Name: one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice
Uploaded: 2014-02-25T14:15:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

وأيد TLW من قبل زمالة ماري كوري الدولية الواردة. وقد تم تمويل هذا العمل أيضا من التمويل المؤسسية الأساسية، Bundesministerium الفراء Bildung وForschung (BMBF) والتمويل جزئيا بدعم من برنامج البحوث ذات الأولوية (SFB) 655 لGK. فإن الكتاب أود أن أشكر آن Karasinsky للرعاية وصيانة جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وأوديت ليتر، سوزان Ruhwald، فاني بوهمه، وريتشارد يتزيل لزراعة الخلايا والمساعدة المجهري.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-2-responsive+neuronal+progenitors+reside+in+proliferative+and+quiescent+regions+of+the+adult+rodent+brain.">FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain.</a> Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).</li><li>Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+precursor+cells+and+neuroblasts+from+embryonic+and+adult+central+nervous+system.">Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system.</a> Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).</li><li>Bez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+neurosphere-forming+cells:+morphological+and+ultrastructural+characterization.">Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization.</a> Brain Res. 993, 18-29 (2003).</li><li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons.">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+and+nonclonal+growth+of+adult+neural+stem+cells.">Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells.</a> Stem Cells. 25, 871-874 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).</li><li>Freund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+individuality+in+genetically+identical+mice.">Emergence of individuality in genetically identical mice.</a> Science. 340, 756-759 (2013).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-+re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+stem+cell+population+is+retained+in+the+hippocampus+of+transgenic+Huntington's+disease+mice+but+not+wild-type+mice.">The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+stimulates+precursor+cells+in+the+adult+mouse+hippocampus.">Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+stem+and+progenitor+cells+in+the+hippocampus+are+activated+by+neural+excitation.">Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation.</a> J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin-1+allows+prospective+isolation+of+neural+stem+cells+from+the+adult+murine+hippocampus.">Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus.</a> J. Neurosci. 33, (2013).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li><li>Babu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+enriched+monolayer+cultivation+of+neural+precursor+cells+from+mouse+dentate+gyrus.">A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus.</a> Front. Neurosci. 5, 89 (2011).</li><li>Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+molecular+identity+of+cells+in+the+adult+subventricular+zone+in+vivo+and+after+expansion+in+vitro.">Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).