Name: an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

Figuren 1 en 2 werden eerder gepubliceerd in Free Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al.. 5) en hebben het auteursrecht van Elsevier. Dit werk werd ondersteund door de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), het Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, de Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), en USPHS GM087483 (KN ). BBQ is een doctoraal student ondersteund door een FAPESP fellowship.

1. C. elegans Groei <ol><li> Bereid 35 mm Nematoden Groei Media (NGM) agar platen geënt met OP50 bacteriën, volgens de standaard teeltmethoden 1. </li><li> Synchroniseer C. elegans door het plaatsen van 6 zwangere volwassenen op een geplaatste NGM plaat. Verwijder volwassenen na ~ 100 eieren gelegd (~ 3 uur). </li><li> Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 20 ° C, waarna de wormen ontwikkeld jonge volwassen stadium en zijn optimaal voor dit experiment. Alternatieve protocollen C. synchroniseren elegans worden elders 10 beschreven. </li></ol> 2. Materialen voor AS <ol><li> M9 buffer (22 mM KH 2PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4) worden gezuiverd van zuurstof door equilibreren met N2 (argon kan ook worden gebruikt) gedurende 30 min voorafgaand aan het experiment en bleef omringd door ijs. </li><li> Maak een klein gaatje (3 mmbreed) in het deksel van 1,5 ml microcentrifuge buizen waarin de wormen worden tijdens AS geplaatst. Het gat zorgt voor gasuitwisseling zonder het houden van het deksel open, omdat dit kan leiden tot overmatige media verdamping. </li></ol> 3. Anoxie / Honger <ol><li> Voer alle experimenten ten minste in drievoud. </li><li> Voeg 1 ml van RT, geoxygeneerde M9 buffer elke 35 mm plaat met jonge volwassen wormen gekweekt zoals hierboven beschreven. Let op dat het verwijderen van bacteriën uit de plaat (voeg M9 aan de randen waar bacteriën niet werden uitgezet). Na ~ 1 min de wormen moeten zwemmen in de M9. </li><li> Coat een 1 ml pipet tip met BSA door pipetteren en het verdrijven van een steriele 1% BSA-oplossing. </li><li> Neig de plaat zorgvuldig met de wormen in M9 buffer, verwijder de M9 uit dezelfde plaats waar het werd toegevoegd, en plaats de suspensie in de voorbereide microcentrifugebuizen. Laat rusten in ijs tot de wormen zijn gedaald tot beneden de buizen (1 ~-2 Min). </li><li> Haal het maximale bedrag van de M9 mogelijk zonder de wormen te verstoren van de buis (het verlaten van ongeveer 100 pl), voeg 1 ml van de zuurstof gespoeld en iced M9 en plaats de buis over ijs tot de wormen naar de bodem weer. Herhaal de laatste stap 3x. In de laatste wasbeurt, verwijder dan de M9 tot ~ 100 pi blijft in de buis. </li><li> Plaats de buizen met de wormen in zuurstofarme M9 in een zuurstofloze / zuurstofarme kamer (zie aanwijzingen hieronder, paragraaf 3.6.1) of, als alternatief, in een aangepaste gesloten verpakking (zie onderstaande instructies, paragraaf 3.6.2). <ol><li> Als een commerciële zuurstofloze / zuurstofarme kamer wordt gebruikt, laat wat gespoeld M9 in de kamer voordat stap 3.5 en herhaal stap 3.5 zodra de wormen zijn in de kamer. </li><li> Als een aangepaste kamer wordt gebruikt, wordt een gedetailleerde beschrijving van hoe een goedkope inrichting te creëren die eind van dit protocol is beschreven door een andere groep vooraf 11. In het kort: <ol&gt; <li> Maak twee gaten in een 250 ml Tupperware-achtige deksel en voeg buisconnectoren aan hen. Men zal worden gebruikt om het gasmengsel injecteren terwijl de andere het uitlaatgas in een waterbad wordt. </li><li> Plaats de wormen in de kamer en sluit de kamer met behulp van de