Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
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Agradecemos ao Dr. Yves L. Janin por seus comentários e sugestões proveitosas. Gostaríamos de agradecer a HH Gad para CHIK / Ren e C. Combredet pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, o Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), o Institut Carnot - Pasteur Maladies Infecciosas (STING Programa de POV e HM- L), a Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programa de STING 2,0 a POV), eo &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemical Projeto Biblioteca, bolsas n ° 06-222 I / R e I 09-1739 / R para HM-L.). O trabalho sobre CHIKV / Ren foi apoiada pelos ArbOAS projeto (concessão ANR 2010-INTB-1601-02).

1. Preparação de placas de 96 poços com filha Compostos <ol><li> Mover placas mãe de 96 cavidades que contêm soluções-mãe 10 mM de compostos químicos em DMSO a partir de -20 ° C até à temperatura ambiente. Diluir 5x compostos em DMSO para se obter placas de intermediários de diluição de 96 poços a 2 mM. A diluição é obtida por pipetagem de 5 ul em 20 ul de DMSO e a mistura. </li><li> Pipete 1 mL de diluição em placas de poços de branco seco, de cultura de tecidos de código de barras placas de 96...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

O gasoduto triagem descrito aqui tem como objectivo seleccionar compostos com um perfil adequado como inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Quando uma biblioteca de 10.000 compostos foi exibido com este protocolo e critérios de filtragem acima referidos foram aplicados, ou seja, a inibição da replicação MV superior a 75%, 40 compostos (0,4%) resultados positivos. Além disso, cerca de metade deles mostraram alguma toxicidade no ensaio de viabilidade com base em luciferase, e foram desconsiderados por...

