Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

Ringraziamo il Dott. Yves L. Janin per i suoi commenti e suggerimenti fecondi. Vorremmo ringraziare HH Gad per CHIK / Ren e C. Combredet per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Institut Pasteur, il Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), l&#39;Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), l&#39;Institut Carnot - Pasteur Maladies infectieuses (Programma STING a POV e HM- L), l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programma STING 2.0 a POV), e il &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Biblioteca Chemical progetto, borse di studio n ° I 06-222 / R e I 09-1739 / R per HM-L.). Il lavoro sulla CHIKV / Ren è stato supportato dagli ArbOAS progetto (ANR sovvenzione 2010-INTB-1601-1602).

1. Preparazione di 96 pozzetti Piastre figlia con composti <ol><li> Spostare piastre madri a 96 pozzetti contenenti 10 mM soluzioni madre di composti chimici in DMSO da -20 ° C a temperatura ambiente. Diluire composti 5x in DMSO per ottenere piastre di diluizione a 96 pozzetti intermedi a 2 mm. Diluizione si ottiene pipettando 5 ml in 20 ml di DMSO e miscelazione. </li><li> Dispensare 1 ml di piastre di diluizione nei pozzetti secchi di bianco, coltura tissutale con codice a barre piastre da 96 pozzetti. Questa prima...

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La pipeline di screening qui descritto mira a selezionare i composti con un profilo adatto come inibitori ampio spettro di virus a RNA. Quando una libreria di 10.000 composti è stato proiettato con questo protocollo e sono stati applicati criteri di filtraggio di cui sopra, cioè l&#39;inibizione della replicazione MV superiore al 75%, 40 composti (0,4%) ha ottenuto positive. Inoltre, circa la metà di loro ha mostrato una certa tossicità nel saggio di redditività basati luciferasi, e sono state disattese pe...

