Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר איב L. יאנין על הערותיו הפורה והצעות. ברצוננו להודות לHH גד לChik / רן וג Combredet לתמיכה הטכנית שלה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון פסטר, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS), המכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale (INSERM), קרנו Institut - Infectieuses חוליי פסטר (סטינג התכנית לPOV וHM- L), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-RPIB, תכנית סטינג 2.0 לPOV), ואת &quot;Conseil d&#39;האזורי Ile-de-צרפת&quot; (כימי ספריית הפרויקט, מענקי N ° אני 06-222 / R ואני 09-1739 / R כדי HM-L.). העבודה על CHIKV / רן נתמכה על ידי ArbOAS הפרויקט (מענק ANR 2010-INTB-1601-1602).

1. הכנת צלחות בת 96 היטב עם תרכובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז צלחות אם 96 היטב המכילות 10 פתרונות מניות מ&quot;מ של תרכובות כימיות בDMSO מ-20 ° C לטמפרטורת חדר. תרכובות לדלל 5x בDMSO להשיג צלחות דילול 96 היטב ביניים ב2 מ&quot;מ. דילול מושגת על ידי pipetting 5 μl ל20 μl...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

צינור ההקרנה המתואר כאן שואף בבחירת תרכובות עם פרופיל מתאים כמו מעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. כאשר ספרייה של 10,000 תרכובות הוקרן עם פרוטוקול זה וקריטריונים לסינון האמורים יושמו, כלומר עיכוב של שכפול MV מעולה ל75%, 40 תרכובות (0.4%) הבקיע חיובי. חוץ מזה, כמחצית מהם הראתה ...