</li><li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres.">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تعرض هذه الورقة بروتوكول مفصلة لبدء الثقافات السلائف العصبية، سواء الطبقات الوحيدة ملتصقة كما وneurospheres، من المنطقتين العصبية الرئيسية في مخ الفأر الكبار. هناك عدد من النقاط الهامة التي يجب أن يوضع في الاعتبار عند محاولة أي من هذه النظم في المختبر الثقافة. أولا، اختيار أسلوب التفكك مهم جدا وتعتمد الأنسجة. في أيدينا، 0.05٪ التربسين EDTA-فعالة جدا لتفكك النسيج SVZ، والنتائج في عدد أكبر من neurospheres من عند استخدام تقنية التفكك القائم على غراء. لتفكك النسيج DG ومع ذلك، فإننا نوصي بشدة نهج التفكك القائم على غراء. عند مقارنة مباشرة الأساليب تفارق اثنين على الأنسجة DG، لاحظنا العائد أقل بكثير من خلايا قابلة للحياة، وحوالي 10 أضعاف أقل neurospheres عند استخدام التربسين. هذا الاختلاف في التفكك يمكن أن يكون راجعا إلى الاختلاف في الأنسجة compositioن بين المنطقتين. وتحيط الأنسجة المدمجة التابعة للإدارة العامة من قبل neuropil واسعة ويمكن أن تحدث أضرار واسعة النطاق من خلال العمليات الخلوية التفكك. والنقطة الثانية الهامة هو أن نلاحظ أنه في حين أن الفحص neurosphere يمكن أن تكون مفيدة في الإدلاء ببيانات كمية عن عدد الخلايا السلائف موجودة في عينة نسيج معين، يجب، مع ذلك، أن تستخدم بعض الحذر في تفسير هذه الأرقام المطلقة. انصهار neurospheres يمكن أن يكون عاملا رئيسيا التباس. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا العصبية هي متحركة للغاية ويمكن أن تندمج، حتى في ظل ما من المفترض أن تكون الظروف &#39;النسيلي&#39; 7،19. تردد neurosphere الناتجة يمكن أن تكون تعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل بما في ذلك مكونات المتوسطة، وإجراء تشريح وعملية التفكك. حتى بين معالجات خبرة بعض الاختلاف في عدد neurospheres المتولدة من العينات متطابقة يفترض هو واضح (انظر الشكل 1A.) أكثر فائدة، هو المقارنة المباشرة من وتيرة السلائف بين عينتين معين (أي سيطرة مقابل معاملة أو من النوع البري مقابل خروج المغلوب) التي تمت معالجتها بواسطة نفس الشخص في تجربة واحدة، بدلا من بيان الكمي من مجموع عدد الخلايا السلائف. عند البت فيها الطرق الثقافة الاثنين هو الأكثر ملاءمة لإجراء تجربة معينة فمن المهم أن نلاحظ أن هذه الأنظمة ثقافة اثنين تختلف في تجانس أنواع الخلايا المتولدة. بالمقارنة مع تكاثر الخلايا الملتصقة الثقافات، والتي تظهر على تجمع الخلايا السلائف متجانسة إلى حد ما (~ 98٪ من الخلايا هي Sox2 +) 20، neurospheres أكثر غير متجانسة وتحتوي، فضلا عن تكاثر الخلايا السلائف، الخلايا العصبية متباينة، والخلايا النجمية 21،22. من المهم أن neurospheres ليست مثقف لفترات طويلة بين المقاطع كما أكبر neurosphere تصبح الأرجح هو أن تجد أنواع الخلايا المتمايزة في جوهرها. نبدأ عادة ملتصقة أحادي الطبقة الثقافات السلائف العصبية من الأنسجة DG ما بين 5-8 الفئران. لذلك، عند محاولة إنشاء الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة من DG أو SVZ من ماوس واحدة، يحتاج الرعاية القصوى التي يجب اتخاذها أثناء إجراء تفارق الأنسجة من أجل تجنب موت الخلايا المفرطة الناجمة عن أكثر من الطحن من الأنسجة، أو أخذ تمديد الفترات الزمنية بين تشريح وخطوات زراعة النهائي. يصف هذا البروتوكول، للمرة الأولى، جيل من الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة السلائف من كل من SVZ وDG الحيوانات الفردية. هناك العديد من الحالات عندما يحتاج المقارنة بين انتشار السلائف والتمايز إلى أن يتم على أساس حيوان واحد. وتشمل هذه القدرة على مقارنة مباشرة للإدارة العامة لوSVZ الحيوانات الفردية المقترنة باستخدام الإحصاءات والبيانات لإقران الثقافة مع البيانات السلوكية أو الفسيولوجية الفردية 9. ثقافات حيوان واحد أيضا:انخفاض استخدام الحيوانات النادرة المعدلة وراثيا، حيث مجموعة من المانحين 5-8 في ثقافة مطابقة سن غير ممكن، وكذلك الحيوانات الفريدة (مثل الصلبان F2 أو الحيوانات المرباة خارج) لجمعية دراسات الجينية.

مقايسة neurosphere 1،2 و ثقافة أحادي الطبقة ملتصقة 3،4، كل من البلدان المتقدمة في 1990s في وقت مبكر، لا يزال المعيار الذهبي في المختبر فحوصات الخلايا الجذعية العصبية. في هذه المقايسات، الأنسجة الابتدائي الجزئي تشريح الدماغ من منطقة معينة، نأت الى تعليق خلية واحدة والمثقف في وجود عامل نمو البشرة mitogens (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية-2 (FGF2) لتشكيل إما مجانا العائمة مجموعات (neurospheres) أو الطبقات الوحيدة ملتصقة. كلا النظامين لديها وينبغي إيلاء عدد من مزايا وعيوب ودراسة متأنية للمسألة التي يتعين معالجتها قبل اختيار واحد أو نظام آخر. Neurospheres تسمح لقراءة واضحة للخروج من الخلافات في عدد الخلايا السلائف والمحتملين. بالإضافة إلى ذلك، neurospheres هي