Name: high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Yves L. Janin por sus fructíferos comentarios y sugerencias. Nos gustaría dar las gracias a HH Gad para CHIK / Ren y C. Combredet por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Pasteur, el Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), el Instituto Carnot - Pasteur Maladies infectieuses (STING Programa de POV y HM- L), la Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programa de STING 2.0 de POV), y el &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Biblioteca Química de proyectos, subvenciones n ° 06-222 I / R y yo 09-1739 / R para HM-L.). El trabajo sobre CHIKV / Ren fue apoyada por los ArbOAS proyecto (donación de ANR 2010-INTB-1601-02).

1. Preparación de placas de 96 pocillos hija con compuestos <ol><li> Mueva placas madre de 96 pocillos que contienen 10 mM de soluciones madre de los compuestos químicos en DMSO de -20 ° C a temperatura ambiente. Diluir compuestos 5x en DMSO para obtener placas de dilución de 96 pocillos intermedios a 2 mM. La dilución se logra con la pipeta 5 l en 20 l de DMSO y la mezcla. </li><li> Pipetear 1 l de placas de dilución en pocillos secos de blanco, de cultivo de tejidos con código de barras placas de 96 pocillos....

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La tubería de cribado descrito aquí tiene como objetivo seleccionar compuestos con un perfil adecuado como inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Cuando una biblioteca de 10.000 compuestos se rastreó con este protocolo y se aplicaron los criterios de filtrado antes mencionados, es decir, la inhibición de la replicación del MV superior al 75%, 40 compuestos (0,4%) calificó como positivo. Además, aproximadamente la mitad de ellos mostró cierta toxicidad en el ensayo de viabilidad basado en la luc...

