Name: one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice
Uploaded: 2014-02-25T14:15:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

TLW поддержали Марии Кюри международного входящего стипендий. Эта работа была также финансируется из основного институционального финансирования, Bundesministerium für Bildung и Forschung (BMBF) финансирование и частично при поддержке приоритетного исследовательской программы (SFB) 655 ГК. Авторы хотели бы поблагодарить Энн Karasinsky для ухода и содержания всех животных, используемых в данном исследовании и Одетты Лейтер, Сюзанн Ruhwald, Фанни Беме, и Ричард Ветцель для культуры клеток и помощи микроскопии.

<ol>
	<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-2-responsive+neuronal+progenitors+reside+in+proliferative+and+quiescent+regions+of+the+adult+rodent+brain.">FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain.</a> Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).</li><li>Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+precursor+cells+and+neuroblasts+from+embryonic+and+adult+central+nervous+system.">Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system.</a> Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).</li><li>Bez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+neurosphere-forming+cells:+morphological+and+ultrastructural+characterization.">Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization.</a> Brain Res. 993, 18-29 (2003).</li><li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons.">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PLoS One. 2, (2007).</li><li>Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+and+nonclonal+growth+of+adult+neural+stem+cells.">Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells.</a> Stem Cells. 25, 871-874 (2007).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).</li><li>Freund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+individuality+in+genetically+identical+mice.">Emergence of individuality in genetically identical mice.</a> Science. 340, 756-759 (2013).</li><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse.">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres-+re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+latent+stem+cell+population+is+retained+in+the+hippocampus+of+transgenic+Huntington's+disease+mice+but+not+wild-type+mice.">The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+stimulates+precursor+cells+in+the+adult+mouse+hippocampus.">Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+stem+and+progenitor+cells+in+the+hippocampus+are+activated+by+neural+excitation.">Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation.</a> J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).</li><li>Walker, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominin-1+allows+prospective+isolation+of+neural+stem+cells+from+the+adult+murine+hippocampus.">Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus.</a> J. Neurosci. 33, (2013).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li><li>Babu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+enriched+monolayer+cultivation+of+neural+precursor+cells+from+mouse+dentate+gyrus.">A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus.</a> Front. Neurosci. 5, 89 (2011).</li><li>Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+molecular+identity+of+cells+in+the+adult+subventricular+zone+in+vivo+and+after+expansion+in+vitro.">Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).</li><li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres.">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Эта статья представляет собой подробный протокол для инициирования нейронных культур-предшественников, как в качестве прикрепленных монослоев и нейросферы, от двух основных нейрогенных областей мозга взрослых мышей. Есть ряд важных моментов, которые необходимо иметь в виду, при попытке любой из этих культурах клеток. Во-первых, выбор метода диссоциации очень важно и ткань зависимыми. В наших руках, 0,05% трипсин-ЭДТА является очень эффективным для диссоциации SVZ ткани и приводит к более высоким числом нейросферах, чем при использовании методики диссоциации папаин основе. Для диссоциации DG ткани однако, мы настоятельно рекомендуем папаин основе диссоциации подход. Когда непосредственно сравнении двух методов диссоциации на ткани DG, мы наблюдали значительно более низкий выход жизнеспособных клеток и примерно в 10 раз меньше нейросферы при использовании трипсина. Эта разница в диссоциации может быть связано с разницей в ткани СОСТАВн между двумя регионами. Компактный ткань ГД окружен обширным нейропиля и обширные повреждения клеточных процессов может произойти во время диссоциации. Второй важный момент, который следует отметить, что, в то время как нейросфера анализ может быть полезным, чтобы сделать количественные заявления о количестве клеток-предшественников, присутствующих в данном образце ткани, некоторая осторожность, однако, должны быть использованы в интерпретации этих абсолютных цифрах. Слияние нейросферы может быть основным отягощающим фактором. Несколько исследований показали, что нейроны являются весьма подвижны и могут сливаться, даже в то, что якобы &quot;клоновых&quot; условия 7,19. Результирующая частота нейросфера может быть очень зависит от факторов, включая компонентов среднего, порядок вскрытия и процесса диссоциации. Даже между опытными обработчиков некоторые различия в количестве нейросферы, полученных от якобы идентичных образцов очевидно (см. Рисунок 1a.) Более полезным, является прямое сравнение частоты предшественника между двумя заданными образцов (то есть контроль против лечить или дикого типа против нокаут), обработанных тем же лицом в течение одного эксперимента, а не количественный заявления общего числа клеток-предшественников число. Решая, какой из двух методов культуры больше всего подходит для конкретного эксперимента, важно отметить, что эти две системы культуры различаются по однородности типов клеток, генерируемых. По сравнению с пролиферирующих прилипшие культур клеток, которые показывают пул достаточно однородной клеточной предшественник (~ 98% клеток Sox2 +) 20, нейросферы более неоднородны и содержат, а также пролиферирующие клетки-предшественники, дифференцированные нейроны, астроциты и 21,22. Важно, что нейросферы не культивировали в течение длительных периодов между проходами как чем больше нейросфера стать тем больше вероятность того, чтобы найти дифференцированные типы клеток в их ядре. Мы традиционно инициировать прилипшие однослойных нейронных культур-предшественников из DG ткани между 5-8 мышей. Таким образом, при попытке установить прилипшие однослойных культур из ГД или СВЗ одного мыши, все внимание должно быть принято во время процедуры ткани диссоциации для того, чтобы избежать чрезмерного гибель клеток, вызванную более перетирания ткани, или принимая продлен периоды времени между рассечения и заключительных шагов культивирования. Этот протокол описывает, впервые, генерация адгезивных культур монослой предшественников как из SVZ и DG индивидуальных животных. Есть много случаев, когда сравнение пролиферации предшественника и дифференциации должно быть сделано на одном основе животного. Они включают в себя возможность непосредственно сравнить DG и SVZ отдельных животных с использованием парных статистику и для сопряжения культуры данные с отдельных поведенческих или физиологических данных 9. Холост культуры животных также др.низкий использование редких трансгенных животных, где возраст сопоставления пул 5-8 доноров в культуре не представляется возможным, а также уникальных животных (например, F2 крестов или из животных, выращенных) для исследований генетических ассоциаций.