Virus a RNA sono responsabili di una grande varietà di infezioni umane, e hanno un enorme impatto sulle popolazioni di tutto il mondo, sia in termini di salute pubblica e di costo economico. Vaccini efficaci sono stati sviluppati contro diversi virus a RNA umano, e sono ampiamente utilizzati come trattamenti profilattici. Tuttavia, vi è ancora una mancanza critica di farmaci terapeutici contro infezioni da virus RNA. Infatti, i vaccini non sono disponibili efficaci contro i principali agenti patogeni umani, come il virus della dengue, il virus dell&#39;epatite C o da virus sinciziale respiratorio umano (HRSV). Inoltre, i virus a RNA sono responsabili per la maggior parte delle patologie emergenti, che sono aumentate in frequenza a causa degli scambi globali e l&#39;impatto umano sui sistemi ecologici. Contro questa minaccia che rappresentano i virus a RNA, il nostro arsenale terapeutico è estremamente limitato e relativamente inefficiente 1-3. Terapie attuali si basano essenzialmente sul tipo ricombinante I interferoni (IFN-α / β) per stimolare l&#39;immunità innata,o la somministrazione di ribavirina. Sebbene il meccanismo di azione di questo analogico ribonucleoside è controversa e probabilmente si basa su vari meccanismi, l&#39;inibizione di IMPDH cellulare (inosina monofosfato deidrogenasi), che esaurisce piscine GTP intracellulare, è chiaramente essenziale 4. Ribavirina, in combinazione con Interferone-α, è il principale trattamento contro il virus dell&#39;epatite C. Tuttavia, i trattamenti IFN-α / β e ribavirina sono relativamente scarsa efficacia in vivo contro la maggior parte dei virus a RNA come efficiente smussato IFN-α / β segnalazione attraverso l&#39;espressione dei fattori di virulenza 5 e spesso sfuggire ribavirina 3. Questo aggiunto al fatto che il trattamento ribavirina sta sollevando importanti problemi di tossicità, anche se è stato recentemente approvato contro la malattia HRSV grave con benefici controversi 6. Più recentemente, alcuni trattamenti specifici per il virus sono stati commercializzati, in particolare contro il virus dell&#39;influenza, con l&#39;o sviluppof inibitori della neuraminidasi 3. Tuttavia, la grande diversità ed emergere permanente dei virus RNA preclude lo sviluppo di trattamenti specifici contro ciascuno di essi in un futuro relativamente vicino. Complessivamente, questo sottolinea la necessità di strategie efficaci per identificare e sviluppare molecole antivirali potenti nel prossimo futuro. È banale dire che un inibitore di ampio spettro attivo contro un grande pannello di virus a RNA possa risolvere questo problema. Anche se una tale molecola è ancora il sogno di un virologo, la nostra migliore comprensione dei meccanismi di difesa cellulari e sistema immunitario innato suggeriscono che alcune possibilità esistono 7,8. Diversi laboratori accademici e industriali sono ora alla ricerca di molecole che stimolano aspetti specifici dei meccanismi di difesa cellulare o vie metaboliche per smussare la replicazione virale. Sebbene tali composti probabilmente mostrerà significativi effetti collaterali, i trattamenti contro le infezioni virali acute saranno amministrareED per un tempo relativamente breve, rendendoli accettabili nonostante una certa tossicità potenziale sul lungo termine. Varie strategie sono state sviluppate per identificare tali ampio spettro molecole antivirali. Alcuni programmi di ricerca mirano a trovare le molecole che colpiscono specifiche vie di difesa o metaboliche. Questo include, per esempio, recettori di riconoscimento patogeno per suscitare l&#39;espressione genica antivirale 9 e attivare fattori antivirali come RNASEL 10, macchine autofagia promuovere degradazione virus 11, sintesi nucleoside percorsi guidati 12,13, o cascate apoptotiche per precipitare morte delle cellule infettate da virus 14. Altri gruppi hanno sviluppato schermi fenotipiche che non sono a target basati 13,15-17. In tal caso, le molecole antivirali sono semplicemente identificati dalla loro capacità di bloccare la replicazione virale in un dato sistema cellulare. Il presupposto generale è che un composto inibente 2-3 RNA virus non correlati avrebbe un profilo adeguato ad ampio spectrum molecola antivirale. La modalità di azione di composti hit selezionate con un approccio empirico è determinato solo in un secondo tempo e, infine, può portare alla identificazione di nuovi bersagli cellulari per antivirali. È interessante notare, un&#39;analisi retrospettiva di nuovi farmaci approvati dalla US Food and Drug Administration tra il 1999 e il 2008 ha mostrato che, in generale, tali proiezioni fenotipici tendono a rendere meglio rispetto agli approcci di obiettivi di scoprire prima-in-class piccole molecole farmacologiche 18 . Replicazione virale in saggi cellulari high-throughput è di solito determinata da virus effetto citopatico. Le cellule sono infettate e coltivate in 96 - o 384 pozzetti in presenza di composti testati. Dopo alcuni giorni, strati cellulari vengono fissate e colorate con coloranti come cristallo violetto. Infine, l&#39;assorbanza è determinato con un lettore di piastre e composti che inibiscono la replicazione virale sono identificati per la loro capacità di conservare i livelli cellulari from indotta da virus effetto citopatico. In alternativa, effetto citopatico virale-mediate sono valutate con test di vitalità standard come la riduzione MTS. Tali saggi sono molto trattabili e conveniente, ma soffrono di tre importanti limitazioni. In primo luogo, essi richiedono una combinazione virus-cellula in cui la replicazione virale è citopatico in soli pochi giorni, ma questo non è sempre possibile, mettendo così per le strategie alternative 19. In secondo luogo, essi sono scarsamente quantitativa poiché si basano su una misura indiretta della replicazione virale. Infine, composti tossici possono essere segnati come risultati positivi, e quindi devono essere eliminate con uno schermo contatore che misura la vitalità cellulare. Per superare alcuni di questi ostacoli, virus ricombinanti o repliconi sono stati progettati dai genetica inversa per esprimere proteine ​​reporter, come EGFP o luciferasi, da una unità di trascrizione aggiuntivo o in frame con geni delle proteine ​​virali (alcuni esempi sono 20-23). Quando questi virus si replicano, giornalista proteins sono prodotte con proteine ​​virali stessi. Questo fornisce un saggio molto quantitativa per misurare la replicazione virale e valutare l&#39;attività inibitoria di molecole candidate. Ciò è particolarmente vero per i virus ricombinanti esprimenti luciferasi (o altri enzimi in grado di bioluminescenza) poiché questo sistema giornalista presenta una vasta gamma dinamica con elevata sensibilità e praticamente senza sfondo. Inoltre, non vi è alcuna fonte di luce di eccitazione, evitando interferenze con il composto fluorescenza 24. Qui, i dettagli di un protocollo high-throughput di vagliare librerie chimiche per gli inibitori ampio spettro di virus a RNA. I composti vengono testati prima su cellule umane infettate con un virus ricombinante morbillo (MV) che esprimono luciferasi di lucciola 25 (rMV2/Luc, Figura 1, schermo primario). MV appartiene a Mononegavirales ordine, ed è spesso considerato come un membro prototipo del virus RNA negativo-strandes. Come tale, MV genoma è utilizzato come modello per la polimerasi virale per sintetizzare molecole di mRNA che codificano per proteine ​​virali. Nel ceppo ricombinante MV chiamato rMV2/Luc, espressione della luciferasi è espressa da una unità di trascrizione aggiuntivo inserito tra P e geni M (Figura 2A). In parallelo, i composti vengono testati per la loro tossicità su cellule umane usando un reagente a base di luciferasi commerciale che valuta, quantificando ATP, il numero di cellule metabolicamente attive in coltura (figura 1, schermo primario). Librerie chimiche interi possono essere facilmente sottoposti a screening con questi due saggi per selezionare composti che non sono tossici e bloccano efficientemente replica MV. Poi, risultati sono riesaminati per l&#39;inibizione dose-risposta di replica MV, la mancanza di tossicità e per la loro capacità di alterare virus Chikungunya (CHIKV) replica (Figura 1, schermo secondario). CHIKV è un membro della famiglia Togaviridae e il suo genoma è apositive molecola a singolo filamento di RNA. Come tale, essa è del tutto estraneo a morbillo e composti che inibiscono sia MV e CHIKV levano in piedi una grande occasione per inibire un grande pannello di virus a RNA. Proteine ​​non strutturali CHIKV sono direttamente tradotti dal genoma virale, mentre le proteine ​​strutturali sono codificati mediante trascrizione e la traduzione di una molecola di mRNA subgenomico. La nostra replica saggio in vitro per CHIKV si basa su un ceppo ricombinante chiamato CHIKV / Ren, che esprime Renilla luciferasi come parte spaccati della poliproteina nonstructural attraverso un inserimento del gene reporter tra nsP3 e sequenze NSP4 26 (Figura 2B). La misura dell&#39;attività di luciferasi Renilla consente il monitoraggio della replicazione virale nella fase iniziale del ciclo di vita CHIKV. Questo protocollo ad alta produttività è stato usato per identificare rapidamente composti con un profilo adatto antivirali ad ampio spettro in una libreria commerciale di 10.000 molecduli arricchito di diversità chimica. I composti sono stati essenzialmente seguendo la regola di Lipinski di cinque, con un peso molecolare compreso 250-600 dalton, e registrare i valori D inferiore a 5. Maggior parte di queste molecole erano nuove entità chimiche non disponibili in altre biblioteche commerciali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