أيضا أداة مفيدة لدراسة المواصفات الذاتية للخلايا عند إزالتها من البيئة الخارجية العادية. Extrinالعظة كذا يمكن دراستها ببساطة عن طريق إضافة عامل تهم متوسطة النمو وتحديد عدد وحجم neurospheres المتولدة. العيب الرئيسي من neurospheres ومع ذلك، هو أنها تشكل مكانة خاصة بهم، مع الخلايا في وسط neurospheres (neurospheres كبيرة على وجه الخصوص) كونها أكثر تمايزا من تلك التي على السطح 5. Neurospheres تحتوي على مزيج من الخلايا الجذعية، التي ارتكبت الأسلاف، وخلايا متباينة، والتفاعلات خلية خلية داخل neurospheres مواجهة صيانة الخلايا الجذعية. هذا هو السبب في neurospheres تحتوي إلا على عدد قليل من الخلايا الجذعية صحيح 6-8. الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة أيضا توفير نظام جيد في المختبر إلى نموذج في انتشار الجسم الحي. يمكن الثقافات ملتصقة، في الخلايا التي تبقى أكثر عزلة ومتجانسة، والقضاء على الطبيعة غير المتجانسة للneurosphere. في ظل هذه الظروف نمو الخلايا السلائف تتكاثر RAPIDLY والخلايا كلها تقريبا يتم تقسيم والتعبير عن علامات مميزة السلائف العصبية Nestin، Sox2، وBLBP. والعيب الرئيسي لنظام أحادي الطبقة الثقافة مقارنة مع مقايسة neurosphere هو أن الحيوانات المستنسخة الفردية المستمدة من السلائف غير قادرين على رصد وكميا. وكان من العيب معظم بروتوكولات لكلا النوعين من الثقافات ضرورة لاستخدام أعداد كبيرة نسبيا من الحيوانات، لأن العائد من استراتيجيات العزلة كثيرا ما كان الفقراء. في نفس الوقت، فقد أصبح من الواضح أن تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في تفريد الدماغ 9، مما أدى إلى ضرورة فردية فيفو السابقين النماذج كذلك. هذه الاحتياجات يمكن تلبيتها عن طريق بروتوكولات &quot;الفأر واحد، ثقافة واحدة&quot; كما هو موضح في هذا التقرير. يصف بروتوكول البصرية التالية جيل في وقت واحد من الثقافات السلائف العصبية من كل من SVZ وDG الحيوانات الفردية إما ملتصقة مonolayers أو كما neurospheres. الجيل الثقافات من الحيوانات الفردية مفيد بشكل خاص عندما يتطلب الأمر مقارنات بين الحيوانات المعالجة بشكل فردي أو المعدلة وراثيا مختلف الفردية أو البرية من نوع الفئران. ويشمل هذا البروتوكول تعليمات مفصلة للتسليخ مجهري في وقت واحد من المناطق SVZ وDG من الفئران الكبار، تفارق بهم في تعليق خلية واحدة، والثقافة في المختبر إما الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة أو neurospheres وتحليل multipotentiality والمحتملة على المدى الطويل، الكاردينال اثنين خصائص الخلايا الجذعية النية العظام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

مقايسة neurosphere ونظام الثقافة أحادي الطبقة ملتصقة هي أدوات قيمة لتحديد إمكانية (الانتشار أو تمايز) من الكبار الخلايا الجذعية العصبية في المختبر. هذه المقايسات يمكن استخدامها لمقارنة المحتملة السلائف الخلايا المعزولة من مختلف وراثيا أو المعالجة بشكل مختلف الحيوانات لتحديد تأثير العوامل الخارجية على تكاثر الخلايا العصبية السلائف والتمايز والعصبية لتوليد خطوط الخلايا السلائف التي يمكن أن يعاير أكثر المقاطع المستمر. يتم استخدام مقايسة neurosphere تقليديا لتحديد بعد خاص من الخلايا الجذعية، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود علامات نهائية مع التي يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة الأولية ولديه ميزة كبيرة لإعطاء تقدير الآن من أعداد الخلايا السلائف في أنسجة المخ المشتقة من الحيوانات الفردية. الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة، في المقابل، لا تستخدم عادة للمقارنة بين انتشار الحيوانات الفردية، كما بدأت كل ثقافة عموما من النسيج مجتمعة بين 5-8 حيوانات. ومع ذلك، لديهم ميزة كبيرة أنه، خلافا neurospheres، أنها تتكون من مجموعة من السكان معظمهم متجانسة من الخلايا السلائف ومفيدة لمتابعة عملية التمايز في الخلايا واحدة. هنا، نحن تصف، بالتفصيل، وجيل من الثقافات neurosphere و، لأول مرة، والثقافات ملتصقة من الحيوانات الفردية. وهذا له العديد من الآثار الهامة بما في ذلك تحليل يقترن الانتشار و / أو المحتملة التمايز في كل من منطقة subventricular (SVZ) والتلفيف المسنن (DG) من خطوط الماوس أو معاملة مختلفة وراثيا، فضلا عن خفض كبير في استخدام الحيوان.