Нейросфера анализ 1,2 и приверженцем монослой культуры 3,4, как развитых, так в начале 1990-х, до сих пор остаются золотым стандартом в пробирке нервных стволовых клеток анализов. В этих анализах основной ткани микро рассекали от конкретной области мозга, диссоциируют в суспензии отдельных клеток и культивировали в присутствии фактора роста эпидермиса митогены (EGF) и фактора роста фибробластов-2 (FGF2) с образованием либо свободно плавающего кластеры (нейросферы) или прилипшие монослоя. Обе системы имеют ряд преимуществ и недостатков и тщательного рассмотрения должно быть уделено вопросу, который должен решить, прежде чем тот или иной системы выбирается. Нейросферы позволяют простой считывание различий в числе клеток предшественника и потенциал. Кроме того, нейросферы также являются полезным инструментом для изучения внутренней спецификацию клеток при снятии с их нормальной внешней среды. ExtrinSIC сигналы могут быть изучены путем простого добавления фактор интереса к питательной среды и количественной количество и размер нейросферы генерируемых. Основным недостатком нейросферы однако, является то, что они образуют свою собственную нишу, с клетками в центре нейросферы (особенно крупные нейросферы), являющихся более дифференцированы, чем на поверхности 5. Нейросферы содержат смесь стволовых клеток, совершенных предшественников и дифференцированных клеток и межклеточных взаимодействий в рамках нейросферы противодействия содержание стволовых клеток. Вот почему нейросферы содержать только небольшое количество истинных стволовых клеток 6-8. Приверженец культуры монослой также обеспечивают хорошую систему в пробирке для моделирования в естественных условиях распространения. Адгезивные культуры, в которой клетки остаются более изолированными и однородной, может устранить гетерогенный характер нейросфера. В этих условиях роста клетки-предшественники размножаться RAPIжественной и почти все клетки делятся и выразить характерные нервные маркеры предшественников нестин, Sox2, и BLBP. Основным недостатком системе культуры монослоя по сравнению с нейросфера анализа является то, что отдельные предшественники полученные клоны не могут быть проверены и количественно. Недостатком большинства протоколов для обоих типов культур была необходимость использовать относительно большое количество животных, поскольку выход из стратегий изоляции часто было бедных. В то же время, стало ясно, что взрослый нейрогенез способствует индивидуализации мозга 9, в результате чего необходимость в индивидуальных исключая виво моделей. Эти потребности могут быть удовлетворены с помощью &quot;один-мышь-один-культуры&quot; протоколами, как описано в настоящем докладе. На следующем рисунке протокол описывает одновременное поколение нейронных культур-предшественников как из СВЗ и DG отдельных животных или как приверженец мonolayers или как нейросферы. Генерирование культур от отдельных животных особенно полезно, когда сравнение между индивидуально обработанных животных или различных индивидуальных трансгенных или мышами дикого типа не требуется. Этот протокол содержит подробные инструкции для одновременного микродиссекции СВЗ и DG регионов от взрослых мышей, их разобщенность в суспензии отдельных клеток, культуру в пробирке, как ни приверженцем культур однослойных или нейросферы и анализа multipotentiality и долгосрочным потенциалом, два кардинала свойства костной истинного стволовых клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