Los virus de ARN son responsables de una gran variedad de infecciones humanas, y tienen un gran impacto en las poblaciones de todo el mundo, tanto en términos de salud pública y el coste económico. Vacunas eficaces se han desarrollado contra varios virus de ARN humano, y son ampliamente utilizados como tratamientos profilácticos. Sin embargo, todavía hay una falta crítica de fármacos terapéuticos contra las infecciones de virus de ARN. De hecho, las vacunas eficaces no están disponibles frente a las principales patógenos humanos, tales como el virus del dengue, virus de la hepatitis C o el virus sincitial respiratorio humano (VRSh). Además, los virus de ARN son responsables de la mayoría de las enfermedades emergentes, que han aumentado en frecuencia a causa de los intercambios mundiales y el impacto humano sobre los sistemas ecológicos. Contra esta amenaza que representan los virus ARN, nuestro arsenal terapéutico es muy limitado y relativamente ineficiente 1-3. Las terapias actuales se basan esencialmente en el tipo recombinante I interferones (IFN-α / β) para estimular la inmunidad innata,o la administración de ribavirina. Aunque el modo de acción de este análogo de ribonucleósido es controvertido y probablemente se basa en diversos mecanismos, la inhibición de la IMPDH celular (inosina monofosfato deshidrogenasa), que agota piscinas GTP intracelulares, es claramente esencial 4. La ribavirina, en combinación con pegilado IFN-α, es el principal tratamiento contra el virus de la hepatitis C. Sin embargo, los tratamientos de IFN-α / β y ribavirina son de relativamente poca eficacia in vivo contra la mayoría de los virus de ARN, ya que de manera eficiente contundente IFN-α / β señalización a través de la expresión de factores de virulencia 5 y, a menudo escapar ribavirina 3. Esto sumado al hecho de que el tratamiento con ribavirina está planteando problemas de toxicidad importantes, a pesar de que recientemente se aprobó contra la enfermedad VRSh grave con beneficios controversiales 6. Más recientemente, algunos tratamientos específicos para el virus se han comercializado, en particular, contra el virus de la gripe con el o desarrolloinhibidores de la neuraminidasa f 3. Sin embargo, la gran diversidad y la aparición permanente de los virus de ARN se opone al desarrollo de tratamientos específicos contra cada uno de ellos en un futuro relativamente cercano. En conjunto, esto subraya la necesidad de estrategias eficaces para identificar y desarrollar moléculas antivirales potentes en un futuro próximo. Es trivial decir que un inhibidor de amplio espectro activo frente a un gran panel de virus de ARN podría resolver este problema. Aunque tal molécula sigue siendo el sueño de un virólogo, nuestro conocimiento de los mecanismos de defensa celular y el sistema inmune innato sugieren que existen algunas posibilidades 7,8. Varios laboratorios académicos e industriales están buscando moléculas que estimulan facetas específicas de los mecanismos de defensa celular o rutas metabólicas para embotar la replicación viral. Aunque tales compuestos probablemente mostrar efectos secundarios significativos, tratamientos contra las infecciones virales agudas serán administrarcado desde hace relativamente poco tiempo, lograr que sean aceptables a pesar de cierta toxicidad potencial en el largo plazo. Varias estrategias se han desarrollado para identificar tales moléculas antivirales de amplio espectro. Algunos programas de investigación tienen por objeto la búsqueda de moléculas que se dirigen a las vías de defensa o metabólicas específicas. Esto incluye, por ejemplo, receptores de reconocimiento de patógeno para provocar la expresión de genes antivirales 9 y activar factores antivirales tales como RNaseL 10, maquinaria autofagia para promover la degradación de virus de 11, la síntesis de nucleósido vías 12,13, o cascadas apoptóticas para precipitar la muerte de las células infectadas por virus 14. Otros grupos han desarrollado pantallas fenotípicas que no son objetivo basadas en 13,15-17. En ese caso, las moléculas antivirales son simplemente identifican por su capacidad para bloquear la replicación viral en un sistema celular dado. La suposición general es que un compuesto inhibidor 2-3 virus ARN sin relación tendría un perfil adecuado para una amplia-spectrum molécula antiviral. El modo de acción de los compuestos seleccionados de golpe con un enfoque empírico sólo se determina en un segundo tiempo y, finalmente, puede conducir a la identificación de dianas celulares nuevos de antivirales. Curiosamente, un análisis retrospectivo de los nuevos medicamentos aprobados por la Food and Drug Administration de EE.UU. entre 1999 y 2008 ha puesto de manifiesto que, en general, dichas proyecciones fenotípicas tienden a obtener mejores resultados que los enfoques basados ​​en metas de descubrir drogas 18 de molécula pequeña primero en su clase . La replicación viral en ensayos basados ​​en células de alto rendimiento se determinará a partir de los efectos citopáticos del virus. Las células se infectan y se cultivaron en 96 - o placas de 384 pocillos en presencia de compuestos ensayados. Después de pocos días, las capas celulares se fijaron y se tiñeron con colorantes tales como violeta cristal. Por último, se determina la absorbancia con un lector de placas y los compuestos que inhiben la replicación viral se identifican por su capacidad para conservar capas celulares lado a otrom de virus inducida por efecto citopático. Por otra parte, los efectos citopáticos mediadas por virus que se determina utilizando ensayos estándar de viabilidad como la reducción de MTS. Tales ensayos son altamente manejable y rentable, pero sufren de tres importantes limitaciones. En primer lugar, requieren una combinación virus-célula, donde la replicación viral es citopático en sólo unos pocos días, pero esto no siempre es posible, por lo que exigen enfoques alternativos 19. En segundo lugar, son poco cuantitativa, ya que se basan en una medida indirecta de la replicación viral. Finalmente, los compuestos tóxicos pueden ser calificados como positivos hits, y por lo tanto deben ser eliminados con una pantalla de contador que mide la viabilidad celular. Para superar algunos de estos obstáculos, virus o replicones recombinantes han sido diseñados por la genética inversa para expresar proteínas informadoras, tales como EGFP o luciferasa, desde una unidad de transcripción adicional o en el marco con genes de proteínas virales (algunos ejemplos son 20-23). Cuando estos virus se replican, pr reporterooteins se producen junto con las propias proteínas virales. Esto proporciona un ensayo muy cuantitativo para medir la replicación viral y evaluar la actividad inhibidora de las moléculas candidatas. Esto es particularmente cierto para los virus recombinantes que expresan luciferasa (u otras enzimas capaces de bioluminiscencia) ya que este sistema reportero exhibe un amplio rango dinámico con una alta sensibilidad y prácticamente sin fondo. Además, no hay una fuente de luz de excitación, evitando así la interferencia con fluorescencia compuesto 24. Aquí, nos detalle un protocolo de alto rendimiento para examinar bibliotecas químicas para los inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Los compuestos se ensayan primero en células humanas infectadas con un virus recombinante sarampión (MV) que expresa luciferasa de luciérnaga 25 (rMV2/Luc, la Figura 1, la pantalla principal). MV pertenece a MONONEGAVIRALES orden, y es a menudo considerado como un miembro prototípico de virus de ARN de cadena negativaes. Como tal, MV genoma se utiliza como una plantilla por la polimerasa viral para sintetizar moléculas de ARNm que codifican para las proteínas virales. En la cepa recombinante MV llamado rMV2/Luc, la expresión de luciferasa se ​​expresa a partir de una unidad de transcripción adicional insertado entre los genes P y M (Figura 2A). En paralelo, los compuestos se ensayaron para determinar su toxicidad en células humanas utilizando un reactivo basado en luciferasa comercial que evalúa, mediante la cuantificación de ATP, el número de células metabólicamente activas en el cultivo (Figura 1, la pantalla principal). Bibliotecas químicas enteras pueden ser fácilmente evaluados con estos dos ensayos con el fin de seleccionar compuestos que no son tóxicos y bloquean eficazmente la replicación del MV. Luego, los golpes se volvieron a ensayar para la inhibición dosis-respuesta de la replicación del MV, la falta de toxicidad, así como por su capacidad de alterar el virus Chikungunya (CHIKV) replicación (Figura 1, la pantalla secundaria). CHIKV es un miembro de la familia Togaviridae y su genoma es apositive molécula de una sola cadena de ARN. Como tal, es completamente no relacionado con el sarampión y compuestos que inhiben tanto MV y CHIKV destacan una gran oportunidad para inhibir un gran panel de los virus ARN. Proteínas no estructurales CHIKV se traducen directamente desde el genoma viral, mientras que las proteínas estructurales son codificadas por la transcripción y traducción de una molécula de ARNm subgenómico. Nuestro ensayo de replicación in vitro para CHIKV se basa en una cepa recombinante llamado CHIKV / Ren, que expresa enzima luciferasa de Renilla como una parte escindida de la poliproteína no estructural a través de una inserción del gen reportero entre nsP3 y nsP4 secuencias 26 (Figura 2B). La medida de la actividad de luciferasa de Renilla permite la monitorización de la replicación viral en la primera etapa del ciclo de vida CHIKV. Este protocolo de alto rendimiento se utiliza para identificar de forma rápida los compuestos con un perfil adecuado de antivirales de amplio espectro en una biblioteca comercial de 10.000 molecdulos enriquecida por la diversidad química. Los compuestos fueron esencialmente siguiendo la regla del cinco de Lipinski, con pesos moleculares que van desde 250 hasta 600 daltons, y registrar valores de D por debajo de 5. La mayoría de estas moléculas eran nuevas entidades químicas que no están disponibles en otras bibliotecas comerciales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