على الرغم من أن المنطقتين العصبية للدماغ الفأر الكبار على حد سواء تحتوي على خلايا العصبية السلائف، ويمكن لهذه الخلايا تتصرف بشكل مختلف تماما عند تربيتها في المختبر. تظهر الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة المتولدة من كلتا المنطقتين يمكن تمييزها شكليا (الشكل 1A)، ومع ذلك، فإن الثقافات ملتصقة SVZ مشتقة تتكاثر بشكل أسرع وتحتاج إلى passaged، في المتوسط، في وقت سابق من 1-2 أيام من تلك المستمدة من DG. كما neurospheres، والخلايا السلائف SVZ مشتقة أيضا تتكاثر بشكل أسرع وأكبر تشكيل neurospheres (الشكل 1B) من الخلايا السلائف DG-مشتقة (الشكل 1C). في حين neurospheres SVZ المستمدة من عادة تحسب بعد 6-7 أيام في الثقافة، وعادة ما تكون كميا neurospheres DG-مشتقة بعد 10-12 يوما. بالإضافة إلى ذلك، عددا أكبر بكثير من الخلايا العصبية السلائف يقيمون في SVZ مقارنة DG، كما يتضح من عدد ما يقرب من 10 أضعاف أكبر من neurospheres التي يمكن أن تكون جنساتيد من هذه المنطقة (SVZ: 1،173 ± 74.9 مقابل DG: 145.3 ± 26.4، P = &lt;0.0001، ن = 10 الحيوانات لكل مجموعة؛ الشكل 2A). وقد أظهرت الدراسات أن خلايا السلائف داخل SVZ وDG الرد على محفزات مختلفة. يتم تنشيط الخلايا السلائف في المديرية العامة عن طريق أنواع معينة من التعلم المكاني والمنبهات مثل تخصيب البيئية والنشاط البدني، في حين يتم تنشيط الخلايا السلائف SVZ عن طريق التعلم عن حاسة الشم وحاسة الشم تخصيب. واتساقا مع ذلك، واحد منا (TLW) أظهرت في وقت سابق ان DG يحتوي على عدد سكانها الجذعية الكامنة والخلايا الاصلية التي يمكن تفعيلها من خلال الإثارة العصبية 15-18. في المقابل، وجدنا أن الخلايا السلائف SVZ تستجيب بشكل مختلف تماما لهذا الحافز، مع انخفاض في عدد neurosphere ردا على إزالة إستقطاب مستويات بوكل 17. هنا، ونحن قد تتكرر هذه التجربة، والطلاء نصف الخلايا المعزولة المستمدة من SVZ والمديرية العامة لدائرة الهجرة والجنسيةividual الحيوانات في إزالة إستقطاب مستويات بوكل، والنصف الآخر في السيطرة مستويات بوكل. علينا أن نبرهن، كما سبق، أنه في حين يتم تنشيط الخلايا السلائف DG بواسطة الاستقطاب (101.2 ± 17.4 مقابل 184.8 ± 12.5، ص = 0.005، ن = 5 الحيوانات)، وانتشار الخلايا المشتقة من SVZ هو في الواقع انخفضت بشكل ملحوظ ( 368.0 ± 62.9 مقابل 266.6 ± 41.6، ص = 0.02، ن = 5 الحيوانات؛ الشكل 2B). لتأكيد المحتملة على المدى الطويل، واحدة من السمات الأساسية للخلية الجذعية صحيح، neurospheres واحد أو الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة يجب أن تكون قادرة على التوسع طويلة أي أكثر من 10 على الأقل الممرات. في كل ممر، وبعد إعداد تعليق خلية واحدة، يتم حساب عدد الخلايا ويتم احتساب التوسع أضعاف. ثم يتم احتساب مجموع الخلية النظري بضرب التوسع أضعاف خلال تلك مرور على مجموع النظرية من مرور السابقة. هذا هو DISP<html> الأصغر حجما مثل رسم بياني خط مع عدد مرور تآمر ضد LOG10 من إجمالي عدد الخلايا النظرية (انظر المثال الشكل 3). لتأكيد multipotentiality، سواء الثقافات أحادي الطبقة وneurospheres يمكن تفريقها mitogen الانسحاب وأن تظهر لتؤدي إلى كل من الخلايا العصبية، والخلايا الدبقية (الشكل 4). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> . الرقم 1 الماوس خلايا السلائف الكبار يمكن تربيتها، لأن الحضارات أحادي الطبقة ملتصقة (A) أو كما neurospheres (B: SVZ، C: DG). شريط مقياس هو 50 ملم <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. بشكل ملحوظ يتم إنشاء أكثر من neurospheres SVZ مقارنة DG من الفئران واحدة (A). الخلايا السلائف SVZ وDG تستجيب بشكل مختلف لإزالة الاستقطاب في المختبر (B). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> الرقم 3. لتأكيد التقوية على المدى الطويل، يتم توسيع neurospheres لأكثر من 10 المقاطع. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> الشكل 4. يمكن أن تكون متباينة في Neurospheres bIII-الأنبوبةلين + الخلايا العصبية (A: أحمر)، GFAP + الخلايا النجمية (A: الأخضر)، O4 + قليلة التغصن (B: أحمر) وMap2ab + الخلايا العصبية (C: أحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة للجيل في وقت واحد من مزارع الخلايا العصبية السلائف، إما الطبقات الوحيدة ملتصقة أو neurospheres، من منطقة subventricular والتلفيف المسنن من الفئران الكبار الفردية.

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...