deksel. </li><li> Gas met een constante N2 stroom (100 ml / min). </li><li> Plaats de container in een waterbad bij 26 ° C. Zorg ervoor dat de uitgang buis goed is ondergedompeld in water, zodat er geen lucht terugkeert en dat er geen lekken in het systeem (schijnbare door bellen die voortvloeien uit de kamer zelf). </li></ol></li></ol></li><li> Incubeer de wormen bij 26 ° C gedurende 20 uur. </li></ol> 4. Gesimuleerde Reperfusie <ol><li> Na 20 uur onder AS voorwaarden, verwijder de buizen uit de incubatiekamer in omgevingslucht. </li><li> Pipet C. elegans met een BSA-gecoate tip (zoals in stap 3.3) op een OP50 gezaaid 35 mm NGM plaat. Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende 24 uur.Hierna zal de wormen klaar gescoord worden. </li></ol> 5. Het identificeren van Dead Versus levende wormen <ol><li> Met behulp van een platina pick Druk licht op de bovenkant van het hoofd van de worm. Levende wormen zal achteruit na aangeraakt te verplaatsen. Als de wormen zijn niet meer reageert, scoren als dood. Af en toe zal een worm niet achteruit te gaan, maar kan een kleine side-to-side beweging van het hoofd vertonen. Hoewel het technisch niet dood, deze wormen zijn bijna zeker te vervallen binnen enkele uren, en moet worden als dood. Als men te lang om te scoren de wormen wacht, kan de interne uitkomen van nageslacht optreden en deze &quot;zakken-of-wormen&quot; kunnen scheuren, waardoor het opsporen van de karkassen erg moeilijk. </li><li> Verwijder beide levende en dode wormen van de plaat zoals ze worden geteld om dubbele tellingen te vermijden. De levende wormen kunnen worden verplaatst naar een afzonderlijke plaat gedrag assays. De hoeveelheid levende wormen vergeleken met het totaal wordt weergegeven als% overlevende wormen (Figuur 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Touch Response Assay <ol><li> Een gedetailleerde beschrijving van dit protocol is gepresenteerd in Hart, Anne C., ed.. Gedrag (3 juli 2006), WormBook, ed.. De C. elegans Research Gemeenschap, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Te scoren voor touch reactie, identificeren wormen die bewegen en licht raken de zijkant van het hoofd van de worm (in de buurt van het middelste deel van de keelholte) met een wimper pick (Figuur 3). </li><li> Als de worm schuift naar achteren, scoren zo reageren, zo niet, scoor reageert niet (Figuur 1B). Herhaal deze stap 10-15x voor elke worm met 10 sec interval. Probe tenminste 10 wormen in elke groep om nauwkeurige gegevens. Dezelfde test kan worden gebruikt om vooruit te beoordelen motorische veranderingen na lichte aanraking met het achterste lichaam muur. Zorg ervoor dat de kop of staart van de worm niet aan te raken, want dit bevordert een duidelijke gedrag. </li><li> Ten slottecollectieve genetische controle stammen [N2 Bristol wild-type voor positieve, mec (mechanosensorische) mutant voor negatieve - bijvoorbeeld CB1338 mec-3 (e1338) IV] om de kracht waarmee de wormen raken kalibreren. Te hard van een stimulatie zal een gedragsmatige respons op te wekken in mec mutanten, te weinig zal een effect niet ontlokken in wildkleur N2 controles. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale Wijzigingen <ol><li> Te visualiseren bericht AS neuronale wijzigingen, gebruik dan een stam die GFP uitdrukt in het touch-reagerende mec neuronen 4,5. Deze neuronen lange uitlopers die langs de lichaamswand en worden gemakkelijk behaald morfologische afwijkingen. Daarnaast kan de morfologische informatie geïntegreerd gedragsmetingen neuronale functie, zoals hierboven beschreven. Een stam die kan worden gebruikt voor dit doel TU2583, die verkrijgbaar is uit de C. elegans Genetica Center en bevat de uIs25 geïntegreerde transgen GFP weerm de mec-18 promotor, of alternatief TU2562, waarin een geïntegreerde mec-3 :: GFP-fusie bevat. </li><li> Bereid een agarose pad. <ol><li> Smelt 2% agarose in water, breng aan M9 1x met een 10x voorraad, en de oplossing te handhaven op 70 ° C. </li><li> Breng een druppel (~ 20 pi) van deze oplossing op een glasplaatje (25 mm x 75 mm) die is geplaatst tussen twee dia&#39;s, die elk een stuk tape op de onderzijde. </li><li> Plaats een definitieve glasplaatje loodrecht op de eerste bovenop de 2% agarose oplossing en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Dit zou een pad dat de dikte van de band vormen. </li><li> Verwijder de bovenste dia en voeg 10 ul van M9 die 0,1% tetramisol, die de wormen zal immobiliseren. </li></ol></li><li> Verplaats enkele (~ 10) leven wormen op de 2% agarose glijbaan. Plaats een dekglaasje over hen en visualiseren GFP met behulp van een fluorescentie microscoop onder een 100x objectief met de juiste belichting. </li><li> Beschadigdeneuronen een cytosolische membraan parelsnoer patroon in de processen uit meerdere punctum (figuur 2A) en / of afwijkingen waarin zich lijkt te breken (figuur 2B) tonen. Telling punctum en vertonen in zowel neuronen per worm, met in totaal ten minste 10 wormen. </li></ol> 8. -Lab gemaakt Hypoxic Kamer <ol><li> Een Tupperware-stijl, afsluitbaar, luchtdichte container kan worden uitgerust als een zuurstofloze kamer. Zorg een container die zo klein mogelijk te kiezen. Een kleine container creëert een hypoxische omgeving sneller en gemakkelijker te passen in het waterbad (figuur 4). </li><li> Maak twee gaten in het deksel (kan worden gedaan met een schroevendraaier of door verhitting pincet en dwingen in het deksel) en plaats een plastic of metalen connector die de buis (figuur 5A) past. Gebruik lijm die onder water kan worden gebracht en ook wordt hard na drogen verplaatsing voorkomende connector en daarmee de kans op lekken (Figuur 5B) verminderen. </li><li> De houder moet in het waterbad worden geplaatst dat het volledig is ondergedompeld (figuur 4). Om de container te dompelen, gebruik dan een fles gewicht of een snoekduik gewicht. </li><li> Een pijpverbindingen worden gebruikt om een gasmengsel te voeren en de andere buis fungeert als een drukontlasting, daarom moet het onder water gelaten zodat de houder is afgesloten van de externe omgeving (figuur 4). </li><li> De samenstelling van de lucht kan worden gemoduleerd met behulp van aangepaste gemaakt gas, mass flow controllers of een apparaat dat de gewenste gassen mengt. De gasstroom moet worden gecontroleerd, zoals high flow overmatige verdamping kan creëren. Bijvoorbeeld, in een 250 ml beker, 100 ml / min van gas goede ruimte voor de wormen en een geschikte flux verschaffen. </li><li> De lengte van de buis moet tot een minimum worden beperkt, aangezien zij gasdoorlatend, kan eenllowing de ingang van O 2. Het is belangrijk om te voorkomen dat het gebruik van siliconen, Tygon buizen omdat deze materialen zijn doorlaatbaar voor gasuitwisseling. Wij verkiezen polypropyleen of nylon buizen. Glazen of metalen buis handhaven van de gassen goed, maar zijn ook moeilijker om mee te werken. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia.">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li><li>Ba Scott, ., Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin/IGF+receptor+homolog+DAF-2.">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li><li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion.">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li><li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li><li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans.">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li><li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans.">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li><li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans.">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS.">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

