Name: an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

Tallene 1 og 2 ble tidligere publisert i Free Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al. 5) og har copyright holdt av Elsevier. Dette arbeidet ble støttet av den Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, den Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), og USPHS GM087483 (KN ). BBQ er en doktorgradsstudent som støttes av en FAPESP fellesskap.

En. C. elegans Vekst <ol><li> Forbered 35 mm nematode vekstmedier (NGM) agar plater seeded med OP50 bakterier, som per standard dyrkingsmetoder en. </li><li> Synkron C. elegans ved å plassere seks av gravid voksne på en seeded NGM plate. Fjern de voksne etter ~ 100 egg har blitt lagt (~ 3 timer). </li><li> Inkuber platene for tre dager ved 20 ° C, noe som medførte at ormer vil ha utviklet til unge voksne stadiet og er optimale for dette eksperimentet. Alternative protokoller for å synkronisere C. elegans er beskrevet andre steder 10. </li></ol> 2. Materialer for AS <ol><li> M9 buffer (22 mM KH PO 2 4 og 42 mM Na HPO 2 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) bør være renset for oksygen ved ekvilibrering med N 2 (argon kan også anvendes) i 30 min før forsøket og holdt omgitt av is. </li><li> Lag et lite hull (3 mmbred) i lokket på 1,5 ml mikrosentrifugerør i hvilken ormer vil bli plassert under AS. Hullet muliggjør gassutveksling uten å holde lokket åpent, da dette kan føre til overdreven media fordampning. </li></ol> Tre. Anoksi / Sult <ol><li> Gjennomføre alle forsøkene i hvert fall i triplikat. </li><li> Tilsett 1 ml av RT, oksygenert M9 buffer til hver 35 mm plate innehold unge voksne ormer dyrket som beskrevet ovenfor. Vær forsiktig for å unngå å fjerne bakterier fra platen (legg M9 til kantene hvor bakterier ikke ble seeded). Etter ~ 1 min ormer bør være svømming i M9. </li><li> Coat en 1 ml pipette spissen med BSA ved pipettering og utvise en steril 1% BSA løsning. </li><li> Helle forsiktig plate som inneholder ormer i M9 buffer, fjerne M9 fra samme sted der den ble lagt, og plasser suspensjon i oppkjørte mikrosentrifugerør. Let hvile i is inntil ormer har falt ned til bunnen av rørene (~ 1-2 Min). </li><li> Fjern den maksimale mengden av M9 mulig uten å forstyrre de ormer fra røret (forlater rundt 100 ul), tilsett 1 ml av den oksygen renset og avkjølt M9 og plassere røret over is inntil ormer faller til bunnen igjen. Gjenta det siste trinnet 3x. I siste vask, fjerner M9 til ~ 100 ul forblir i røret. </li><li> Plasser rørene med ormer i deoxygenated M9 inni en anoksisk / hypoksisk kammer (se instruksjonene nedenfor, avsnitt 3.6.1) eller, alternativt, til en tilpasset forseglet container (se instruksjoner nedenfor, punkt 3.6.2). <ol><li> Ved en kommersiell anoksisk / hypoksisk kammer skal brukes, lar noen gjennomspylt M9 inne i kammeret før trinn 3.5 og gjenta trinn 3.5 når ormer er inne i kammeret. </li><li> Ved en tilpasset kammeret skal benyttes, er en detaljert beskrivelse av hvordan man skal lage en rimelig anordning presentert ved utgangen av denne protokollen, og har blitt beskrevet av en annen gruppe som tidligere 11. Kort: <ol&gt; <li> Lag to hull i en 250 ml Tupperware-type container lokk og legge rørforbindelser til dem. Man vil bli brukt til å injisere gassblandingen mens den andre vil være gass utgang inn i et vannbad. </li><li> Plasser ormer inn i kammeret og forsegle kammeret ved hjelp av lokket. </li><li> Gass med en konstant N2-strøm (100 ml / min). </li><li> Plasser beholderen inne i et vannbad ved 26 ° C. Forsikre deg om at exit røret er godt nedsenket i vann slik at ingen luft tilbake og at det ikke er noen lekkasjer i systemet (åpenbart av bobler som oppstår fra selve kammeret). </li></ol></li></ol></li><li> Inkuber ormer ved 26 ° C i 20 timer. </li></ol> 4. Simulert Reperfusjon <ol><li> Etter 20 timer under AS forhold, fjerne rørene fra inkubasjonstiden kammeret i romluften. </li><li> Pipette C. elegans med en BSA-belagt tips (som i trinn 3.3) på en OP50 seeded 35 mm NGM plate. Inkuber platene ved 20 ° C i 24 timer.Etter dette, vil ormer være klar til å bli scoret. </li></ol> 5. Identifisere Døde Versus levende ormer <ol><li> Ved hjelp av en platina plukke, så vidt berører toppen av hodet av ormen. Levende ormer vil bevege seg bakover etter å ha blitt berørt. Hvis ormer er nonresponsive, score som død. Av og til vil en orm ikke bevege seg bakover, men kan oppvise en svak side-til-side-bevegelse av hodet. Selv om det teknisk døde, disse ormene er nesten sikker på å utløpe i