Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

Мы благодарим доктора Ива Л. Янин за его ценные замечания и предложения. Мы хотели бы поблагодарить HH Гада для чик / Рен и С. Combredet для ее технической поддержки. Эта работа была поддержана Институтом Пастера, Национальный центр де ла Научных Исследований (CNRS), Национального Института де ла Здоровье и де ла Recherche Medicale (INSERM), Института Карно - Пастера болезней Infectieuses (Программа Стинг POV и HM- л), Национальное агентство по Pour La Recherche (ANR-RPIB, Программа STING 2,0 до POV), и &quot;Conseil региональных d&#39;Иль-де-Франс» (проект Химическая библиотека, гранты N ° I 06-222 / R и я 09-1739 / R для HM-L.). Работа по CHIKV / Рен поддержали проекта ArbOAS (ANR грант 2010-INTB-1601-02).

1. Подготовка Плиты Дочерние 96-а с соединений <ol><li> Перемещение матери 96-луночных планшетах, содержащих 10 мМ исходные растворы химических соединений в ДМСО от -20 ° С до комнатной температуры. Разреженного соединения 5x в ДМСО для получения промежуточных пластин разбавления 96-а при 2 мм. Р?...

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

Скрининг трубопровода описано здесь направлена ​​на выборе соединения с подходящим профилем в качестве ингибиторов широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Когда библиотека 10000 соединений был показан с этим протоколом и вышеупомянутые критерии фильтрации были применен...

