Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

Vi takker Dr. Yves L. Janin for hans fruktbare kommentarer og forslag. Vi vil gjerne takke HH Gad for Chik / Ren og C. Combredet for hennes teknisk support. Dette arbeidet ble støttet av Institut Pasteur, den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM), Institut Carnot - Pasteur sykdommer Infectieuses (Programme STING til POV og HM- L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programme STING 2,0 til POV), og &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemical bibliotekprosjektet, tilskudd n ° jeg 06-222 / R og jeg 09-1739 / R til HM-L.). Arbeidet med CHIKV / Ren ble støttet av prosjekt ArbOAS (ANR stipend 2010-INTB-1601-1602).

En. Utarbeidelse av 96-brønns Daughter Plater med forbindelser <ol><li> Beveg 96-brønners plater inneholdende moder 10 mM stamløsninger av kjemiske forbindelser i DMSO fra -20 ° C til romtemperatur. Fortynn forbindelser 5 ganger i DMSO for å oppnå mellomliggende 96-brønners plater ved fortynning 2 mM. Fortynning er oppnådd ved å pipettere 5 pl til 20 pl DMSO og blanding. </li><li> Pipetter 1 mL fra fortynning plater til tørre brønner av hvitt, bar-kodet vevskulturstudier 96-brønners plater. Det første set...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

Den screening rørledning beskrevet her tar sikte på å velge forbindelser med en egnet profil som bredspektret hemmere av RNA-virus. Når et bibliotek på 10.000 forbindelser ble screenet med denne protokollen og nevnte filtreringskriterier ble benyttet, dvs. hemming av MV replikering overlegen til 75%, 40 forbindelser (0,4%) scoret positive. Dessuten, om lag halvparten av dem viste noen toksisitet i luciferase-basert levedyktighet analysen, og ble ignorert av den grunn. Til slutt ble det et dusin av treff le...