løpet av timer, og bør dømmes som døde. Hvis man venter for lenge med å score ormer, kan intern klekking av avkom oppstå og disse &quot;poser-av-ormer&quot; kan sprekke, noe som gjør oppdage skrottene svært vanskelig. </li><li> Fjern både levende og døde ormer fra platen som de er regnet for å unngå dupliserte tellinger. De levende ormer kan flyttes til en separat plate for å utføre atferdstester. Mengden av levende ormer i forhold til den totale representeres som% overlevende ormer (figur 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Touch Response analysen <ol><li> En detaljert beskrivelse av denne protokollen har blitt presentert i Hart, Anne C., red. Behavior (3 juli 2006), WormBook, red. The C. elegans Forskning Samfunn, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Å score for anslagsfølsomhet, identifisere ormer som beveger seg og forsiktig inntil siden av ormen hode (nær den midtre delen av svelget) med en øyenvippe pick (figur 3). </li><li> Hvis ormen beveger seg bakover, score så forståelsesfull, hvis ikke, score så nonresponsive (Figur 1B). Gjenta dette trinnet 10-15x for hver orm med 10 sek intervaller. Probe minst 10 ormer i hver gruppe for å ha nøyaktige data. Den samme analysen kan brukes til å vurdere frem motorisk forandringer etter lett trykk til den bakre kroppsveggen. Pass på ikke å røre på hodet eller halen av ormen, siden dette stimulerer en distinkt oppførsel. </li><li> Til slutt, ibedriftens genetiske kontrollstammer [N2 Bristol villtype for positiv, mec (mechanosensory) mutant for negativ - f.eks CB1338 mec-3 (e1338) IV] for å kalibrere den styrke som å ta på ormer. For harde for en stimulering vil lokke fram en atferdsrespons i mec mutanter, for lite vil ikke framprovosere en effekt i villtype N2 kontroller. </li></ol></li></ol> 7. Neuronal Modifikasjoner <ol><li> For å visualisere innlegget AS nevrale endringer, bruker en belastning som uttrykker GFP i berøringsende mec nevroner 4,5. Disse nervecellene har lange prosesser som kjører langs kroppen veggen og er enkelt mål for morfologiske abnormaliteter. I tillegg kan morfologisk informasjon bli integrert med atferdsmessige målinger av neuronal funksjon, som beskrevet ovenfor. En stamme som kan brukes for dette formål er TU2583, som er tilgjengelige fra C. elegans Genetics Center og inneholder uIs25 integrert transgenet uttrykker GFP from den mec-18 promoter, eller alternativt TU2562, som inneholder en integrert mec-3 :: GFP fusjon. </li><li> Forbered en agarose pad. <ol><li> Smelt 2% agarose i vann, bringe til 1 x M9 med et 10x lager, og opprettholde oppløsningen ved 70 ° C. </li><li> Plasser en dråpe (ca. 20 pl) av denne oppløsning på et objektglass (25 mm x 75 mm) som er blitt plassert mellom to andre sider, som hver har et enkelt stykke av båndet på sin underside. </li><li> Plasser en endelig objektglass vinkelrett på den første på toppen av 2% agarose-løsning, og la den avkjøles til RT. Dette skal danne en pute som er tykkelsen av båndet. </li><li> Fjern den øverste lysbilde og tilsett 10 mL av M9 som inneholder 0,1% Tetramisole, noe som vil bremse den ormer. </li></ol></li><li> Flytte noen (~ 10) lever ormer på 2% agarose lysbilde. Plasser et dekkglass over dem og visualisere GFP bruke en fluorescens mikroskop under et 100X objektiv med riktig belysning. </li><li> Skadetnevroner viser en cytosoliske membran streng av perler mønster i prosessene, som består av multiple punctum (figur 2A), og / eller abnormaliteter hvor prosessene synes å være brutt (fig. 2B). Count Punctum og misdannelser i både nerveceller for hver orm, ved hjelp av en total på minst 10 ormer. </li></ol> 8. Lab-laget Hypoksisk Chamber <ol><li> En Tupperware-stil, lukkbar, lufttett beholder kan ettermontere som en anoksisk kammer. Pass på å velge en beholder som er så liten som mulig. En liten beholder skaper et hypoksisk miljø raskere og lettere å passe inn i vannbadet (figur 4). </li><li> Lag to hull på lokket (kan gjøres med en skrutrekker eller ved oppvarming tang og tvang i lokket) og sett en plast eller metall-kontakt som passer slangen (figur 5A). Bruk lim som kan plasseres under vann, og også blir hard etter tørking, å unngå bevegelse avpluggen og dermed reduserer muligheten for lekkasje (figur 5B). </li><li> Beholderen som skal settes inn i vannbadet, slik at den er neddykket fullstendig (figur 4). Å fordype beholderen, bruk en flaske vekt eller en dykker vekt. </li><li> En av de rør-forbindelser vil bli brukt til å innføre en gassblanding og det andre røret vil virke som en