Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
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우리는 그의 결실의 의견과 제안 박사 이브 L. JANIN 감사합니다. 우리는 그녀의 기술 지원을 CHIK / 랜 C. Combredet에 HH 갓에게 감사의 말씀을 전합니다. 파스퇴르 만성 질환 Infectieuses (POV에 프로그램의 STING 및 HM--이 작품은 파스퇴르 연구소, 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique (CNRS), 문화원 국립 드 라 상테 동부 표준시 드 라 공들인 Médicale (INSERM), 문화원 카르노에 의해 지원되었다 L), 직원은 국립 라 공들인 POV에 (ANR-RPIB, 프로그램 STING 2.0), 그리고 &quot;헌법위원회 지역 일 드 프랑스&quot;(화학 도서관 프로젝트를 부어, 보조금은 N I 06-222 / R을 ° 및 I HM-L에 09-1739는 / R.). CHIKV / 르네의 작품은 프로젝트 ArbOAS에 의해 지원되었다 (ANR 보조금 2010 INTB - 1601-02).

화합물과 96 웰의 딸 플레이트 1. 준비 <ol><li> 실내 온도 -20 ° C에서 DMSO 화학 화합물의 10 mM의 주식 솔루션을 포함하는 96 - 웰 어머니 플레이트를 이동합니다. 희석 화합물은 2 ㎜에서 중간 96 - 웰 희석 판을 얻​​기 위해 DMSO에 5 배. 희석은 DMSO 20 ㎕로 5 μl를 피펫과 혼합하여 얻을 수있다. </li><li> 피펫 흰색, 바코드 조직 문화 96 - 웰 플레이트의 마른 우물에 희석 플레이트에서 1 μL. 보조 플레이트 ...

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여기에서 설명하는 심사 파이프 라인은 RNA 바이러스의 광범위한 스펙트럼 억제제로서 적절한 프로필과 화합물을 선택 목표로하고있다. 10,000 화합물의 라이브러리가이 프로토콜 및 상기 필터링 기준이 적용된 함께 상영되었을 때, 75 %, 40 화합물 (0.4 %)으로 우수한 MV 복제 즉, 억제는 긍정적 인 기록했다. 게다가, 이들 중 절반은 루시페라아제 기반 생존력 분석에서 어떤 독성을 보였으며, 이...

