Name: one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice
Uploaded: 2014-02-25T14:15:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

TLW נתמכה על ידי מארי קירי בינלאומית נכנסת מלגה. עבודה זו גם תמומן ממימון מוסדי בסיסי, Bundesministerium פרווה מימון Bildung וForschung (BMBF) ובחלקו בתמיכה עדיפות תכנית המחקר (SFB) 655 לGK. המחברים מבקשים להודות לאנה Karasinsky לטיפול ותחזוקה של כל בעלי החיים המשמשים במחקר זה ואודט לייטר, סוזן Ruhwald, פאני בוהם, וריצ&#39;רד וצל לתרבית תאים וסיוע מיקרוסקופ.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-2-responsive+neuronal+progenitors+reside+in+proliferative+and+quiescent+regions+of+the+adult+rodent+brain.">FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain.</a> Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).</li><li>Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+precursor+cells+and+neuroblasts+from+embryonic+and+adult+central+nervous+system.">Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system.</a> Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).</li><li>Bez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+neurosphere-forming+cells:+morphological+and+ultrastructural+characterization.">Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization.</a> Brain Res. 993, 18-29 (2003).</li><li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons.">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+and+nonclonal+growth+of+adult+neural+stem+cells.">Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells.</a> Stem Cells. 25, 871-874 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).</li><li>Freund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+individuality+in+genetically+identical+mice.">Emergence of individuality in genetically identical mice.</a> Science. 340, 756-759 (2013).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-+re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+stem+cell+population+is+retained+in+the+hippocampus+of+transgenic+Huntington's+disease+mice+but+not+wild-type+mice.">The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+stimulates+precursor+cells+in+the+adult+mouse+hippocampus.">Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+stem+and+progenitor+cells+in+the+hippocampus+are+activated+by+neural+excitation.">Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation.</a> J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin-1+allows+prospective+isolation+of+neural+stem+cells+from+the+adult+murine+hippocampus.">Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus.</a> J. Neurosci. 33, (2013).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li><li>Babu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+enriched+monolayer+cultivation+of+neural+precursor+cells+from+mouse+dentate+gyrus.">A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus.</a> Front. Neurosci. 5, 89 (2011).</li><li>Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+molecular+identity+of+cells+in+the+adult+subventricular+zone+in+vivo+and+after+expansion+in+vitro.">Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).</li><li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres.">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לחניכה של תרבויות עצביות מבשר, שני monolayers וneurospheres חסיד כ, משני האזורים העצביים המרכזיים במוח העכבר המבוגר. ישנן מספר נקודות חשובות שיש לזכור בעת שניסו אחת במבחנת מערכות תרבות אלה. ראשית, הבחירה של שיטת דיסוציאציה היא מאוד חשובה והיא רקמה תלויה. בידיים שלנו, 0.05% טריפסין-EDTA הוא יעילים מאוד לניתוק של רקמת SVZ, ותוצאות במספר גבוה יותר של neurospheres מאשר בעת שימוש בטכניקת ניתוק המבוסס על פפאין. לניתוק של רקמת DG עם זאת, אנו ממליצים בחום גישת דיסוציאציה מבוסס פפאין. כאשר השוואה ישירה בין שתי שיטות ניתוק על רקמת DG, שצפינו תשואה נמוכה יותר באופן משמעותי של תאי קיימא וכ פי 10 פחות neurospheres בעת השימוש בטריפסין. הבדל בניתוק זה יכול להיות בגלל ההבדל בcompositio הרקמהn בין שני האזורים. הרקמה הקומפקטית של DG מוקף neuropil הנרחבת ונזק נרחב של תהליכים תאיים יכול להתרחש במהלך דיסוציאציה. נקודה חשובה שנייה שיש לשים לב, כי בעוד assay neurosphere יכול להיות שימושי כדי להפוך את ההצהרות כמוני על מספר התאים המבשר נוכחים בדגימת רקמה נתון, קצת זהירות חייבת, עם זאת, להיות מועסקות בפרשנות של מספרים מוחלטים אלה. היתוך של neurospheres יכול להיות גורם בלבול גדול. מספר מחקרים הראו כי תאי עצב הם ניעתי מאוד ויכולים להתמזג, גם במה שהם לכאורה תנאים &#39;משובטים&#39; 7,19. תדירות neurosphere כתוצאה מכך יכולה להיות מאוד תלויה בגורמים שונים, לרבות רכיבים בינוניים, הליך הנתיחה ואת תהליך הניתוק. אפילו בין מטפלים המנוסים איזו וריאציה במספר neurospheres שנוצרה מדגימות כביכול זהות באה לידי ביטוי (ראה איור 1 א.) יותר שימושי, היא השוואה ישירה של התדירות המבשרת בין שתי דגימות נתון (כלומר לעומת ביקורת שטופל או wild-type לעומת עקום החוצה) יטופלו על ידי אותו האדם בניסוי אחד, ולא הצהרה כמותית בסך הכל תא מבשר מספר. כאשר מחליט איזו משתי שיטות התרבות הוא מתאים ביותר לניסוי מסוים זה חשוב לציין כי שתי מערכות התרבות אלה שונים בהומוגניות של סוגי התאים שנוצרו. בהשוואה למתרבה תרבויות חסיד תא, אשר מראות בריכה די הומוגנית תא מבשר (~ 98% מתאים הם Sox2 +) 20, neurospheres הן הטרוגנית יותר ומכילה, כמו גם תאים מתרבים מבשר, הנוירונים מובחנים, והאסטרוציטים 21,22. חשובה שneurospheres אינה בתרבית למשך תקופות ממושכות בין קטעים כגדולים neurosphere הפך סביר יותר הוא למצוא סוגי תאים מובחנים בליבה שלהם. אנחנו באופן מסורתי ליזום תרבויות חסיד monolayer עצביות מבשר מרקמת DG של בין 5-8 עכברים. לכן, כאשר מנסים להקים את תרבויות monolayer חסיד מDG או SVZ של עכבר אחת, בזהירות רבה צריכה להילקח במהלך הליך ניתוק רקמות על מנת למנוע מוות של תאים מוגזמים נגרמים על ידי מעל triturating של הרקמות, או לקחת מורחבת פרקי זמן בין הנתיחה וצעדי culturing סופיים. פרוטוקול זה מתאר, בפעם הראשונה, את הדור של תרבויות המבשרת monolayer חסיד משני SVZ וDG של בעלי חיים בודדים. ישנם מקרים רבים שבם ההשוואה של התפשטות מבשר והבחנה צריכה להיעשות על בסיס חיה אחת. אלה כוללים את היכולת להשוות ישירות DG וSVZ של בעלי חיים בודדים באמצעות סטטיסטיקה לזווג ולשייך נתונים תרבות עם נתונים התנהגותיים או פיסיולוגיים פרט 9. תרבויות חיה אחת גם אלנמוך השימוש בבעלי חיים מהונדסים נדירים, שבו בריכה של 5-8 תורמים לתרבות התאמה בגיל זה אינו אפשרי, כמו גם בעלי חיים ייחודיים (למשל צלבי F2 או בעלי חיים מתוך גידלו) למחקרי קשר גנטי.