Los virus de ARN son los responsables de las principales enfermedades humanas como la gripe, la bronquitis, el dengue, la hepatitis C o el sarampión. También representan una amenaza emergente debido al aumento de los intercambios en todo el mundo y las poblaciones humanas que penetran en los ecosistemas cada vez más naturales. Un buen ejemplo de una situación tan emergente es epidemias de virus chikungunya de 2005-2006 en el Océano Índico. Avances recientes en nuestra comprensión de las vías celulares que controlan la replicación viral sugieren que los compuestos destinados a funciones de la célula huésped, más que el propio virus, podrían inhibir un gran panel de virus de ARN. Algunos compuestos antivirales de amplio espectro han sido identificados con ensayos orientados a objetivos de acogida. Sin embargo, la medición de la inhibición de la replicación viral en cultivos celulares utilizando la reducción de los efectos citopáticos como una lectura todavía representa una estrategia de cribado de suma importancia. Tales pantallas funcionales se han mejorado en gran medida por el desarrollo de los virus recombinantes que expresan reportero enzimas CAPable de bioluminiscencia tal como luciferasa. En el presente informe, detallamos una tubería cribado de alto rendimiento, que combina el sarampión recombinantes y virus chikungunya con ensayos de viabilidad celular, para identificar compuestos con un perfil antiviral de amplio espectro.

Esta tubería de detección se basa en primer lugar en la selección de compuestos que inhiben la replicación de MV y no muestran ninguna toxicidad celular significativa (figura 1, la pantalla principal). Se aprovecha de ensayos basados ​​en la luciferasa para determinar la toxicidad celular y la inhibición de la replicación viral. Todos los pasos de pipeteado y la adquisición de datos se puede realizar en un entorno de alto rendimiento con una plataforma robótica. ...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em&gt; Brucella</em&gt; Infección de células Hela

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...