Name: an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

איורים 1 ו -2 היו שפורסמו בעבר בביולוגיה ורפואה ברדיקלים חופשיים (Queliconi et al. 5) ויש לי זכויות יוצרים שנערכו על ידי Elsevier. עבודה זו נתמכה על ידי Fundação דה Amparo א Pesquisa לעשות Estado דה סאו פאולו (FAPESP), Instituto Nacional de Ciencia דואר Tecnologia דה Processos חיזורם Biomedicina, Nucleo דה Apoio א Pesquisa דה Processos חיזורם Biomedicina, USPHS NS064945 (קן), וUSPHS GM087483 (KN ). מנגל הוא דוקטורנט נתמך על ידי מענק FAPESP.

1. ג elegans צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות 35 מ&quot;מ צמיחה נמטודות מדיה (NGM) אגר זרע עם OP50 חיידקים, כמו לכל שיטות טיפוח סטנדרטיות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן סי אלגנס ידי הצבת 6 מבוגרים הרה להולדת על צלחת NGM seeded. הסר את המבוגרים לאחר ~ 100 ביצים כבר הונחו (~ שעה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות במשך 3 ימים ב20 מעלות צלזיוס, ובשלב התולעים פיתחו לשלב בוגר צעיר והם אופטימליים לניסוי זה. פרוטוקולים אלטרנטיביים לסינכרון ג elegans מתוארים במקומות אחרים 10. </li></ol> 2. חומרים לAS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ M9 (22 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 42 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) צריך להיות מטוהר של חמצן על ידי equilibrating עם N 2 (יכול לשמש גם ארגון) במהלך 30 דקות לפני הניסוי וכל זמן מוקף בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור קטן (3 מ&quot;מרחב) במכסה של 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות שבתולעים יוצבו במהלך AS. החור מאפשר חילוף גזים ללא שמירה על המכסה פתוח, כמו זה יכול להוביל לאידוי תקשורת מוגזם. </li></ol> 3. אנוקסיה / רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את כל הניסויים לפחות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של RT, חיץ M9 מחומצן לכל צלחת 35 מ&quot;מ המכילה תולעים בוגרות צעירות גדלו כפי שתואר לעיל. להיות זהיר, כדי למנוע הסרת חיידקים מהצלחת (להוסיף M9 לקצוות שבו חיידקים לא זורעים). לאחר ~ 1 דקות התולעים צריכים להיות שוחים בM9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל קצה פיפטה 1 מיליליטר עם ארגון ה-BSA על ידי pipetting וגירוש פתרון BSA 1% סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטות את הצלחת המכילה את התולעים בחיץ M9 בזהירות, להסיר M9 מאותו המקום שבו הוא הוסיף, ולמקם את ההשעיה בmicrocentrifuge הצינורות שהוכנו מראש. תן לנוח בקרח עד התולעים ירדו לחלק התחתון של הצינורות (~ 1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסכום המקסימאלי של M9 האפשרי מבלי להפריע לתולעים מהצינור (שעזב סביב 100 μl), להוסיף 1 מיליליטר של M9 וקר-מטוהר החמצן ובמקום צינור על קרח עד התולעים ליישב לתחתית שוב. חזור על 3x השלב האחרון. בכביסה האחרונה, להסיר M9 עד ~ 100 μl נשאר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות עם התולעים בM9 deoxygenated בתוך תא חוסר חמצן / anoxic (ראה הוראות שלהלן, סעיף 3.6.1), או לחלופין, למכל אטום מותאם אישית (ראו הוראות שלהלן, סעיף 3.6.