Assay neurosphere 1,2 ותרבות חסיד monolayer 3,4, שניהם פותחו בתחילת 1990, עדיין יישארו סטנדרטי במבחני תא גזע עצביים מבחנה הזהב. במבחנים אלה, רקמה העיקרית היא מיקרו גזור מאזור במוח בפרט, ניתק לתוך השעיה תא בודדת ותרבית בנוכחות של גורם הגדילה באפידרמיס mitogens (EGF) וגידול פיברובלסטים גורם-2 (FGF2) ליצירת או חופשי צף אשכולות (neurospheres) או monolayers חסיד. שני המערכות יש מספר היתרונות וחסרונות ושיקול הדעת צריך להינתן לשאלה זו היא לטפל לפני אחד או המערכת אחרת נבחרה. Neurospheres מאפשרת קריאה מתוך פשוטה של ​​הבדלים במספר תאי מבשר ופוטנציאלי. בנוסף, neurospheres הן גם כלי שימושי כדי ללמוד מפרט פנימי של התאים, כאשר הוסר מן הסביבה החיצונית הרגילה שלהם. Extrinניתן ללמוד רמזים כך במקור פשוט על ידי הוספת הגורם של עניין למדיום הגידול וכימות המספר והגודל של neurospheres שנוצרה. החסרון העיקרי של neurospheres לעומת זאת, הוא שהם יוצרים נישה משלהם, עם התאים במרכזו של neurospheres (neurospheres הגדולה במיוחד) להיות יותר מובחן מאלה על פני השטח 5. Neurospheres מכילה תערובת של תאי גזע, תאי אב מחויבים, ותאים מובחנים ותאי תאי אינטראקציות בתוך neurospheres לנטרל את התחזוקה של תאי הגזע. זו הסיבה neurospheres להכיל רק מספר קטן של תאי גזע אמיתיים 6-8. תרבויות monolayer חסיד גם לספק מערכת במבחנה טובה למודל בהתפשטות vivo. תרבויות חסיד, שבו התאים נשארים יותר מבודדים והומוגנית, יכולות לחסל את הטבע הטרוגנית של neurosphere. בתנאים אלה צמיחת התאים המבשר להתרבות rapiהאלקי וכמעט כל תאי החלוקה ולהביע סמנים העצביים המבשר האופייניים Nestin, Sox2, וBLBP. החסרון העיקרי של מערכת תרבות monolayer לעומת assay neurosphere הוא ששיבוטים המופק מבשר אדם אינם מסוגלים להיות במעקב וכימות. חסרון של רוב הפרוטוקולים עבור שני הסוגים של תרבויות היה ההכרח להשתמש במספרים גדולים יחסית של בעלי חיים, משום שהתשואה של אסטרטגיות הבידוד כבר לעתים קרובות עניות. באותו הזמן, זה הפך להיות ברור כי neurogenesis למבוגרים תורמים לindividualization של המוח 9, וכתוצאה מכך, כמו גם בצורך במודלים לשעבר אישית vivo. ניתן לספק צורכים אלה על ידי פרוטוקולים &quot;אחד עכבר אחד תרבות&quot; כפי שתוארו בדוח זה. הפרוטוקול החזותי הבא מתאר את הדור בו זמני של תרבויות עצביות מבשר משני SVZ וDG של בעלי חיים בודדים או מ &#39;חסיד כonolayers או כneurospheres. הדור של תרבויות מבעלי החיים בודדים הוא שימושי במיוחד בעת השוואה בין בעלי חיים שטופלו בנפרד או מהונדס בודד שונים או wild-type עכברים נדרשות. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לmicrodissection בו זמנית של אזורי SVZ וDG מעכברים בוגרים, הניתוק שלהם לתוך השעיה תא בודדת, בתרבות במבחנה, כמו גם תרבויות חסיד monolayer או neurospheres וניתוח של multipotentiality ופוטנציאל לטווח ארוך, שני קרדינל מאפיינים של תאי גזע בתום עצם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