Vírus de RNA são responsáveis ​​por uma grande variedade de infecções humanas, e têm um enorme impacto sobre as populações de todo o mundo, tanto em termos de saúde pública e de custo econômico. Vacinas eficazes têm sido desenvolvidos contra diversos vírus de ARN humano, e são amplamente utilizados como tratamentos profiláticos. No entanto, ainda existe uma falta crítica de medicamentos terapêuticos contra infecções por vírus RNA. Na verdade, as vacinas não estão disponíveis eficientes contra as principais patógenos humanos, tais como o vírus da dengue, vírus da hepatite C ou vírus respiratório sincicial humano (HRSV). Além disso, os vírus de RNA são responsáveis ​​pela maioria das doenças emergentes, que aumentaram em freqüência por causa de trocas globais e impacto humano sobre sistemas ecológicos. Contra esta ameaça que representam os vírus de RNA, nosso arsenal terapêutico é extremamente limitado e relativamente ineficiente 1-3. As terapias atuais são, essencialmente, com base no tipo recombinante interferons I (IFN-α / β) para estimular a imunidade inata,ou a administração de ribavirina. Embora o modo de ação deste analógico ribonucleosido é controverso e, provavelmente, depende de vários mecanismos, a inibição da IMFDH celular (inosina monofosfato desidrogenase), que esgota intracelulares piscinas GTP, é claramente essencial 4. Ribavirina, em combinação com IFN-α peguilado, é o principal tratamento contra o vírus da hepatite C. No entanto, os tratamentos de IFN-α / β e ribavirina são de relativamente fraca eficácia in vivo contra a maioria dos vírus de ARN em que a sinalização eficiente romba IFN-α / β através da expressão da virulência 5 e frequentemente escapar ribavirina 3. Isso, somado ao fato de que a ribavirina está levantando questões importantes de toxicidade, embora tenha sido aprovado recentemente contra a doença hRSV grave com benefícios controversos 6. Mais recentemente, alguns tratamentos específicos do vírus têm sido comercializados, em particular contra o vírus influenza, com o desenvolvimento of inibidores da neuraminidase 3. No entanto, a grande diversidade e emergência permanente de vírus RNA impede o desenvolvimento de tratamentos específicos contra cada um deles em um futuro relativamente próximo. Ao todo, este sublinha a necessidade de estratégias eficientes para identificar e desenvolver moléculas antivirais potentes em um futuro próximo. É trivial para dizer que um inibidor de largo espectro activo contra um grande painel de vírus de ARN resolveria este problema. Embora tal molécula ainda é o sonho de um virologista, a nossa melhor compreensão dos mecanismos de defesa celular e sistema imune inato sugerem que algumas possibilidades existem 7,8. Vários laboratórios acadêmicos e industriais estão agora a procurar moléculas que estimulam facetas específicas de mecanismos de defesa celular ou vias metabólicas para diminuir a replicação viral. Embora tais compostos provavelmente mostram efeitos colaterais significativos, tratamentos contra infecções virais agudas serão administrared por um tempo relativamente curto, tornando-as aceitáveis, apesar de alguma toxicidade potencial no longo prazo. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para identificar estas moléculas antivirais de largo espectro. Alguns programas de pesquisa visam encontrar moléculas que têm como alvo as vias de defesa ou metabólicas específicas. Isso inclui, por exemplo, receptores de reconhecimento de patógenos, para esclarecer a expressão do gene antiviral 9 e ativam fatores antivirais como RNaseL 10, máquinas autofagia para promover a degradação do vírus 11, a síntese de nucleosídeos vias 12,13, ou cascatas apoptóticos para precipitar a morte de células infectadas por vírus 14. Outros grupos têm desenvolvido telas fenotípicos que não são baseadas em alvo 13,15-17. Nesse caso, as moléculas antivirais são simplesmente identificados pela sua capacidade para bloquear a replicação do vírus em um determinado sistema celular. A suposição é de que em geral um composto inibidor de 2-3 vírus RNA não relacionadas que têm um perfil apropriado para um amplo spectrum molécula antiviral. O modo de acção dos compostos seleccionados de golpes com uma tal abordagem empírica é determinado apenas em um segundo tempo e, eventualmente, pode levar à identificação de novos alvos celulares para antivirais. Curiosamente, uma análise retrospectiva de novas drogas aprovadas pelo os EUA Food and Drug Administration, entre 1999 e 2008 mostrou que, em geral, esses exames fenotípicas tendem a ter melhor do que as abordagens por objectivo realizar a descobrir primeiro-in-class drogas de pequenas moléculas 18 . A replicação viral em ensaios baseados em células de alto rendimento geralmente é determinada a partir de efeitos citopáticos do vírus. As células são infectadas e cultivadas em 96 - ou placas de 384 poços na presença dos compostos testados. Depois de alguns dias, as camadas celulares são fixadas e coradas com corantes, tais como violeta de cristal. Finalmente, a absorvência é determinada com um leitor de placas e os compostos que inibem a replicação viral são identificados pela sua capacidade para preservar as camadas celulares from efeito citopático induzido pelo vírus. Alternativamente, os efeitos citopáticos mediados por vírus são avaliados utilizando ensaios de viabilidade de padrão, tais como a redução de MTS. Tais ensaios são altamente tratável e de baixo custo, mas sofrem de três grandes limitações. Primeiro, eles exigem uma combinação vírus-célula, onde a replicação viral é citopático em apenas alguns dias, mas nem sempre isso é possível, chamando, assim, para abordagens alternativas 19. Em segundo lugar, eles são mal quantitativa, uma vez que são baseados em uma medida indireta da replicação viral. Finalmente, os compostos tóxicos podem ser classificados como resultados positivos, e, portanto, deve ser eliminado, com um ecrã de contador que mede a viabilidade celular. Para ultrapassar algumas destas dificuldades, os vírus recombinantes, ou replicões foram projectadas por genética reversa para expressar proteínas repórter, tal como luciferase ou EGFP, a partir de uma unidade de transcrição adicional ou em grelha com genes de proteínas virais (alguns exemplos são 20-23). Quando estes vírus se replicar, pr repórteroteins são produzidos em conjunto com as proteínas virais próprios. Isto proporciona um ensaio muito quantitativa para medir a replicação viral e avaliar a actividade inibidora de moléculas candidatas. Isto é particularmente verdadeiro para os vírus recombinantes que exprimem a luciferase (ou outras enzimas capazes de bioluminescência) uma vez que este sistema repórter apresenta uma vasta gama dinâmica, com uma elevada sensibilidade e praticamente sem fundo. Além disso, não há uma fonte de luz de excitação, evitando assim a interferência com fluorescência composto 24. Aqui, detalhes de um protocolo de alto rendimento para a tela bibliotecas químicas para inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Os compostos são testados em células de seres humanos infectados com um vírus de sarampo recombinante (MV) que expressam a luciferase do pirilampo 25 (rMV2/Luc, Figura 1, a tela de primário). MV pertence Mononegavirales ordem, e é muitas vezes considerado como um membro protótipo de vírus RNA de cadeia negativaes. Como tal, MV genoma é utilizada como um modelo de polimerase viral para sintetizar moléculas de mRNA que codificam para as proteínas virais. Na estirpe recombinante denominado MV rMV2/Luc, a expressão da luciferase é expressa a partir de uma unidade de transcrição adicionais inseridos entre os genes P e M (Figura 2A). Em paralelo, os compostos são testados quanto à sua toxicidade em células humanas utilizando um reagente à base de luciferase comercial que avalia, por quantificação de ATP, o número de células metabolicamente activas na cultura (Figura 1, o ecrã primário). Bibliotecas químicas inteiras podem ser facilmente rastreados com estes dois ensaios, a fim de seleccionar os compostos que não são tóxicos e bloqueiam eficazmente a replicação MV. Em seguida, os hits são testados para a inibição de dose-resposta de replicação MV, a falta de toxicidade assim como quanto à sua capacidade para afectar o vírus Chikungunya (CHIKV) replicação (Figura 1, o ecrã secundário). CHIKV é um membro da família Togaviridae e seu genoma é apmolécula de RNA de fita simples ositive. Como tal, é completamente alheios ao sarampo e compostos que inibem tanto MV e CHIKV tem uma chance grande de inibir um grande painel de vírus RNA. Proteínas não estruturais são CHIKV directamente traduzido a partir do genoma viral, enquanto que as proteínas estruturais são codificadas através de transcrição e tradução de uma molécula de ARNm subgenómico. O nosso ensaio de replicação in vitro para CHIKV baseia-se uma estirpe recombinante denominado CHIKV / Ren, que expressa a enzima luciferase de Renilla como uma parte clivada da poliproteína não estrutural por meio de uma inserção do gene repórter entre NSP3 e NSP4 sequências de 26 (Figura 2B). A medida da atividade da luciferase Renilla permite o monitoramento da replicação viral na fase inicial do ciclo de vida CHIKV. Este protocolo de alto rendimento foi usada para identificar rapidamente os compostos com um perfil adequado para os antivirais de largo espectro de uma biblioteca comercial de 10.000 Molecules enriquecido pela diversidade química. Os compostos foram essencialmente seguinte regra de cinco de Lipinski, com pesos moleculares variando 250-600 daltons, e registrar valores de D abaixo de 5. Maioria dessas moléculas eram novas entidades químicas não disponíveis em outras bibliotecas comerciais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