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם קאמרי anoxic / חוסר חמצן מסחרי הוא לשמש, להשאיר כמה M9 מטוהר בתוך החדר לפני שמתחיל שלב 3.5 וחזור על שלב 3.5 פעם התולעים בתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם קאמרי מותאם אישית הוא לשמש, תיאור מפורט של איך ליצור מנגנון עלות נמוכה מוצג בסוף הפרוטוקול זה ותואר על ידי קבוצה אחרת בעבר 11. בקצרה: <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חורים במכסת 250 מיכל מיליליטר טאפרוור מהסוג ולהוסיף מחברים צינור אליהם. אחד ישמש להזריק את תערובת הגז ואילו השני יהיה יציאת הגז לתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התולעים אל תוך החדר ולאטום את החדר באמצעות המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז עם N 2 זרימה מתמדת (100 מיליליטר / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכל בתוך אמבט מים ב26 ° C. ודא שצינור היציאה הוא שקוע היטב במים ולכן אין החזרי אוויר ושאין דליפות במערכת (לכאורה על ידי בועות הנובעות מהחדר עצמו). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התולעים ב26 מעלות צלזיוס למשך 20 שעה. </li></ol> 4. Reperfusion המדומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 20 שעות בתנאי AS, הסר את הצינורות מתא הדגירה לאוויר חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ג elegans עם טיפ מצופה-BSA (כמו בשלב 3.3) על גבי OP50 זורעים 35 מ&quot;מ צלחת NGM. דגירה הצלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.אחרי זה, התולעים יהיו מוכנים להיות קלע. </li></ol> 5. זיהוי המלח נגד תולעים בשידור חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות איסוף פלטינה, בקלילות לגעת בחלק העליון של הראש של התולעת. תולעים חיים יעברו לאחור לאחר שנגע. אם התולעים nonresponsive, להבקיע מת. לעתים, תולעת לא תזוז אחורה, אך עשוי להפגין תנועת ראש מצד לצד קל. אמנם לא מבחינה טכנית מת, התולעים האלה הם כמעט בטוחים לפוג תוך מספר שעות, וצריכים להיות הבקיע כמת. אם מחכה יותר מדי זמן כדי לצבור התולעים, בקיעה פנימית של צאצאים יכולה להתרחש ו&quot; שקיות של תולעים &quot;אלה יכולים להיקרע, מה שהופך את איתור הפגרים קשים מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שני תולעי החיים ומתים מהצלחת כפי שהם נספרים להימנע מספירה כפולה. ניתן להעביר את התולעים חיים לצלחת נפרדת כדי לבצע מבחני התנהגותיים. כמות תולעי חיים ביחס לסך הכל מיוצגת כ% מתולעים ששרדו (איור 1 א </strong&gt;). </li></ol> 6. לגעת Assay תגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיאור מפורט של פרוטוקול זה הוצג בהארט, אן ג, ed. התנהגות (3 יולי 2006), WormBook, ed. ג elegans מחקר הקהילה, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבקיע למגע תגובה, לזהות תולעים שנעים וקל לגעת בצד של הראש של התולעת (בסמוך לחלק האמצעי של הלוע) עם בחירת עפעף (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התולעת נעה אחורה, ציון מגיב כמו, אם לא, ציון nonresponsive כ( איור 1). חזור על שלב 10-15x זה עבור כל תולעת עם 10 מרווחי שניות. לחקור לפחות 10 תולעים בכל קבוצה יש את הנתונים מדויקים. אותו assay יכול לשמש כדי להעריך קדימה שינויי locomotory הבאים במגע קל לקיר הגוף האחורי. הקפד שלא לגעת בראש או זנב של התולעת, שכן זה מעורר התנהגות מובחנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, בשנתזנים של חברה בקרה גנטית [N2 בריסטול wild-type לMEC מוטציה חיובית, (mechanosensory) לשלילי - למשל CB1338 MEC-3 (e1338) IV] לכייל את הכוח שעם לגעת בתולעים. מדי קשה של גירוי יהיה לעורר תגובה התנהגותית במוטנטים MEC, מעט מדי לא לעורר השפעה בבקרת N2 wildtype. </li></ol></li></ol> 7. עצבי שינויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש פוסט כשינויים עצביים, השתמש מתח המבטא GFP בתאי עצב MEC להגיב בנגיעה 4,5. יש נוירונים אלה תהליכים ארוכים שרצים לאורך קיר הגוף ובקיע מומים מורפולוגיים. בנוסף, המידע המורפולוגיים יכול להיות משולב עם מדדי התנהגותיים של תפקוד עצבי, כפי שתואר לעיל. זן אחד שיכול לשמש למטרה זו הוא TU2583, אשר זמין מג מרכז לגנטיקת elegans ומכיל transgene המשולב