מערכת תרבות monolayer חסיד assay וneurosphere הם כלים רבי ערך כדי לקבוע את הפוטנציאל (התפשטות או בידול) של תאי גזע עצביים למבוגרים במבחנה. מבחני אלה יכולים לשמש כדי להשוות את פוטנציאל המבשר של תאים מבודדים מבעלי חיים שונים או טופלו באופן דיפרנציאלי גנטי כדי לקבוע את ההשפעות של גורמים חיצוניים על התפשטות תאים עצביים מבשר ובידול ולייצר שורות תאים עצביות מבשר כי ניתן assayed על מעברים רציפים. Assay neurosphere משמש באופן מסורתי לזיהוי פוסט הוק של תאי גזע, בעיקר בשל חוסר סמנים מוחלטים שבה הם יכולים להיות מבודדים מהרקמה העיקרית ויש לו היתרון הגדול של מתן הערכה מהירה של מספרים סלולריים מבשר ברקמת המוח מקורם בבעלי החיים בודדים. תרבויות monolayer חסיד, בניגוד לכך, לא באופן מסורתי משמשות להשוואת התפשטות בין בעלי חיים הבודדים, כמו כל תרבות היא בדרך כלל יזמה מן הרקמה בשילוב של בין 5-8 בעלי חיים. עם זאת, יש להם היתרון הגדול, שבניגוד neurospheres, הם מורכבים מאוכלוסייה בעיקר הומוגנית של תאים מבשר ושימושיים לבאים בתהליך ההתמיינות בתאים בודדים. כאן, אנו מתארים, בפירוט, את הדור של תרבויות neurosphere ו, בפעם הראשונה, תרבויות חסיד מבעלי חיים בודדים. יש לכך השלכות חשובות רבות, כולל ניתוח לזווג של הפצה ו / או פוטנציאל בידול בשני אזור subventricular (SVZ) ורכס משוננת (DG) של קווי עכבר שטופלו או שונים מבחינה גנטית, כמו גם הפחתה משמעותית בשימוש בבעלי חיים.