וירוסי RNA אחראים למגוון רחב של זיהומי אדם, ויש לה השפעה עצומה על אוכלוסייה ברחבי העולם, הוא במונחים של בריאות ציבור ומחיר חסכוני. חיסונים יעילים פותחו נגד מספר וירוסי RNA האנושי, ונמצאים בשימוש נרחב כטיפול מניעתי. עם זאת, עדיין קיים מחסור קריטי של תרופות טיפוליות נגד נגיף RNA. ואכן, חיסונים יעילים אינם זמינים מפני פתוגנים אנושיים גדולים כגון וירוס דנגה, וירוס הצהבת מסוג C או וירוס סינסיציאלי נשימה אנושי (hRSV). חוץ מזה, וירוסי RNA אחראים למרבית מחלות מתפתחות, שגדלו בתדירות בגלל חילופים הגלובליים והשפעת אדם על מערכות אקולוגיות. נגד האיום הזה שמייצגים וירוסי RNA, הארסנל הטיפולי שלנו הוא מאוד מוגבל ולא יעיל יחסית 1-3. טיפולים קיימים למעשה מבוססים על סוג רקומביננטי אני האינטרפרונים (IFN-α / β) כדי לעורר חסינות מולדת,או הממשל של ribavirin. למרות שאופן פעולה של אנלוגי ribonucleoside זה שנוי במחלוקת וכנראה מסתמך על מנגנונים שונים, העיכוב של IMPDH הסלולרית (דהידרוגנז monophosphate inosine), אשר מכלה את בריכות GTP תאיים, הוא באופן ברור חיוני 4. Ribavirin, בשילוב עם IFN-α pegylated, הוא הטיפול העיקרי נגד וירוס הצהבת מסוג C. עם זאת, טיפולי IFN-α / β ו ribavirin הם יעילות נמוכה יחסית בvivo מול מרבית וירוסי RNA כפי שהם IFN-α / β ביעילות הבוטה איתות דרך ביטוי של ארסיות גורמים 5 ולעתים קרובות לברוח ribavirin 3. זה הוסיף לעובדה שטיפול ribavirin הוא העלאת בעיות רעילות חשובות, למרות שזה אושר לאחרונה נגד המחלה hRSV חמורה עם הטבות שנויות במחלוקת 6. לאחרונה, כמה טיפולים ספציפי וירוס כבר משווקים, בפרט כנגד נגיף שפעת עם o הפיתוחמעכבי neuraminidase ו 3. עם זאת, המגוון הגדול והופעתה הקבועה של וירוסי RNA מונע את פיתוח טיפולים ספציפיים נגד כל אחד מהם בעתיד קרוב יחסית. בסך הכל, זה מדגיש את הצורך באסטרטגיות יעילה כדי לזהות ולפתח מולקולות אנטי חזקות בעתיד הקרוב. זה טריוויאלי לומר כי מעכב ספקטרום רחב פעיל נגד פנל גדול של וירוסי RNA הייתי לפתור את הבעיה הזו. למרות שמולקולה כזו היא עדיין החלום של ירולוג, ההבנה טובה יותר שלנו מנגנוני הגנה תאיים ומערכת חיסון מולדת מראה כי כמה אפשרויות קיימות 7,8. מספר מעבדות אקדמיות ותעשייתיות עכשיו מחפשות מולקולות המעוררות היבטים ספציפיים של מנגנוני הגנה תאית או מסלולים מטבוליים כדי להקהות שכפול נגיפי. למרות תרכובות כגון כנראה להראות תופעות לוואי משמעותיים, טיפולים נגד זיהומים נגיפיים אקוטיים יהיו לנהלed לזמן קצר יחסית, מה שהופך אותם מקובלים למרות כמה רעילות פוטנציאלית בטווח הארוך. אסטרטגיות שונות פותחו כדי לזהות מולקולות אנטי ספקטרום רחב כזה. תוכניות מחקר כמה לכוון במציאת מולקולות שיעד מסלולי הגנה או חילוף חומרים ספציפיים. זה כולל, למשל, קולטנים הכרת הפתוגן לעורר ביטוי גנים אנטי 9 ולהפעיל גורמים אנטי כגון 10 RNaseL, מכונות autophagy לקדם השפלה וירוס 11, סינתזת נוקלאוזידים מסלולי 12,13, או מפלים אפופטוטיים כדי לזרז מוות של תאים נגועים בנגיף 14. קבוצות אחרות פיתחו מסכי פנוטיפי שאינם היעד מבוסס 13,15-17. במקרה זה, מולקולות אנטי פשוט זוהו על ידי היכולת שלהם לחסום את השכפול נגיפי במערכת סלולרית נתון. ההנחה הכללית היא שמתחם עיכוב 2-3 וירוסי RNA שאינם קשורים הייתי לו פרופיל מתאים לרחב spectrum מולקולה אנטי. אופן פעולה של תרכובות להיט שנבחרו עם גישה כזו אמפירית נקבע רק בפעם שנייה וסופו של דבר, עלול להוביל לזיהוי של יעדים סלולריים חדשניים לתרופות אנטי. מעניין לציין, כי ניתוח רטרוספקטיבי של תרופות חדשות שאושרו על ידי הרשות האמריקנית למזון והתרופות אמריקניות בין 1999 ו 2008 הראה כי באופן כללי, הקרנות פנוטיפי כאלה נוטים לבצע טובים יותר מאשר גישות המבוסס על יעד כדי לגלות תרופות מולקולה הקטנה הראשון ב-class 18 . שכפול נגיפי במבחנים מבוססי תאי תפוקה גבוהה נקבע בדרך כלל מהשפעות cytopathic וירוס. תאים נגועים ותרבותי ב96 - או צלחות 384 גם בנוכחות של תרכובות שנבדקו. לאחר כמה ימים, שכבות הסלולריות קבועות ומוכתם בצבעים כגון סגול קריסטל. לבסוף, הספיגה נקבעה עם קורא צלחת ותרכובות עיכוב שכפול נגיפי מזוהים על ידי היכולת שלהם לשמר את השכבות סלולריות לכאן ולכאןהשפעת cytopathic מושרה וירוס מ &#39;. לחלופין, השפעות cytopathic באופן ויראלי בתיווכם הוערכו באמצעות מבחני כדאיות סטנדרטיים כגון הפחתת MTS. מבחני כאלה הם צייתנים וחסכוניים מאוד, אך סובלים משלוש מגבלות עיקריות. ראשית, הם דורשים שילוב תאי וירוס שבו שכפול נגיפי הוא cytopathic רק כמה ימים, אבל זה לא תמיד אפשרי, ובכך קורא לאלטרנטיבה גישות 19. שנית, הם גרועים כמותיים משום שהם מבוססים על אמצעי עקיף של שכפול נגיפי. ולבסוף, ניתן הבקיע תרכובות רעילות כלהיטים חיוביים, ולכן יש לבטל עם מסך דלפק מדידת כדאיות סלולרית. כדי להתגבר על חלק ממכשולים אלה, וירוסים או replicons רקומביננטי כבר מהונדסים על ידי גנטיקה הפוכה לבטא חלבוני כתב, כגון EGFP או לוציפראז, מיחידת שעתוק נוספת או במסגרת עם גנים חלבון נגיפיים (כמה דוגמאות הן 20-23). כאשר וירוסים אלה לשכפל, יחסי ציבור כתבoteins מיוצר יחד עם חלבונים נגיפיים עצמם. זה מספק assay מאוד כמותית למדוד שכפול נגיפי ולהעריך את הפעילות המעכבת של מולקולות מועמד. זה נכון במיוחד לוירוסי רקומביננטי להביע לוציפראז (או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור) שכן מערכת הכתב הזה מציגה טווח דינמי רחב עם רגישות גבוהה וכמעט ללא רקע. יתר על כן, אין מקור אור העירור, ובכך למנוע הפרעה לקרינת מתחם 24. הנה, אנחנו פירוט פרוטוקול תפוקה גבוהה מסך ספריות כימיות למעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. תרכובות נבדקו תחילה על תאים אנושיים נגועים בוירוס חצבת רקומביננטי (MV) להביע גחלילית לוציפראז 25 (rMV2/Luc, איור 1, מסך ראשי). MV שייך לMononegavirales סדר, והוא נחשב לעתים קרובות כחבר טיפוסי של נגיף RNA שלילי גדילes. ככזה, הגנום MV משמש כתבנית על ידי פולימראז הנגיפי לסנתז מולקולות mRNA קידוד לחלבונים נגיפיים. בזן MV רקומביננטי הנקרא rMV2/Luc, ביטוי לוציפראז בא לידי ביטוי מיחידת שעתוק נוסף מוכנסת בין P וגני M (איור 2 א). במקביל, תרכובות נבדקו לרעילות שלהם על תאים אנושיים באמצעות מגיב מבוסס לוציפראז מסחרי שמעריך, על ידי כימות ATP, מספר התאים הפעילים מטבולית בתרבות (איור 1, מסך ראשי). ספריות כימיות כולו יכולות להיות מוקרנת בקלות עם שני מבחני הללו על מנת לבחור תרכובות שאינן רעילים וביעילות לחסום שכפול MV. ואז, להיטים נבדקים מחדש לעיכוב מנת תגובה של שכפול MV, חוסר הרעילות, כמו גם ליכולת שלהם לפגוע בשכפול נגיף Chikungunya (CHIKV) (איור 1, מסך משני). CHIKV הוא חבר של משפחה של Togaviridae והגנום שלו הוא apמולקולת RNA חד גדיל ositive. ככזה, זה לגמרי לא קשורים לחצבת ותרכובות מעכבות גם MV וCHIKV סיכוי גדול לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. חלבוני nonstructural CHIKV מתורגמים ישירות מהגנום הנגיפי, ואילו חלבונים מבניים מקודדים על ידי שעתוק ותרגום של מולקולת mRNA subgenomic. assay השכפול שלנו במבחנה לCHIKV מבוסס על זן רקומביננטי הנקרא CHIKV / רן, המבטא אנזים לוציפראז Renilla כחלק ביקע של polyprotein nonstructural באמצעות החדרת גן הכתב בין nsP3 ורצפי nsP4 26 (איור 2). המדד לפעילות לוציפראז Renilla מאפשר הניטור של שכפול נגיפי בשלב המוקדם של מחזור החיים CHIKV. פרוטוקול תפוקה גבוהה זה שימש כדי לזהות במהירות תרכובות עם פרופיל מתאים לantivirals ספקטרום רחב בספרייה מסחרית של 10,000 Molecules מועשר לגיוון כימי. תרכובות בעצם עקבו אחרי השלטון של חמש של יפינסקי, עם משקולות מולקולריות הנעות 250-600 daltons, והיכנסו ערכי D מתחת ל -5. רוב המולקולות אלה היו גופים כימיים חדשים אינו זמינים בספריות מסחריות אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