RNA 바이러스는 인간 감염의 큰 다양성에 대한 책임이 있으며, 공공의 건강과 경제적 비용의 측면에서 전 세계적으로 인구에 큰 영향을 미친다. 효과적인 백신은 여러 가지 인간의 RNA 바이러스에 대해 개발되어 널리 예방 치료로 사용됩니다. 그러나 RNA 바이러스 감염에 대한 치료 약물의 중요한 부족은 여전히​​있다. 사실, 효율적인 백신은 뎅 그열 바이러스, C 형 간염 바이러스 또는 인간의 호흡기 세포 융합 바이러스 (hRSV) 등 주요 인간의 병원체에 대해 사용할 수 없습니다. 게다가, RNA 바이러스로 인해 글로벌 교류와 생태계에 대한 인간의 영향의 빈도가 증가하고 새로운 질병의 대부분에 대한 책임이 있습니다. RNA 바이러스를 나타내는이 위협에 대해, 우리의 치료 아스날은 매우 제한적이며 1-3 상대적으로 비효율적이다. 현재 치료는 본질적으로, 선천성 면역을 자극하는 재조합 I 형 인터페론 (IFN-α / β)를 기반으로또는 리바비린의 관리. 이 리보 아날로그의 작용 모드가 논란이 아마 다양한 메커니즘에 의존하고 있지만, 세포 내 GTP 풀을 고갈 휴대 IMPDH (이노신 인산 탈수소 효소)의 억제, 4 명확 필수적이다. 리바비린은 페 길화 된 IFN-α와 결합, C 형 간염 바이러스에 대한 주요 치료입니다. 그들이 효율적으로 무딘 IFN-α / β는 5 요인 독성의 발현을 통해 신호 종종 리바비린 3 탈출 그러나, IFN-α / β와 리바비린 치료는 대부분의 RNA 바이러스에 대한 생체 내에서 상대적으로 가난한 효능이다. 가 최근 논란이 혜택을 6 심각한 hRSV 질환에 대해 승인을 받았다하더라도 이것은, 리바비린 치료가 중요한 독성 문제를 제기한다는 사실에 추가됩니다. 최근에, 일부 바이러스 특정 치료법 개발 O와 인플루엔자 바이러스, 특히, 시판 된F 뉴 라미니다 아제 억제제 3. 그러나, 큰 다양성과 RNA 바이러스의 영구 출현은 상대적으로 가까운 미래에 그들의 각 하나에 대한 특정 치료법의 개발을 배제한다. 합해서, 이는 가까운 미래에 강력한 항 바이러스 분자를 확인하고 개발하는 효율적인 전략에 대한 필요성을 강조한다. 그것은 RNA 바이러스의 대형 패널에 대한 활성 광범위한 스펙트럼 억제제는이 문제를 해결하는 것이 말을 간단하다. 이러한 분자가 여전히 바이러스 학자의 꿈이지만, 세포 방어 메커니즘 및 선천성 면역 체계의 우리의 더 나은 이해는 몇 가지 가능성이 7,8 존재하는 것이 좋습니다. 여러 학문과 산업 연구소는 지금 세포 방어 메커니즘이나 바이러스 복제를 무디게하는 대사 경로의 특정 측면을 자극 분자를 찾고 있습니다. 이러한 화합물은 아마도 상당한 부작용을 보여줍니다 있지만, 급성 바이러스 감염에 대한 치료 관리하기 될 것이다장기에 대한 몇 가지 잠재적 인 독성에도 불구하고 그들을 허용하고, 비교적 짧은 시간에 에드. 다양한 전략은 광범위 항 바이러스 분자를 식별하기 위해 개발되었다. 일부 연구 프로그램은 특정 방어 나 대사 경로를 표적 분자를 발견을 목표로한다. 여기에는, 예를 들면, 바이러스 유전자 발현 구를 유도하고 RNaseL 10, 바이러스 저하 11을 촉진하기에 autophagy 기계와 같은 항 바이러스 요소를 활성화하는 병원체 인식 수용체는, 뉴 클레오 시드의 합성은 바이러스에 감염된 세포의 죽음을 침전 12,13 또는 사멸 캐스케이드 경로 14. 다른 그룹 13,15-17 목표를 기반으로하지 않는 표현형 스크린을 개발했습니다. 그 경우, 바이러스 분자는 단순히 관련 셀룰러 시스템에서 바이러스 복제를 차단하는 그들의 능력에 의해 식별된다. 일반 가정은 2-3 관련이없는 RNA 바이러스를 억제하는 화합물은 광범위한 SP에 적합한 프로필을 것입니다항 바이러스 분자를 ectrum. 이러한 경험적인 접근 방식을 선택 히트 화합물의 작용 모드는 두 번째 시간에 결정되고, 결국, 항 바이러스제에 대한 새로운 표적 세포의 식별로 이어질 수 있습니다. 흥미롭게도, 1999 년과 2008 년 사이 미국 식품 의약청의 승인 신약의 회고 분석은 일반적으로, 표현형 검사는 첫 번째 수준의 작은 분자 약물 (18)를 발견하는 목표 기반의 방법보다 더 나은을 수행하는 경향이있는 것으로 나타났습니다 . 높은 처리량 세포 기반 분석에서 바이러스 복제는 일반적으로 바이러스가 세포 변성 효과에서 결정된다. 세포는 감염 배양 96에 - 또는 시험 화합물의 존재 384 - 웰 플레이트. 몇 일 후, 세포의 층을 고정하고 크리스탈 바이올렛 등의 염료로 염색. 마지막으로 흡광도는 플레이트 판독기 및 바이러스 복제를 억제하는 화합물이 앞뒤로 세포 층을 보존하는 그들의 능력에 의해 확인되어 결정된다m 바이러스 - 유도 세포 변성 효과. 또한, 바이러스 성 매개 세포 변성 효과는 이러한 MTS 감소와 같은 표준 생존 분석을 사용하여 평가됩니다. 이러한 분석은 매우 온순하고 비용 효과가 있지만, 세 가지 주요 제한의 고통. 첫째, 그들은 따라서 19에 근접 대안을 호출, 바이러스 복제는 몇 일에 세포 변성하지만이 항상 가능한 것은 아니다 바이러스 세포의 조합을 필요로한다. 둘째, 그들은 바이러스 복제의 간접적 인 측정에 기초하고 있기 때문에 저조한 정량적이다. 마지막으로, 독성 화합물은 포지티브 히트로서 획득 될 수 있고, 따라서 세포 생존 능력을 측정하는 카운터 스크린으로 제거되어야한다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 재조합 바이러스 나 플리는 추가 전사 단위 또는 바이러스 단백질 유전자 (몇 가지 예는 20 ~ 23입니다) 프레임에, 같은 EGFP 또는 루시 페라 제 등의 리포터 단백질을 표현하는 역 유전학에 의해 설계되었다. 