Vírus de RNA são responsáveis ​​por importantes doenças humanas, tais como a gripe, bronquite, dengue, hepatite C ou sarampo. Eles também representam uma ameaça emergente devido ao aumento das trocas em todo o mundo e as populações humanas penetrantes ecossistemas mais e mais naturais. Um bom exemplo desse tipo de situação emergente é epidemias de vírus chikungunya de 2005-2006, no Oceano Índico. Avanços recentes em nossa compreensão de caminhos celulares que controlam a replicação viral sugerem que os compostos que visam funções da célula hospedeira, em vez de o próprio vírus, poderia inibir um grande painel de vírus RNA. Alguns compostos anti-virais de amplo espectro têm sido identificados com ensaios orientados-alvo do hospedeiro. No entanto, a medição da inibição da replicação do vírus em culturas de células utilizando a redução de efeitos citopáticos como uma leitura ainda representa uma estratégia de rastreio primordial. Esses rastreios funcionais foram significativamente melhoradas pelo desenvolvimento de vírus recombinantes que expressam as enzimas repórter cazes de bioluminescência, tais como a luciferase. No presente relatório, detalhamos um gasoduto high-throughput screening, que combina o sarampo recombinante e vírus chikungunya com ensaios de viabilidade celular, para identificar compostos com um perfil antiviral de amplo espectro.

Este gasoduto triagem depende em primeiro lugar na seleção de compostos que inibem a replicação do MV e não mostram qualquer toxicidade celular significativa (Figura 1, a tela principal). Aproveita-se os ensaios baseados em luciferase para determinar a toxicidade celular e a inibição da replicação viral. Todos os passos de pipetagem e de aquisição de dados pode ser realizada em um ambiente de alto rendimento com uma plataforma robótica. A toxicidade celular dos c...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Imunologia e Infecção

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...