למרות ששני האזורים העצביים של מוח העכבר המבוגר שניהם מכילים תאים עצביים מבשר, תאים אלה יכולים להתנהג בצורה שונה לגמרי כאשר בתרבית במבחנה. תרבויות monolayer חסיד שנוצרו משני האזורים מופיעות מורפולוגית נבדלה (איור 1 א), לעומת זאת, התרבויות חסיד נגזרות SVZ מתרבות מהר יותר וצריכים להיות passaged, בממוצע, 1-2 ימים מוקדם יותר מאלה הנגזרים מDG. כneurospheres, התאים המבשר נגזרים SVZ גם מתרבים מהר יותר וליצור neurospheres הגדולה יותר (איור 1 ב &#39;) מאשר תאי שמקורם-DG מבשר (תרשים 1C). בעוד neurospheres נגזרת SVZ נספרות בדרך כלל אחרי 6-7 ימים בתרבות, neurospheres נגזרה-DG בדרך כלל לכמת אחרי 10-12 ימים. בנוסף, מספר גדול בהרבה של תאים עצביים מבשר מתגורר בSVZ לעומת DG, כפי שמעיד מספר כמעט פי 10 גדולים יותר של neurospheres שיכול להיות סוגיםטד מאזור זה (SVZ: 1,173 ± 74.9 לעומת DG: 145.3 ± 26.4, p = &lt;0.0001, n = 10 חיות לכל קבוצה; איור 2 א). מחקרים הראו כי התאים המבשר בתוך SVZ וDG להגיב לגירויים שונים. התאים המבשר בDG מופעלים על ידי סוגים מסוימים של למידה מרחבית ועל ידי גירויים כגון העשרה סביבתית ופעילות גופנית, ואילו התאים המבשר SVZ מופעלים על ידי למידת חוש הריח והעשרת חוש הריח. עולה בקנה אחד עם זה, אחד מאיתנו (TLW) הוכיח בעבר כי DG מכיל אוכלוסייה של גזע רדום ובתאים שיכולים להיות מופעל על ידי עירור עצבי 15-18. בניגוד לכך, מצאנו כי התאים המבשר SVZ להגיב בצורה שונה לגמרי לגירוי זה, עם ירידה במספר neurosphere בתגובה לdepolarizing רמות של KCl 17. הנה, יש לנו חזרנו על הניסוי, ציפוי מחצית מהתאים המבודדים הנגזרים מSVZ וDG של individual בעלי חיים בdepolarizing רמות של KCl ואת החצי השני ברמות KCl שליטה. אנו מדגימים, כמו בעבר, שבזמן שהתאים המבשר DG מופעלים על ידי שלילת קוטביות (101.2 ± 17.4 לעומת 184.8 ± 12.5, p = 0.005, n = 5 בעלי חיים), ההתפשטות של התאים שמקורם-SVZ היא למעשה ירד משמעותי ( 368.0 ± 62.9 לעומת 266.6 ± 41.6, p = 0.02, n = 5 בעלי חיים; איור 2). כדי לאשר את הפוטנציאל לטווח ארוך, אחד המאפיינים העיקריים של תאי גזע אמיתיים, neurospheres בודדת או תרבויות monolayer חסיד חייב להיות מסוגל התרחבות מורחבת כלומר מעל לפחות 10 מעברים. בכל מעבר, בעקבות הכנת השעיה תא בודד, מספר התאים נספר וההתרחבות של פי מחושבת. בסך הכל התא התיאורטי מחושב לאחר מכן על ידי הכפלה של פי ההתרחבות במהלך מעבר שעל ידי סך הכל התיאורטי מהמעבר הקודם. זה חד פעמי<html> layed כגרף קו עם מספר המעבר זמם נגד log10 בסך הכל מספר התא התיאורטי (ראה דוגמא איור 3). כדי לאשר multipotentiality, יכולים להיות מובחנת שתי תרבויות monolayer וneurospheres ידי נסיגת mitogen ויוצגו ללהצמיח שני נוירונים, וגליה (איור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> יכולים להיות מתורבת איור 1 תאים מבשר עכבר מבוגרים כתרבויות monolayer חסיד (א) או כneurospheres (B: SVZ, C: DG)... בר סולם הוא 50 מ&quot;מ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> &quot;Src =&quot; load/51225/51225fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. באופן משמעותי יותר neurospheres נוצרת מSVZ לעומת DG של עכברים בודדים (א &#39;). התאים המבשר SVZ וDG מגיבים באופן שונה לשלילת קוטביות במבחנה (ב &#39;). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> איור 3. כדי לאשר הגברה לטווח ארוך, neurospheres מורחבת במשך 10 מעברים. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> איור 4. יכולה להיות מובחנת neurospheres לbIII-tubuנוירונים לין + (: אדום), GFAP האסטרוציטים + (: ירוק), O4 + oligodendrocytes (B: אדום) וMap2ab + נוירונים (C: אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

מיון תא של תאי גזע ועצביים ממבוגרי עכבר Subventricular האזור וחי-הדמיה של Dynamics תא המחזור שלהם

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

עירור החיצוני של הנוירונים באמצעות שדות חשמליים ומגנטיים ב אחד&quot; ותרבויות דו ממדים

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...