie 24. Hier hebben we detail een high-throughput-protocol om chemische bibliotheken voor een breed-spectrum remmers van RNA-virussen te screenen. Verbindingen worden eerst getest op menselijke cellen geïnfecteerd met een recombinant mazelenvirus (MV) uiten vuurvliegluciferase 25 (rMV2/Luc, figuur 1, primaire scherm). MV behoort tot orde Mononegavirales, en wordt vaak beschouwd als een prototypisch lid van negatieve-streng RNA-viruses. Als zodanig wordt MV genoom als een matrijs door het virale polymerase mRNA-moleculen die coderen voor virale eiwitten synthetiseren. In het recombinante MV stam genaamd rMV2/Luc wordt luciferase-expressie tot expressie van een extra transcriptie-eenheid ingevoegd tussen P en M-genen (Figuur 2A). Daarnaast worden verbindingen getest op hun toxiciteit voor menselijke cellen handel gebruikelijk luciferase gebaseerde reagens die resulteert door ATP kwantificering, het aantal metabolisch actieve cellen in kweek (Figuur 1, primaire screening). Volledige chemische bibliotheken kunnen gemakkelijk worden gescreend met beide assays om verbindingen die niet toxisch en efficiënt blokkeren MV replicatie selecteren. Vervolgens worden bekeken getest op remming dosis-respons van MV replicatie, de afwezigheid van toxiciteit en hun vermogen om Chikungunya virus (CHIKV) replicatie (Figuur 1, tweede scherm) beïnvloeden. CHIKV is een lid van Togaviridae familie en zijn genoom is apOSITIEVE enkelstrengs RNA-molecuul. Als zodanig is het volledig los van mazelen en verbindingen remmen zowel MV en CHIKV staan ​​een grote kans om een ​​groot paneel van RNA-virussen remmen. CHIKV structurele eiwitten worden direct vertaald van het virale genoom, dat structurele eiwitten gecodeerd door transcriptie en translatie van een subgenome mRNA molecuul. De in vitro assay voor replicatie CHIKV is gebaseerd op een recombinante stam genaamd CHIKV / Ren, die Renilla luciferase-enzym tot expressie als een gesplitste deel van de niet-structurele polyproteïne door een insertie van het reportergen tussen nsP3 en NSP4 sequenties 26 (figuur 2B). De mate van Renilla luciferaseactiviteit maakt het monitoren van virale replicatie in een vroeg stadium van CHIKV levenscyclus. Deze high-throughput-protocol werd gebruikt om snel verbindingen te identificeren met een geschikt profiel voor een breed-spectrum antivirale middelen in een commerciële bibliotheek van 10.000 Molecules verrijkt voor chemische diversiteit. Verbindingen werden hoofdzakelijk volgende regel van vijf Lipinski&#39;s, met een molecuulgewicht variërend 250-600 dalton, en hieronder inloggen 5 D waarden. De meeste van deze moleculen waren nieuwe chemische entiteiten die niet beschikbaar zijn in andere commerciële bibliotheken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor grote menselijke ziekten zoals griep, bronchitis, dengue, hepatitis C of mazelen. Zij een nieuwe bedreiging vanwege de toegenomen wereldwijde uitwisseling en menselijke populaties doordringende meer en meer natuurlijke ecosystemen vertegenwoordigen ook. Een goed voorbeeld van een dergelijke nieuwe situatie is chikungunya-virus epidemie van 2005-2006 in de Indische Oceaan. Recente vooruitgangen in ons begrip van cellulaire mechanismen regelen virusreplicatie suggereren dat verbindingen richten gastheercel functies, in plaats van het virus zelf, kan een groot paneel van RNA-virussen remmen. Sommige breed-spectrum antivirale verbindingen zijn geïdentificeerd met gastheer doelgerichte assays. Echter, het meten van de remming van virale replicatie in celkweken middels reductie van cytopathische effecten als uitlezing nog altijd een essentieel screening strategie. Dergelijke functionele testen zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante virussen expressie ca reporter enzymenPablo van bioluminescentie zoals luciferase. In dit rapport, we detail een high-throughput screening pijpleiding, die recombinant mazelen en chikungunya virussen met cellulaire levensvatbaarheid assays combineert, om verbindingen te identificeren met een breed-spectrum antivirale profiel.

Deze screening pijplijn steunt eerst op de selectie van verbindingen die MV replicatie remmen en geen significante cellulaire toxiciteit (Figuur 1, primaire scherm) niet zien. Het maakt gebruik van luciferase-gebaseerde assays om cellulaire toxiciteit en de remming van virale replicatie bepaald. Alle pipetteerstappen en data acquisitie kan worden uitgevoerd in een hoge-doorvoer setting met een robot platform. Cellulaire toxiciteit van verbindingen wordt bepaald met behulp va...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Elektroforese (NAAM) Assay Hiermee kan de snelle identificatie van HIV-1 nucleocapsid Remmers

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in<em&gt; Brucella</em&gt; Infectie van Hela cellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...