RNA-virus er ansvarlig for et stort utvalg av menneskelige infeksjoner, og har en stor innvirkning på bestander over hele verden både når det gjelder folkehelse og økonomisk kostnad. Effektive vaksiner er blitt utviklet mot flere human RNA-virus, og er mye brukt som profylaktiske behandlinger. Det er imidlertid fremdeles en kritisk mangel på terapeutiske midler mot RNA virus infeksjoner. Faktisk, effektive vaksiner ikke er tilgjengelige mot humane patogener som dengue-virus, hepatitt C-virus eller humant respiratorisk syncytielt virus (HRSV). Dessuten RNA virus er ansvarlig for et flertall av nye sykdommer, som har økt i frekvens på grunn av globale børser og menneskelig påvirkning på økologiske systemer. Mot denne trusselen som representerer RNA virus, er vår terapeutiske arsenal ekstremt begrenset og relativt ineffektiv 1-3. Nåværende behandlingsformer er i hovedsak basert på rekombinant type I interferoner (IFN-α / β) for å stimulere medfødt immunitet,eller behandling med ribavirin. Selv om modusen for handling av denne ribonukleosid analog er kontroversielt og sannsynligvis er avhengig av ulike mekanismer, hemming av celle IMPDH (inosinmonofosfatdehydrogenase), som utarmer intracellulære GTP, er helt klart avgjørende fire. Ribavirin, i kombinasjon med pegylert IFN-α, er hoved behandling mot Hepatitt C-virus. Men, IFN-α / β og ribavirin behandlinger er av relativt dårlig effekt in vivo mot de fleste RNA-virus som de effektivt sløv IFN-α / β signalering gjennom uttrykk for virulens faktorer fem og ofte flykte ribavirin tre. Dette tilsettes til det faktum at ribavirin er å skaffe viktige toksisitetsproblemer, selv om det ble nylig godkjent mot HRSV alvorlig sykdom med kontroversielle fordeler 6.. I den senere tid har enkelte virus-spesifikke behandlinger blitt markedsført, i særdeleshet mot influensavirus med utviklingen of neuraminidasehemmere tre. Imidlertid, den store mangfold og permanent veksten av RNA virus utelukker utvikling av spesifikke behandlinger mot hver og en av dem i en forholdsvis nær fremtid. Til sammen understreker dette behovet for effektive strategier for å identifisere og utvikle potente antivirale molekyler i nær fremtid. Det er trivielt å si at en bredspektret hemmer aktiv mot et stort panel av RNA-virus ville løse dette problemet. Selv om en slik molekyl er fortsatt en virolog drøm, vår bedre forståelse av cellulære forsvarsmekanismer og medfødte immunsystemet tyder på at noen muligheter finnes 7,8. Flere akademiske og industrielle laboratorier er nå søker molekyler som stimulerer bestemte fasetter av mobilnettet forsvarsmekanismer eller metabolske veier til demper virusreplikasjon. Selv om slike forbindelser vil sannsynligvis vise betydelige bivirkninger, vil behandlinger mot akutte virusinfeksjoner er administrereed i en relativt kort tid, noe som gjør dem akseptable tross for en viss potensiell toksisitet på lang sikt. Ulike strategier har blitt utviklet for å identifisere slike bredspektret antivirale molekyler. Noen forskningsprogrammer tar sikte på å finne molekyler som er rettet mot spesifikke forsvars eller stoffskifte. Dette omfatter, for eksempel, patogen gjenkjennings reseptorer for å fremkalle antiviral genekspresjon 9 og aktiverer antivirale faktorer som RnaseL 10, autophagy maskineri for å fremme virusforringelse 11, trasé nukleosidsyntese 12,13 eller apoptotiske kaskader for å utfelle døden av virus-infiserte celler 14. Andre grupper har utviklet fenotypiske skjermer som ikke målrette-baserte 13,15-17. I dette tilfellet blir antivirale molekyler ganske enkelt identifiseres ved deres evne til å blokkere viral replikasjon i en gitt mobilsystemet. Den generelle antagelse er at en forbindelse som hemmer 2-3 ubeslektede RNA virus ville ha en egnet profil for et bred spectrum antiviral molekyl. Virkningsmekanismen av hit-forbindelser valgt med en slik empirisk tilnærming er kun bestemt i en andre gang og til slutt kan føre til identifisering av nye cellulære mål for antivirale midler. Interessant nok har en retrospektiv analyse av nye medikamenter godkjent av US Food and Drug Administration mellom 1999 og 2008 vist at generelt slike fenotypiske screenings tendens til å prestere bedre enn målet baserte tilnærminger for å oppdage første-i-klassen små-molekyl narkotika 18 . Virusreplikasjon i high-throughput celle-baserte analyser er vanligvis bestemmes fra virus cytopathic effekter. Celler infisert og dyrket i 96 - eller 384-brønners plater i nærvær av testede forbindelser. Etter noen dager, er mobilnettet lag faste og farget med fargestoffer som krystallfiolett. Til slutt blir absorbans bestemmes med en plate-leser og forbindelser som hemmer viral replikasjon er identifisert ved deres evne til å bevare cellulære lag from virus-indusert cytopatisk effekt. Alternativt blir viralt-medierte cytopatiske virkninger vurderes ved bruk av standard levedyktighet assays slik som MTS reduksjon. Slike analyser er svært medgjørlig og kostnadseffektiv, men lider av tre store begrensninger. For det første krever de en virus-cellekombinasjon hvor viral replikasjon er cytopatisk på bare noen få dager, men dette er ikke alltid mulig, og dermed ringer for alternative tilnærminger 19.. For det andre, er de dårlig kvantitativ siden de er basert på et indirekte mål for viral replikasjon. Endelig kan giftige forbindelser scores som positive treff, og må derfor være eliminert med en teller skjerm som måler cellular levedyktighet. For å overvinne noen av disse hindringer har rekombinante virus eller replikoner er konstruert ved revers genetikk for å uttrykke rapportør proteiner, slik som EGFP eller luciferase, fra en ytterligere transkripsjonsenhet eller i ramme med virale proteingener (Noen eksempler er 20 til 23). Når disse virusene replikere, reporter proteins er produsert sammen med viral proteiner selv. Dette gir en meget kvantitativ analyse for å måle viral replikasjon og evaluere hemmende aktivitet av kandidatmolekyler. Dette er spesielt sant for rekombinante virus uttrykker luciferase (eller andre enzymer som kan bioluminescence) siden dette reporter systemet viser et bredt dynamisk område med høy følsomhet og nesten ingen bakgrunn. Videre er det ingen magnetisering lyskilde, og dermed hindre interferens med forbindelsen fluorescens 24.. Her, til vi detalj en høy gjennomstrømming protokollen screene kjemiske biblioteker for bredspektret hemmere av RNA-virus. Forbindelser blir testet først på menneskelige celler infisert med et rekombinant meslinger virus (MV) uttrykker ildflueluciferase 25 (rMV2/Luc, Figur 1, primære skjermen). MV tilhører Mononegavirales orden, og er ofte betraktet som en prototypisk medlem av negativ-RNA-viruses. Som sådan er MV genom brukes som en mal av viral polymerase for å syntetisere mRNA-molekyler som koder for virale proteiner. I rekombinant MV stamme som heter rMV2/Luc, er luciferase uttrykk uttrykt fra en ekstra transkripsjon enhet som settes inn mellom P og M gener (Figur 2A). Parallelt med dette blir forbindelsene testet for deres toksisitet på humane celler ved hjelp av et kommersielt luciferase-baserte reagens som evalueres, med ATP kvantifisering, antallet metabolsk aktive celler i kultur (figur 1, primær screen). Hele kjemiske biblioteker kan lett screenes med disse to assays for å velge forbindelser som ikke er toksisk og effektivt blokkere MV replikasjon. Deretter blir treff testet på nytt for dose-respons-inhibering av MV-replikasjon, mangel på toksisitet, så vel som for deres evne til å svekke chikungunya virus (CHIKV) replikasjon (Figur 1, sekundær skjerm). CHIKV er medlem av Togaviridae familien og dens genom er apositive single-strand RNA molekyl. Som sådan, er det fullstendig irrelevant for meslinger og forbindelser som hemmer både MV og CHIKV stå en god sjanse til å hemme et stort panel av RNA-virus. CHIKV nonstructural proteiner er direkte oversatt fra det virale genom, mens strukturelle proteiner blir kodet av transkripsjon og translasjon av et mRNA-molekyl subgenome. Våre in vitro assay for replikering CHIKV er basert på en rekombinant stamme kalt CHIKV / Ren, som uttrykker Renilla-luciferase enzym som en spaltet del av nonstructural polyprotein gjennom en innsetting av reporter-genet mellom nsP3 og nsP4 sekvenser 26 (figur 2B). Målestokken for Renilla-luciferase-aktivitet tillater overvåking av viral replikasjon i den tidlige fasen av CHIKV livssyklus. Denne high-throughput protokollen ble brukt til å raskt identifisere forbindelser med en passende profil for bredspektret antivirale midler i en kommersiell bibliotek med 10000 Molecmodulene beriket for kjemisk mangfold. Forbindelser ble i hovedsak følgende Lipinski styre på fem, med molekylvekt på mellom 250-600 dalton, og logge D-verdier under fem. Fleste av disse molekylene var nye virkestoffer som ikke finnes i andre kommersielle biblioteker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA-virus er ansvarlig for store menneskelige sykdommer som influensa, bronkitt, dengue, hepatitt C eller meslinger. De representerer også en voksende trussel på grunn av økt over hele verden børser og befolkningstrengende flere og flere naturlige økosystemer. Et godt eksempel på en slik voksende situasjon er chikungunya virusepidemier av 2005-2006 i Det indiske hav. Nyere utvikler i vår forståelse av mobilnettet veier kontrollerende virusreplikasjon tyder på at forbindelser rettet vertscellefunksjonene, snarere enn selve viruset, kan hemme et stort panel av RNA-virus. Noen bredspektret antivirale forbindelser er identifisert med verts målrettede analyser. Imidlertid måle hemming av viral replikasjon i cellekulturer ved hjelp av reduksjon av cytopatiske virkninger som en avlesning representerer fortsatt et overordnet screeningstrategi. Slike funksjonelle skjermer har blitt kraftig forbedret med utviklingen av rekombinante virus uttrykker reporter enzymer caPable av bioluminescence som luciferase. I den foreliggende rapporten, vi detalj en high-throughput screening rørledningen, som kombinerer rekombinante meslinger og chikungunya virus med mobilnettet levedyktighet analyser, for å identifisere forbindelser med et bredspektret antiviral profil.