AS grote schaal gebruikt in C. elegans model IR letsel. Enkele belangrijke punten moet worden benadrukt voor dit protocol: C. elegans zijn bestand tegen een breed scala van blessures, rechtvaardigen de noodzaak voor 3 gelijktijdige beledigingen (hitte, honger en anoxie) tot de dood te bereiken met behulp van dit systeem. Anoxia alleen niet de wormen te doden in dit venster van de tijd 14. Bovendien temperatuurstijging vormt een extra belasting, dus is het belangrijk om de voet te volgen. Strikt genomen, is honger niet significant bij aan de mate van sterfte 7, per se, maar het blijkt variabiliteit te verminderen onder experimentele replicaten. Aangezien er aanzienlijke variatie van dag tot dag kan zijn, is het uiterst belangrijk te vergelijken met monsters lopen direct parallel en experimenten over meerdere dagen herhaald. In het algemeen worden de resultaten gemeten drie afzonderlijke platen van 50-100 wormen / experimentele groep en dit zijn den gemiddeld en beschouwd als een enkele experimentele repliceren. In het algemeen, tussen de zeven en negen herhalingen voldoende om te bereiken of uit te sluiten statistische significantie te zijn. Het ontwikkelingsstadium van de wormen in het experiment moet ook zorgvuldig worden gecontroleerd als de gevoeligheid van verschillende fasen AS schade aanzienlijk 15,16 varieert. Het gebruik van jongvolwassenen standaard en larvale stadium (L3 en L4) wormen lijken beter bestand tegen de schadelijke effecten van AS (ongepubliceerde gegevens) zijn. Dit protocol biedt twee manieren om de experimenten uit te voeren, de ene met een lab gemaakt apparaat (met behulp van Tupperware type containers en gas ingang 11) en andere met behulp van een commercieel zuurstofarme kamer 4,6. Anoxie kan worden bereikt met andere middelen die de zuurstof consumeren, zoals elders beschreven 13,17. Het gebruik van alternatieve technieken om een ​​zuurstofarme omgeving te creëren kan de AS incubatietijd nodig te wijzigenom de gewenste hoeveelheid van dood maken. Gericht op ~ 20% overleving is een ideaal uitgangspunt voor het bestuderen van beschermende maatregelen, terwijl 80% is eveneens ideaal voor interventies die de schadelijke effecten van AS verergeren. Een ander belangrijk nadeel is het moment waarop de waarnemer scores dood / levend wormen. Als de tijd voor analyse wordt verlengd na 24 uur, kunnen de gegevens misleidend omdat dode wormen steeds moeilijker te identificeren. Dit kan het gevolg worm karkassen worden relatief transparant in de tijd, maar ook aan het feit dat bevruchte embryo&#39;s kunnen ontwikkelen in nageslacht postmortale binnenzijde van de karkassen en verstoren ze als ze zich voordoen. De analyse van neuronale morfologie kunnen worden gemodificeerd om te kijken naar eiwit expressie 18, nucleaire fragmentatie en 4 andere parameters 19 te vervangen door een worm stam die de juiste genetisch gecodeerde marker expressie. Een laatste opmerking is dat de visualisatie van deneuronale processen moeten worden uitgevoerd dan 30 minuten na plaatsing van de wormen op de dia. Dieren onder narcose gehouden op dia&#39;s voor langere periodes kan AS-onafhankelijke schade vertonen. Pas de hoeveelheid dieren per dia afhankelijk van de tijd die nodig is om te volgen en te analyseren.