uIs25 להביע GFP לכאן ולכאןמ &#39;אמרגן MEC-18, או לחלופין TU2562, המכיל MEC-3 :: GFP היתוך משולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כרית agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסים 2% agarose במים, מביא ל1x M9 עם מלאי 10x, ולתחזק את הפתרון ב70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה (~ 20 μl) של פתרון זה בשקופית זכוכית (25 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ) שהושמה בין שתי שקופיות אחרות, כל אחד מהם יש חתיכת קלטת אחת בצד התחתון שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות זכוכית סופיות בניצב הראשון על גבי פתרון agarose 2%, ולתת לו להתקרר ב RT. זה אמור ליצור משטח שהוא בעובי של הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופית העליונה ולהוסיף 10 μl של M9 המכיל tetramisole 0.1%, אשר יהיה לשתק את התולעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר חלק (~ 10) לחיות תולעים על 2% שקופיות agarose. מניחים coverslip עליהם ולדמיין את ה-GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מטרת 100X עם התאורה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פגוםנוירונים יציגו מחרוזת cytosolic קרום של דפוס פנינים בתהליכים, המורכבת מ&quot;פונקטום המרובים (איור 2 א), ו / או מומים שבו התהליכים מופיעים להיות שבורים (איור 2). רוזן &quot;פונקטום וליקויים בשני נוירונים לכל תולעת, תוך שימוש בסך של לפחות 10 תולעים. </li></ol> 8. תוצרת מעבדת Hypoxic קאמרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגנון טאפרוור, מיכל סגר, אטום ניתן retrofit כתא anoxic. תשמור על עצמך כדי לבחור מיכל שהוא קטן כמו אפשרי. מיכל קטן יוצר סביבת חוסר חמצן מהיר יותר וקל יותר להשתלב באמבט המים (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות שני חורים על המכסה (ניתן לעשות זאת עם מברג או על ידי חימום מלקחיים ומאלצים לתוך המכסה) והכנס את מחבר פלסטיק או מתכת שמתאים לצינורות (איור 5 א). השתמש בדבק שיכול להיות ממוקם מתחת למים, וגם מקבל קשה לאחר ייבוש, הימנעות תנועה שלהמחבר ולכן צמצום האפשרות של זליגה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכל צריך להיות ממוקם בתוך אמבט המים, כך שהוא שקוע לחלוטין (איור 4). לטבול את המכל, השתמש במשקל בקבוק או במשקל צלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד מחיבורי הצינור ישמש להציג את תערובת גז והצינור האחר יפעל כהקלה בלחץ, ולכן הוא צריך להישאר מתחת למים, כך שהמכל מסוגרת מהסביבה החיצונית (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב האוויר יכול להיות מווסת על ידי שימוש בגז בהתאמה אישית, בקרי זרימה המוניים או כל מנגנון שמערבב את הגזים הרצויים. זרימת הגז צריכה להיות מבוקרת, כמו זרימה גבוהה יכולה ליצור אידוי מוגזם. לדוגמא, במכל מיליליטר 250, 100 מיליליטר / דקה של גז תספק מרחב טוב לתולעים ושטף מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורכו של הצינור צריך להישמר עד למינימום, כפי שהם יכולים להיות חדירים לגז,llowing הכניסה של O 2. חשוב להימנע משימוש בסיליקון, Tygon צינורות כחומרים אלה הם חדירים לחילוף גזים. אנחנו מעדיפים צינורות פוליפרופילן או ניילון. זכוכית או צינורות מתכת לשמור על הגזים טובים, אבל גם יותר קשים לעבוד איתו. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia.">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li><li>Ba Scott, ., Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin/IGF+receptor+homolog+DAF-2.">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li><li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion.">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li><li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li><li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans.">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li><li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans.">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li><li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans.">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS.">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כפי שכבר בשימוש נרחב בג elegans למודל פציעת IR. כמה נקודות מפתח צריכה להיות מודגשות לפרוטוקול זה: סי אלגנס הם עמיד למגוון רחב של פציעות, המצדיק את הצורך ב3 עלבונות נלווים (חום, רעב ואנוקסיה) כדי להשיג מוות באמצעות מערכת זו. אנוקסיה לבד לא הורגת את התולעים בחלון זה זמן 14. יתר על כן, עלייה בטמפרטורה היא לחץ נוסף, ולכן חשוב לעקוב מקרוב. לאמיתו של דבר, רעב אינו תורם באופן משמעותי לתואר של תמותה שנצפתה 7, כשלעצמה, אבל זה נראה להפחית שונות בין משכפל ניסיוני. בהתחשב בכך שלא יכול להיות שונה משמעותי מיום ליום, שזה חשוב ביותר כדי להשוות דגימות להפעיל ישירות במקביל, ולחזור על ניסויים על פני ימים רבים. באופן כללי, תוצאות נמדדות בשלוש צלחות נפרדות של 50-100 תולעים / תנאי ניסוי ואלה הםn בממוצע ונחשב כלשכפל ניסיוני אחד. באופן כללי, בין שבעה לתשעה משכפל נראה מספיק כדי להשיג או לשלול את מובהקות סטטיסטיות. השלב ההתפתחותי של התולעים המשמשים בניסוי גם צריך להיות במעקב צמוד כמו הרגישות של שלבים שונים לניזק משתנה באופן משמעותי 15,16. השימוש של צעירים הוא סטנדרטי, ותולעי שלב זחל (L3 וL4) נראים עמיד יותר להשפעות המזיקות של AS (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול זה מציג שתי דרכים לביצוע הניסויים, אחד באמצעות מנגנון מתוצרת מעבדה (באמצעות מכולות טאפרוור מסוג וקלט גז 11) ואחרים באמצעות תא חוסר חמצן מסחרי 4,6. ניתן להשיג אנוקסיה באמצעים אחרים שצורכים את החמצן, כפי שתואר במקומות אחרים 13,17. השימוש בטכניקות חלופיות כדי ליצור סביבת חוסר חמצן יכול לשנות את הזמן כמו הדגירה דרושהכדי ליצור את הכמות הרצויה של מוות. מיקוד ~ הישרדות 20% הוא נקודת מוצא אידיאלית ללימוד התערבויות מגן, בעוד 80% הוא באופן דומה אידיאליים עבור התערבויות שתחמרנה את ההשפעות המזיקות של AS. עוד אזהרה חשובה היא הזמן שבו תולעים מתים / חיים עשרות הצופה. אם הזמן לניתוח מורחב מעבר 24 שעות, הנתונים עלולות להטעות שכן תולעים מתים הפכו קשים יותר ויותר לזהות. זה יכול להיות בגלל פגרי תולעת הופכים שקופים יחסית לאורך זמן, אלא גם לעובדה שעוברים מופרים יכולים להתפתח לצאצאים לאחר המוות הפנימי של הפגרים ולשבש אותם כפי שהן עולות. הניתוח של מורפולוגיה עצבית יכול להיות שונה כדי לבחון את דפוסי ביטוי חלבון 18, פיצול גרעיני 4 ופרמטרים נוספים 19 ידי החלפת זן תולעת המבטא את סמן מקודד גנטי המתאים. אזהרה סופית אחת היא שההדמיה שלצריכים לעשות תהליכים עצביים פחות מ 30 דקות לאחר הצבת התולעים בשקופית. בעלי חיים נשמרים תחת הרדמה בשקופיות לתקופות ארוכות יותר יכולות להציג נזק כעצמאי. התאם את כמות בעלי חיים לכל שקופית על פי הזמן הדרוש כדי לעקוב ולנתח אותם.