Dette screening rørledningen er avhengig først på valg av forbindelser som hemmer MV replikering og ikke viser noen betydelig cellulær toksisitet (Figur 1, primære skjermen). Den tar fordel av luciferase-baserte analyser for å bestemme cellulær toksisitet og inhibering av viral replikasjon. Alle pipetteringstrinn og datainnsamling kan utføres i en high-throughput-innstillingen med en robot-plattform. Cellulær toksisitet av forbindelsene ble vurdert ved hjelp av et l...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

In vitro assays for å måle virusreplikasjon er blitt betydelig forbedret ved utvikling av rekombinante RNA-virus som uttrykker luciferase, eller andre enzymer som er i stand til bioluminesens. Her vi detalj en high-throughput screening rørledning som kombinerer slike rekombinante stammer av meslinger og chikungunya virus å isolere bredspektret antivirale midler fra kjemiske biblioteker.

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid Screening av HIV revers transkriptase og integrasehemmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid annealing-mediert elektroforese (NAVN) analysen Lar Rapid Identifikasjon av HIV-1 nucleocapsid hemmere

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Etablering av en High-throughput Oppsett for screening små molekyler som modulerer c-di-GMP signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi-baserte analyser for High-throughput screening av Host faktorer involvert i<em&gt; Brucella</em&gt; Infeksjon av HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescens-basert lymfocyttkontroll analyse Egnet for høy gjennomstrømming screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Effekt og Cytotoksisitet Screening av inhibitorer målretting Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

En høy gjennomstrømming grobunn-Lox aktivert Viral membran Fusion analysen for å identifisere hemmere av HIV-1 Viral membran Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...