РНК-вирусы несут ответственность за большое разнообразие человеческих инфекций, и имеют огромное влияние на популяции во всем мире как с точки зрения общественного здравоохранения и экономичной цене. Эффективные вакцины были разработаны против нескольких вирусов человеческого РНК, и широко используются в качестве профилактического лечения. Тем не менее, все еще существует критическая нехватка лекарственных препаратов против вирусных РНК инфекций. Действительно, эффективные вакцины не доступны по отношению к основным человеческих патогенов, таких как вирус денге, вирус гепатита С или вируса человеческого респираторного синцитиального (РСВЧ). Кроме того, РНК-вирусы несут ответственность за большинством возникающих болезней, которые увеличили частоты из-за глобальных обменов и антропогенного воздействия на экологические системы. Против этой угрозы, которые представляют РНК-содержащих вирусов, наш терапевтический арсенал крайне ограничен и относительно неэффективны 1-3. Современные методы терапии в основном на основе рекомбинантного типа I интерферонов (ИФН-α / β), чтобы стимулировать врожденный иммунитет,или администрация рибавирином. Хотя механизм действия этого рибонуклеозид аналоговых является спорным и, вероятно, используются различные механизмы, ингибирование клеточного IMPDH (инозинмонофосфатдегидрогеназы), который истощает внутриклеточные бассейны GTP, явно необходимы 4. Рибавирин, в сочетании с пегилированного интерферона-α, является основным лекарственным средством против вируса гепатита С.. Тем не менее, ИФН-α / β и рибавирина процедуры относительно плохой эффективности в естественных условиях по отношению к большинству РНК-содержащих вирусов, поскольку они эффективно тупые ИФН-α / β сигналов через выражение факторов вирулентности 5 и часто избежать рибавирин 3. Это добавило к тому, что лечение рибавирин повышение важные вопросы, связанные с токсичностью, хотя был недавно одобрен против тяжелой болезни РСВЧ с спорные преимущества 6. В последнее время некоторые вирус-специфических методов лечения, поступающие в продажу, в частности, против вируса гриппа с разработкой Oе ингибиторы нейраминидазы 3. Тем не менее, большая разнообразие и постоянное появление РНК-содержащих вирусов препятствует развитию конкретных обработок против каждого из них в относительно недалеком будущем. В целом, это подчеркивает необходимость эффективных стратегий для определения и разработки мощных противовирусных молекул в ближайшем будущем. Это тривиально, чтобы сказать, что ингибитор широкого спектра активен в отношении большого панели РНК-содержащих вирусов бы решить эту проблему. Хотя такая молекула-прежнему мечта вирусолог, наша лучшее понимание клеточных защитных механизмов и врожденной иммунной системы предполагают, что некоторые возможности существуют 7,8. Несколько академических и промышленных лабораторий в настоящее время ищет молекулы, которые стимулируют конкретные аспекты сотовой защитных механизмов или метаболических путей притупить репликацию вируса. Хотя такие соединения, вероятно, покажут значительные побочные эффекты, лечения от острых вирусных инфекций будет Администрированиеред в течение относительно короткого времени, что делает их приемлемыми, несмотря на некоторые потенциальной токсичности на долгосрочной перспективе. Различные стратегии были разработаны для выявления таких широкого спектра противовирусных молекул. Некоторые исследовательские программы направлены на поиск молекул, которые ориентированы на конкретные оборонные или метаболических путей. Это включает в себя, например, рецепторы распознавания патогена, чтобы вызвать экспрессию гена противовирусного 9 и активируют противовирусные такие факторы, как RNaseL 10, аутофагии машин для содействия деградации вирусного 11, нуклеозид синтез дорожками 12,13, или апоптоза каскадов, чтобы осадить гибель инфицированных вирусом клеток 14. Другие группы разработали фенотипические экраны, которые не являются целевыми, основанные 13,15-17. В этом случае, противовирусные молекулы просто идентифицировать по их способности блокировать вирусную репликацию в данной сотовой системой. Общее предположение, что соединение, ингибирующее 2-3 несвязанных вирусов РНК будет иметь подходящий профиль для широкого-SPectrum противовирусной молекуле. Механизм действия хит соединений, выбранных с таким эмпирического подхода определяется только во второй раз и в конце концов, может привести к идентификации новых клеточных мишеней для противовирусных препаратов. Интересно, что ретроспективный анализ новых лекарств, одобренных в США продуктов питания и медикаментов в период между 1999 и 2008 показал, что в общем, такие фенотипические показы, как правило, работают лучше, чем целевых подходов, чтобы обнаружить первый в своем классе низкомолекулярные препараты 18 . Репликация вируса в клеточной основе анализов высокой пропускной обычно определяется от вирусных цитопатических эффектов. Клетки инфицируют и культивировали в 96 - или 384-луночных планшетах в присутствии тестируемых соединений. После нескольких дней, клеточные слои фиксировали и окрашивали красителей, таких как кристаллическим фиолетовым. Наконец, поглощение определяется с читатель пластины и соединения, ингибирующие репликацию вируса идентифицируются по их способности хранить клеточные слои сюдам вирус-индуцированной цитопатического эффекта. Кроме того, вирусно-опосредованного цитопатические эффекты оценивали с использованием стандартных анализов жизнеспособности таких как снижение МТС. Такие анализы очень сговорчивым и экономически эффективным, но страдают от трех основных ограничений. Во-первых, они требуют сочетания вирус-клеток, где вирусной репликации цитопатический всего несколько дней, но это не всегда возможно, тем самым призывая к альтернативных подходов 19. Во-вторых, они плохо количественный, так как они основаны на косвенной мерой репликации вируса. Наконец, токсичных соединений может быть оценивали как положительные ударов, и, следовательно, должны быть устранены с противоположным экране измерения жизнеспособности клеток. Для преодоления некоторых из этих препятствий, рекомбинантные вирусы или репликоны были разработаны методом обратной генетики выразить репортерных белков, таких как EGFP или люциферазы, от дополнительного блока транскрипции или в рамке с вирусных генов белка (Несколько примеров 20-23). Когда эти репликации вирусов, репортер пр.oteins производятся вместе с самими вирусных белков. Это обеспечивает очень количественного анализа для измерения вирусной репликации и оценки ингибирующей активности молекул-кандидатов. Это особенно верно для рекомбинантных вирусов, экспрессирующих люциферазы (или другие ферменты, способные биолюминесценции), поскольку это репортер система демонстрирует широкий динамический диапазон с высокой чувствительностью и практически без фона. Кроме того, нет никакого источника света возбуждения, тем самым предотвращая помехи с соединением флуоресценции 24. Здесь мы подробно протокол высокой пропускной экранировать химические библиотеки для ингибиторов широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Соединения проверяются сначала на клетках человека, инфицированных рекомбинантным вирусом кори (MV), выражающей люциферазы светляков 25 (rMV2/Luc, рисунок 1, основной экран). М.В. принадлежит Mononegavirales заказ, и часто рассматривается как прототип члена отрицательной нить РНК вирусаэс. Таким образом, MV геном использовали в качестве матрицы с помощью вирусной полимеразы синтезировать мРНК, кодирующих вирусные белки. В рекомбинантного MV деформации под названием rMV2/Luc, люциферазы выражение выражается от дополнительного блока транскрипции вставленной между Р и М генов (рис. 2А). Параллельно соединения тестировали на их токсичности на клетках человека с помощью коммерческого люциферазы на основе реагента, который оценивает, АТФ количественного количество метаболически активных клеток в культуре (рис. 1, первичный экран). Целые химические библиотеки могут быть легко скринировали с этих двух анализах с целью выбора соединений, которые не токсичны и эффективно блокируют репликацию MV. Затем хиты повторно для ингибирования доза-реакция М.В. репликации, отсутствие токсичности, а также для их способности ухудшать вирус чикунгунья (CHIKV) репликации (рис. 1, среднее экрана). CHIKV является членом Togaviridae семьи и ее геном апOsitive однонитевую молекулу РНК. Как таковая, она не имеет никакого отношения к кори и соединений, ингибирующих и М.В. и CHIKV стоять большой шанс ингибировать большой панель РНК-содержащих вирусов. CHIKV неструктурные белки непосредственно в переводе с вирусного генома, тогда как структурные белки кодируются транскрипции и трансляции в субгеномной молекулы мРНК. Наша Анализ in vitro репликации для CHIKV основана на рекомбинантного штамма называемой CHIKV / Ren, выражающего фермента люциферазы Renilla как расщепленной части неструктурного полипротеина посредством введения гена-репортера между nsP3 и NSP4 последовательностей 26 (фиг. 2B). Мерой активности люциферазы Renilla позволяет контролировать вирусной репликации на ранней стадии CHIKV жизненного цикла. Этот протокол высокой пропускной был использован для быстрой идентификации соединений с подходящим профилем для противовирусных препаратов широкого спектра действия в коммерческом библиотеке 10000 MolecULES обогащенные для химической разнообразия. Соединения существу, следуя правилу Липинский в пяти, с молекулярной массой от 250 до 600 дальтон и регистрации значений D ниже 5. Большинство из этих молекул были новые химические соединения, недоступные в других коммерческих библиотек.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