이 바이러스는 복제, 기자 홍보oteins는 바이러스 단백질 자체와 함께 생산된다. 이 바이러스 복제를 측정하고 후보 분자의 억제 활성을 평가하기 매우 정량적 분석을 제공한다. 이것은이 기자 시스템은 높은 감도와 거의없이 배경으로 넓은 동적 범위를 전시 이후 루시 페라 제 (또는 생물 발광 할 수있는 다른 효소)를 발현하는 재조합 바이러스에 특히 사실이다. 한층 더 여기 광원 따라서 형광 화합물 (24)과의 간섭을 방지 없다. 여기, 우리 세부 높은 처리량 프로토콜은 RNA 바이러스의 광범위한 스펙트럼 억제제 화학 라이브러리를 화면으로. 화합물은 반딧불 루시 페라 제 25 (rMV2/Luc, 그림 1, 기본 화면)를 발현하는 재조합 홍역 바이러스 (MV)에 감염된 인간의 세포에서 먼저 테스트됩니다. MV는 주문을 Mononegavirales에 속하고 종종 부정적인 가닥 RNA 바이러스의 프로토 타입 멤버로 간주됩니다에스. 이와 같이, MV 게놈은 바이러스 성 단백질을 코딩하는 mRNA의 분자를 합성하는 바이러스 중합 효소에 의해 주형으로 사용된다. rMV2/Luc라는 재조합 MV 변형에서 루시 페라 제 표현은 P와 M 유전자 (그림 2A) 사이에 삽입 추가 전사 단위에서 표현된다. 병렬로, 화합물 ATP 정량화하여 평가하는 상업 루시 페라 기반의 시약을 사용하여 인간의 세포에 자신의 독성 시험, 문화의 대사 활성 세포의 수 (그림 1, 기본 화면). 전체 화학 라이브러리는 용이하지 않은 독성 및 MV 효율적 복제를 차단하는 화합물을 선택하기 위해 이들 두 분석으로 스크리닝 할 수있다. 그리고, 히트는 Chikungunya의 바이러스 (CHIKV) 복제 (도 1, 보조 화면) 저해하는 그들의 능력에 대한 용량 - 반응 MV ​​복제의 억제, 독성의 결여 등을 위해 다시 테스트된다. CHIKV는 Togaviridae 가족의 일원이며 게놈은 AP 통신ositive 단일 가닥 RNA 분자. 따라서, 그것은 홍역 MV와 CHIKV 모두 RNA 바이러스의 대형 패널을 억제 할 수있는 좋은 기회가 억제 화합물에 전혀 관계가없는 것입니다. 구조 단백질이 전사 및 subgenomic의 mRNA 분자의 번역에 의해 인코딩되는 반면 CHIKV 비 구조 단백질은 직접 바이러스 게놈에서 변환됩니다. CHIKV에 대한 우리의 체외 복제 분석은 nsP3 및 NSP4 시퀀스 26 (그림 2B) 사이의 리포터 유전자의 삽입을 통해 비 구조적 폴리 단백질의 절단 된 부분으로 레 닐라 루시퍼 라 아제 효소를 표현 CHIKV / 르네라는 재조합 균주를 기반으로합니다. 레 닐라 루시퍼 라제 활성의 척도 CHIKV 생활주기의 초기 단계에서 바이러스 복제의 모니터링을 허용한다. 이것은 높은 처리량 프로토콜은 빠르게 만 molec의 상용 라이브러리 광범위 항 바이러스제에 대한 적합한 프로파일 갖는 화합물을 식별하는 데 사용되었다ules 화학 다양성이 풍부한. 화합물은 기본적으로 250에서 600 달톤에 이르는 분자량, 다섯 리핀 스키의 규칙에 따라, 5 이하 D 값을 기록했다.이 분자의 대부분은 다른 상용 라이브러리에서 사용할 수없는 새로운 화학 엔티티했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA 바이러스는 독감, 기관지염, 뎅 그열, C 형 간염 또는 홍역과 같은 주요 인간의 질병에 대한 책임이 있습니다. 그들은 또한 때문에 점점 더 많은 자연 생태계를 관통 증가 세계적 교류와 인간의 인구의 신흥 위협을 나타냅니다. 이러한 새로운 상황의 좋은 예는 인도양 2005에서 2006 사이의 Chikungunya의 바이러스 전염병이다. 바이러스 복제를 제어하는​​ 세포 경로에 대한 우리의 이해의 최근 진행되는 호스트 세포의 기능을 대상 화합물은, 오히려 바이러스 자체보다, RNA 바이러스의 대형 패널을 억제 할 수있는 것이 좋습니다. 일부 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 화합물은 호스트 목표 지향적 인 분석으로 확인되었습니다. 그러나, 세포 배양에 바이러스 복제의 억제를 측정하는 것은 판독으로 세포 변성 효과의 감소를 사용하는 것은 여전히​​ 가장 중요한 검사 방법을 나타낸다. 이러한 기능적인 스크린에는 크게 리포터를 발현하는 재조합 바이러스의 개발에 의해 개선 된 주 효소이러한 루시퍼 같은 생물 발광의 pable. 본 보고서에서는 세부 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 프로필과 화합물을 식별하기 위해, 재조합 홍역 및 세포 생존 능력의 분석과 Chikungunya의 바이러스를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을,.

이 검사 파이프 라인은 MV 복제를 억제하는 화합물의 선택에 첫 의존하고 중요한 세포 독성 (그림 1, 기본 화면)을 표시하지 않습니다. 그것은 세포 독성과 바이러스 복제 억제를 결정하는 루시 페라 기반의 분석을 활용합니다. 모든 피펫 팅 단계 및 데이터 수집은 로봇 플랫폼 높은 처리량 설정에서 수행 될 수있다. 화합물의 세포 독성은 대사 활성 셀에 대응하는...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

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변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...