Virus a RNA sono responsabili di gravi malattie umane come l&#39;influenza, bronchite, dengue, epatite C o il morbillo. Essi rappresentano anche una minaccia emergente a causa di un aumento degli scambi mondiali e le popolazioni umane che penetrano sempre più ecosistemi naturali. Un buon esempio di tale situazione emergente è epidemie di virus chikungunya del 2005-2006 nell&#39;Oceano Indiano. I recenti progressi nella nostra comprensione delle vie cellulari che controllano la replicazione virale suggeriscono che i composti di targeting funzioni della cellula ospite, piuttosto che il virus stesso, potrebbe inibire un grande pannello di virus a RNA. Alcuni composti antivirali ad ampio spettro sono stati identificati con ospite analisi mirate. Tuttavia, misurando l&#39;inibizione della replicazione virale in colture cellulari con riduzione degli effetti citopatici come visualizzatore ancora rappresenta una strategia di screening fondamentale. Tali schermi funzionali sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus ricombinanti che esprimono giornalista enzimi capable della bioluminescenza come la luciferasi. Nella presente relazione, abbiamo dettaglio un gasdotto high-throughput screening, che combina il morbillo ricombinanti e virus chikungunya, con saggi di vitalità cellulare, per identificare i composti con un profilo antivirale ad ampio spettro.

Questo gasdotto di screening si basa in primo luogo sulla selezione dei composti che inibiscono la replicazione MV e non mostra alcuna tossicità cellulare significativa (Figura 1, schermo primario). Sfrutta saggi basati luciferasi per determinare la tossicità cellulare e l&#39;inibizione della replicazione virale. Tutte le fasi di pipettamento e acquisizione dati può essere eseguita in un ambiente ad alta produttività con una piattaforma robotica. Tossicità cellulare de...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Un High-throughput Cre-Lox attivato membrana virale Fusion test per identificare gli inibitori di fusione della membrana virale di HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...