וירוסי RNA אחראים למחלות עיקריות אדם כגון שפעת, ברונכיטיס, דנגה, הפטיטיס C או חצבת. הם גם מייצגים איום מתעורר בגלל חילופים מוגברים ברחבי העולם ואוכלוסיות אנושיות החודרים מערכות אקולוגיות טבעיות יותר ויותר. דוגמא טובה למצב כזה מתעורר היא מגיפות וירוסים chikungunya של 2005-2006 באוקיינוס ​​ההודי. התקדמות של אחרונות בהבנה של מסלולים הסלולר שליטה שכפול נגיפי שלנו מראה כי תרכובות מיקוד פונקציות תא מארחות, ולא את הנגיף עצמו, יכולים לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. תרכובות אנטי כמה ספקטרום רחב זוהו עם מבחני מוכוון יעד מארח. עם זאת, מדידת העיכוב בשכפול נגיף בתרביות תאים באמצעות הפחתת השפעות cytopathic כקריאת נתונים עדיין מייצגת אסטרטגית הקרנה בעל חשיבות עליונה. מסכי פונקציונליים כגון שופרו באופן משמעותי על ידי הפיתוח של וירוסי רקומביננטי להביע כתב אנזימי capable של פליטת אור כגון לוציפראז. בדו&quot;ח הנוכחי, אנחנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה, המשלב חצבת רקומביננטי ווירוסים chikungunya עם מבחני כדאיות סלולרית, כדי לזהות תרכובות עם פרופיל אנטי ספקטרום רחב.

צינור הקרנה זו נסמך ראשון על הבחירה של תרכובות המעכבות שכפול MV ולא מראה שום רעילות סלולרית משמעותית (איור 1, מסך ראשי). זה לוקח את יתרון של מבחני מבוססי לוציפראז כדי לקבוע רעילות סלולרית והעיכוב בשכפול נגיף. כל רכישת צעדי pipetting והנתונים יכולה להתבצע בהגדרת תפו...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...