C. elegans is een nematode die is wijd goedgekeurd als een meercellige eukaryote modelorganisme sinds de introductie door Brenner 1. Het is een goedkoop, eenvoudig en veelzijdig model, waarmee gemakkelijk verbanden tussen genetische veranderingen en fenotypische veranderingen 2. Ischemie wordt gekenmerkt door een gebrek aan voedingsstoffen en zuurstof aan een weefsel, gevolgd door reperfusie, wanneer een uitbarsting van zuurstofradicalen geproduceerd 3 en de meeste schade optreedt. In 2002, een model van ischemie / reperfusie (IR) in C. elegans is ontwikkeld 4 met het indienen van de hele worm aan zuurstoftekort, voedingsstoffen ontbering en hittestress voor ongeveer 20 uur, gevolgd door 24 uur onder normale omstandigheden. Hoewel dit model technisch een anoxie-verhongering (AS) staat, celdood via mechanismen die geconserveerd in zoogdieren, met inbegrip van schade geïnduceerd door oxidanten tijdens reperfusie &lt;sup&gt; 5. Bovendien vergelijkbaar zoogdier IR, beschadigd is door AS in C. elegans kan worden voorkomen door ischemische preconditionering 6,7 of verdoving preconditionering 8,9. Onderstaande protocollen demonstreren hoe IR bootsen in C. elegans met behulp van de AS-model, hoe om te scoren morfologische en gedragsmatige afwijkingen die het gevolg zijn van AS, en hoe u het protocol aan te passen op een manier die het mogelijk maakt het experiment uit te voeren met een lagere initiële investering met behulp van een op maat gemaakt, eenvoudig geconstrueerde kamer alternatief .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protocollen voor anoxia / verhongering in het genetisch modelorganisme C. elegans simuleren ischemie / reperfusie. Wormen worden gescheiden van bacteriële voedsel en onder anoxie geplaatst voor 20 uur (gesimuleerde ischemie) en vervolgens verplaatst naar een normale atmosfeer met voedsel (gesimuleerde reperfusie). Deze experimentele paradigma leidt tot hogere sterfte en neuronale schade en technieken worden aan de levensvatbaarheid van organismen, wijzigingen in de morfologie van aanraking neuron processen en drukgevoeligheid, die gedrags uitgang van neuronale functie vertegenwoordigt beoordelen. Ten slotte wordt een methode voor het construeren van hypoxische incubators gebruik van gemeenschappelijke keuken opslag containers beschreven. De toevoeging van een massastroom besturingseenheid maakt wijzigingen aan te brengen het gasmengsel in de aangepaste incubators en een circulerend waterbad maakt zowel temperatuurregeling en maakt het gemakkelijk om lekken te identificeren. Deze methode biedt een goedkoop alternatief voor commercieelbeschikbare eenheden.

Het onderwerpen van C. elegans tot 20 hr AS bij 26 ° C in een speciaal laboratorium gemaakte incubatiekamer beschreven (Sectie 3.6.2) tot aanzienlijke mortaliteit (figuur 1A) 5. Latere fluorescente beeldvorming van punctum en breuken in de GFP gemerkte neuronenprocessen overlevenden bevestigde de aanwezigheid van morfologische afwijkingen (figuur 2). De overlevenden reageerde ook slecht op lichte body wall touch (Figuur 1B). Dit model is gebruikt door meerdere groepen te bestuderen hoe genetische aanleg, farmaceutische interventie, en metabole plasticiteit beïnvloedt als afhankelijke uitkomsten 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figuur 1. C. elegans overleving en aanraking reactie naAS. A) Percentage van de wormen die 24 uur na AS overleving vertonen. De N2 stam is het wild type genetische achtergrond, en KWN85 bevat een geïntegreerde transgen dat mec neuronen etiketten met GFP. B) Reactie op stimuli van levende C. raken elegans (N2 Strain) na AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figuur 2. Raak neuron wijzigingen na AS. Touch neuron (PLML en PLMR) afwijkingen zoals bochtig processen en breaks (A) of de accumulatie van GFP aggregaten in de processen (B) werden gecontroleerd in overlevende verdoofd C. eleg<html> ans na AS. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figuur 3. Wimper pick. Een samengestelde wimper pick. In het bijvoegsel, een detail van de wimpers vastgelijmd aan de tandenstoker hout. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figuur 4. -Lab gemaakt hypoxische kamer in het waterbad. Een gesloten container klaar om het experiment te starten. Pijlen geven de ingang en uitgang van gas en het gewicht wordt gebruikt om te voorkomen dat zwevende fles. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Details van de inwendige en uitwendige zijde van het deksel. A) Buitenzijde van het deksel, waarin de buis en de aansluiting aan de eerder gemaakte gat. B) Buitenzijde van het deksel, waarin de koppelstuk bevestigd aan de eerder gemaakte gat.

Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Een protocol wordt beschreven dat gebruikt anoxie / uithongering C. elegans model ischemie / reperfusie. Functionele resultaten omvatten een verhoogde mortaliteit, zichtbare afwijkingen in GFP-gelabelde neuronale processen, en verminderde gedragsreacties die neuronale functie nodig hebt.

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...