РНК-вирусы несут ответственность за крупных заболеваний человека, таких как грипп, бронхит, лихорадка денге, гепатит С или кори. Они также представляющих собой растущую угрозу из-за увеличения мировых биржах и человеческих популяций, проникающих все больше и больше природных экосистем. Хорошим примером такого складывающейся ситуации является вирус чикунгунья эпидемии 2005-2006 в Индийском океане. Последние достижения в понимании клеточных путей, контролирующих репликацию вируса предполагают, что соединения, нацеленные функции клетки-хозяина, а не сам вирус, может ингибировать большой панель РНК-содержащих вирусов. Некоторые широкого спектра противовирусных соединений были идентифицированы с принимающими целевых анализов. Однако измерения ингибирования репликации вируса в клеточных культурах, используя снижение цитопатического эффекта в качестве отсчета все еще представляет первостепенную стратегию скрининга. Такие функциональные экраны были значительно улучшены по разработке рекомбинантных вирусов, экспрессирующих ферментами-репортерами окpable биолюминесценции, таких как люциферазы. В настоящем докладе мы подробно на высокопроизводительного скрининга трубопровода, который сочетает в себе рекомбинантные кори и Чикунгунья вирусы с сотовой жизнеспособность анализов, для идентификации соединений с широким спектром противовирусной профиля.

Этот скрининг трубопровода зависит в первую очередь от выбора соединений, которые ингибируют MV репликацию и не показывают существенного клеточную токсичность (рис. 1, основным экраном). Он использует люциферазной основе анализов, чтобы определить клеточную токсичность и инги...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

В пробирке тесты для измерения репликацию вируса были значительно улучшены по разработке рекомбинантных РНК-содержащих вирусов, экспрессирующих люциферазы или другие ферменты, способные биолюминесценции. Здесь мы подробно на высокопроизводительного скрининга трубопровод, который сочетает в себе такие рекомбинантных штаммов кори и Чикунгунья вирусов изолировать противовирусные препараты широкого спектра действия из химических библиотек.

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Микроскопический фенотипический анализ для количественной оценки внутриклеточных микобактерий, адаптированных для скрининга с высокой пропускной способностью/высоким содержанием

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в<em&gt; Brucella</em&gt; Инфицирование клеток HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Высок объём Cre-Lox активации вирусного мембраны Fusion Assay для выявления ингибиторы синтеза вирусных мембраны ВИЧ-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...