Нейросфера анализ и приверженец системы культуры монослоя являются ценными инструментами для определения потенциала (пролиферации или дифференцировки) взрослых нервных стволовых клеток в пробирке. Эти анализы могут быть использованы для сравнения потенциал предшественника клеток, выделенных из генетически различных дифференциально или обработанных животных, чтобы определить воздействие внешних факторов на пролиферацию нейронных клеток-предшественников и дифференциации и генерировать нервные линии клеток-предшественников, которые могут быть проанализированы в течение непрерывных проходов. Нейросфера анализ традиционно используется для пост-специальной идентификации стволовых клеток, в первую очередь из-за отсутствия окончательных маркеров, с которой они могут быть выделены из основного ткани и имеет главное преимущество дает быстрый оценку количества клеток предшественника в мозговой ткани происходит от отдельных животных. Адгезивные культуры монослой, напротив, традиционно не использовали для сравнения пролиферацию между отдельными животными, Так как каждый культура обычно инициируют с комбинированной ткани между 5-8 животных. Тем не менее, у них есть большое преимущество, что, в отличие от нейросферы, они состоят из преимущественно однородной популяции клеток-предшественников и полезны для следующих процесса дифференцировки в одиночных камерах. Здесь мы описываем, в деталях, генерацию нейросфер культур и, в первый раз, прилипшие культур от отдельных животных. Это имеет много важных последствий, включая парный анализ пролиферации и / или дифференцировки потенциала как в субвентрикулярной зоне (SVZ) и зубчатой ​​извилине (DG) обработанных или генетически различных линий мышей, а также к значительному сокращению использования животных.