סי אלגנס הוא נמטודות שאומצה באופן נרחב כאורגניזם מודל אוקריוטים תאיים מאז השקתו ב -1 ברנר. זהו מודל זול, פשוט, ותכליתי, המאפשר קישורים קלים בין שינויים ופנוטיפי הגנטיים משנים 2. איסכמיה מאופיינת בחוסר של חומרים מזינים ואספקת חמצן לרקמות, ואחריו reperfusion, כאשר פרץ של מיני חמצן תגובתי מיוצר 3 ורוב הנזק מתרחש. ב2002, מודל של איסכמיה / reperfusion (IR) בג elegans פותח 4 מעורב הגשה כל התולעת לאנוקסיה, מחסור באבות מזון ועומס חום למשך כ 20 שעה אחרי 24 שעות בתנאים רגילים. למרות שמודל זה הוא מבחינה טכנית אנוקסיה רעבה (AS) מצב, מוות של תאים מתרחש באמצעות מנגנונים הנשמרים ביונקים, לרבות נזק שנגרם על ידי חמצון במהלך reperfusion &lt;sup&gt; 5. יתר על כן, בדומה לIR יונקים, נזקים הנגרמים על ידי AS ב C. elegans ניתן למנוע על ידי נפשית מראש איסכמי 6,7 או 8,9 נפשית מראש חומר הרדמה. הפרוטוקולים שלהלן מדגימים כיצד לחקות IR בג elegans באמצעות מודל AS, איך להבקיע מומים מורפולוגיים והתנהגותיים הנובעים מAS, ואיך להתאים את הפרוטוקול באופן שמאפשר לניסוי שיבוצע בהשקעה ראשונית נמוכה באמצעות חלופה קאמרית בקלות-נבנה בהזמנה אישית .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

פרוטוקולים לאנוקסיה / רעב בסי אלגנס אורגניזם מודל הגנטי לדמות איסכמיה / reperfusion. תולעים מופרדים מחיידקים שבמזון והניחו מתחת לאנוקסיה 20 שעה (איסכמיה מדומה), ולאחר מכן עברו לאווירה נורמלית עם אוכל (reperfusion המדומה). תוצאות פרדיגמה ניסוייות זה במותו גדל ונזק עצבי, וטכניקות מוצגות להעריך כדאיות האורגניזם, שינויים במורפולוגיה של תהליכי מגע של תאי עצב, כמו גם מגע רגיש, המייצג את הפלט ההתנהגותי של תפקוד עצבי. לבסוף, שיטה לבניית חממות חוסר חמצן באמצעות מיכלי אחסון מטבח המשותף מתוארת. התוספת של יחידת בקרת זרימה המונית מאפשרת לשינויים שנעשו בתערובת הגז בחממות המותאמת אישית, ואמבט מים במחזור מאפשר לשניהם בקרת הטמפרטורה ועושה את זה קל לזהות דליפות. שיטה זו מספקת אלטרנטיבה בעלות נמוכה לאופן מסחרייחידות זמינות.

הכפפת ג elegans ל20 שעות של AS ב26 מעלות צלזיוס בתא דגירה תוצרת מעבדה מותאמת אישית כפי שתואר (סעיף 3.6.2) הביא לתמותה משמעותית (איור 1 א) 5. דימות פלואורסצנטי הבאה של &quot;פונקטום והפסקות בתהליכים עצביים ה-GFP שכותרת של ניצולים אישרה את נוכחותו של מומים מורפולוגיים (איור 2). הניצולים גם הגיבו היטב לקיר גוף מגע קל (איור 1). מודל זה כבר בשימוש על ידי מספר קבוצות כדי ללמוד איך נטייה גנטית, התערבות תרופות, ופלסטיות מטבולית משפיעה על תוצאות AS תלויות 4-6,8,9,12,13. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> איור 1. ג elegans הישרדות ומגע תגובה לאחרAS.) אחוז מהתולעים כי תערוכת 24 לאחר כשעת הישרדות. זן N2 הוא הרקע הגנטי הסוג בר, וKWN85 מכיל transgene משולב שמתייג נוירונים MEC עם GFP. ב &#39;) בתגובה למגע גירויים של החיים ג elegans (הזנים N2) לאחר AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> איור 2. מומים (PLML וPLMR) לגעת שינויי נוירון לאחר AS. נוירון מגע כגון תהליכים והפסקות (א) או ההצטברות של אגרגטים GFP בתהליכים (ב &#39;) והמפותלים היו במעקב שבנותרו בחיים בהרדמה ג eleg<html> ans לאחר AS. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> איור 3. איסוף ריס. איסוף עפעף מורכב. בהבלעה, פירוט של הריסים דבוקים לעץ הקיסם. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> איור 4. קאמרי חוסר חמצן בתוך אמבט המים מתוצרת מעבדה. מיכל סגור מוכן להתחיל את הניסוי. חצים מצביעים על כניסת הגז ויציאה ומשקל הבקבוק משמש כדי למנוע ממנו צף. 231fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. פרטים של הצד הפנימי וחיצוני של מכסה מיכל. א) בצד חיצוני של מיכסה מיכל, המציין את הצינור ומחבר שלו מחובר לצד חיצוני של מיכסה מיכל חור. שנעשה בעבר ב &#39;), המציין את מחבר הצינור מחובר לחור שנעשה בעבר.

Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

פרוטוקול מתואר המשתמש אנוקסיה / רעב בג elegans למודל איסכמיה / reperfusion. תוצאות תפקודיות כוללות תמותה מוגברת, ליקויים גלויים בתהליכים עצביים-GFP שכותרתו, ותגובות התנהגותיות לקויים הדורשות תפקוד עצבי.

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...