Хотя два нейрогенные области мозга взрослых мышей как содержат нервные клетки-предшественники, эти клетки могут вести себя совершенно по-разному при культивировании в лабораторных условиях. Адгезивные культуры монослой, полученные от обеих областях появляются морфологически неразличимы (рис. 1А), однако, SVZ-производные прилипшие культуры размножаться быстрее и должны быть пассируют, в среднем, 1-2 дней раньше, чем те, которые получены из DG. Как нейросферы, СВЗ-производные клетки-предшественники также размножаются быстрее и более крупные нейросферы (Рисунок 1б), чем DG-производных клеток-предшественников (рис. 1в). В то время СВЗ-производные нейросферы обычно подсчитывают через 6-7 дней в культуре, DG-производные нейросферы обычно количественно через 10-12 дней. Кроме того, гораздо большее число нейронных клеток-предшественников находиться в SVZ по сравнению с ГД, о чем свидетельствует почти в 10 раз большего числа нейросферах, которые могут быть родыТед из этого региона (СВЗ: 1173 ± 74,9 против DG: 145,3 ± 26,4, р = &lt;0,0001; п = 10 животных в группе; 2А). Исследования показали, что клетки-предшественники в пределах SVZ и DG реагировать на различные стимулы. Клетки-предшественники в ГД активируются конкретные виды пространственного обучения и стимулы, такие как охрана окружающей обогащения и физической активности, в то время как СВЗ клетки-предшественники активируются обонятельной обучения и обонятельной обогащения. В соответствии с этим, один из нас (TLW) ранее показали, что DG содержит население скрытой стебля и клеток-предшественников, которые могут быть активированы нервного возбуждения 15-18. В противоположность этому, мы обнаружили, что клетки-предшественники SVZ совершенно по-разному реагировать на этот раздражитель, с уменьшением числа нейросфера в ответ на уровни деполяризации KCl 17. Здесь мы повторили этот эксперимент, покрытие половину выделенных клеток, полученных из СВЗ и ГД индividual животных в деполяризующий уровни KCl, а другая половина в уровнях KCl управления. Мы демонстрируем, как и ранее, что в то время как клетки-предшественники DG активируются деполяризации (101,2 ± 17,4 против 184,8 ± 12,5, р = 0,005, п = 5 животных), распространение СВЗ-клеток, полученных из фактически значительно сократилось ( 368.0 ± 62.9 против 266,6 ± 41,6, р = 0,02, N = 5 животных; Рисунок 2B). Чтобы подтвердить долгосрочный потенциал, один из кардинальных особенностей истинного стволовой клетки, отдельных нейросферы или прикрепленных культурах монослоя должны быть способны длительного расширения т.е. по меньшей мере 10 пассажей. На каждом проходе, после получения одного клеточной суспензии, число клеток подсчитывали и кратное увеличение рассчитывается. Общая теоретическая клеток затем вычисляется путем умножения кратное увеличение в течение этого прохода теоретической итогом с предыдущем абзаце. Это DISP<html> уложены в виде линейного графика с числом пассажей в виде зависимости от log10 от теоретического общего числа клеток (см. пример рисунок 3). Чтобы подтвердить multipotentiality, оба однослойные культуры и нейросферы могут быть дифференцированы по митогена вывода и быть показано, приводят к обоим нейронов и глии (рис. 4). <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> . Мыши клетки-предшественники Рисунок 1 взрослый можно культивировать как прилипшие культур однослойные (А) или как нейросферы (B: СВЗ, C: DG).. Бар шкала 50 мм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;Первоначально&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; Рисунок 2. Значительно больше нейросферы сгенерированы СВЗ по сравнению с ГД одной мышей (А). Клетки-предшественники СВЗ и DG-разному реагируют на деполяризации в пробирке (B). <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> Рисунок 3. Для подтверждения долговременную потенциацию, нейросферы расширена на протяжении более 10 пассажей. <img alt="Рисунок 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> Рисунок 4. Нейросферы могут быть дифференцированы в Biii-тубулин + нейроны (A: красный), GFAP + астроциты (A: зеленый), O4 + олигодендроциты (B: красный) и Map2ab + нейроны (C: красный). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a>

Watch this Scientific Journal Video about One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice at JoVE.com

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Здесь мы описываем подробный протокол для одновременной генерации нейронных клеточных культур предшественник, либо как прикрепленных монослоев или нейросферах, от субвентрикулярной зоны и зубчатой ​​извилине отдельных взрослых мышей.

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Выращивание нервные стволовые клетки из обычных и нетрадиционных областях мозга взрослых грызунов

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Внешнее возбуждение Нейроны Использование электрических и магнитных полей в одно- и двумерных культур

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Изоляции и культуры нервных стволовых клеток эмбриона мыши

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...