trykkavlastning, derav det bør stå under vann, slik at beholderen er forseglet fra det ytre miljø (figur 4). </li><li> Luften Sammensetningen kan moduleres ved hjelp av spesiallaget gass, massestrøm kontrollere, eller en hvilken som helst anordning som blander de ønskede gasser. Gasstrømmen bør være kontrollert, så høy strømning kan skape overdreven fordampning. For eksempel, i en 250 ml beholder, vil på 100 ml / min av gass gir god plass for ormer og et egnet flussmiddel. </li><li> Lengden av røret bør holdes på et minimum, da de kan være gjennomtrengelig for gass, etllowing inngangen av O 2. Det er viktig å unngå bruk av silikon, Tygon rør, da disse materialer er gjennomtrengelig for gassutveksling. Vi foretrekker polypropylen eller nylon rør. Glass-eller metallrør opprett gassene også, men er også vanskeligere å arbeide med. </li></ol>

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference.">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li><li>Vanden Hoek, ., L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia.">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li><li>Ba Scott, ., Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin/IGF+receptor+homolog+DAF-2.">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li><li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion.">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li><li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans.">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li><li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans.">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li><li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans.">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li><li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport.">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans.">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088 (2012).</li><li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS.">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li><li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia.">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li><li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. k. o. g. e. r. b. &. #. 2. 4. 8. ;. G., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression.">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li><li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme,+Ndi1,+in+myocardial+reperfusion+injury.">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288 (2011).</li><li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development.">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na+/H++exchanger+NHX-2+increases+life+span.">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

AS har vært mye brukt i C. elegans å modellere IR skade. Noen sentrale punkter skal være uthevet for denne protokollen: C. elegans er resistente mot et bredt spekter av skader, begrunner behovet for 3 samtidige fornærmelser (varme, sult og anoksi) for å oppnå død ved hjelp av dette systemet. Anoksi alene ikke drepe ormene i dette vinduet for tiden 14. Videre er temperaturøkningen en ekstra belastning, så er det viktig å overvåke nøye. Strengt tatt ikke sult ikke bidra vesentlig til graden av dødelighet observert 7, per se, men det ser ut til å redusere variasjonen blant eksperimentelle replikater. Gitt at det kan være betydelig variasjon fra dag til dag, er det ekstremt viktig å sammenligne prøvene kjøres direkte i parallell, og å gjenta eksperimenter over flere dager. Generelt er resultatene målt for tre separate plater av 50-100 ormer / eksperimentell tilstand, og disse ern gjennomsnitt og anses som en enkelt eksperimentell replikere. Vanligvis mellom sju og ni gjentak ser ut til å være tilstrekkelig til å oppnå eller utelukke statistisk signifikans. Utviklingsstadiet av ormer som brukes i forsøket må også være nøye overvåket som mottakelighet for ulike stadier til AS skader varierer betydelig 15,16. Bruken av unge voksne er standard, og larvestadiet (L3 og L4) ormer ser ut til å være mer motstandsdyktig mot de skadelige effektene av AS (upubliserte data). Denne protokollen presenterer to måter å utføre eksperimenter, en ved hjelp av en lab-laget apparat (med Tupperware-type beholdere og gass innspill 11) og andre ved hjelp av en kommersiell hypoksisk kammer 4,6. Anoksi kan oppnås med andre midler som forbruker oksygen, som beskrevet andre steder 13,17. Bruken av alternative teknikker for å skape et hypoksisk miljø kan forandre AS inkubasjonstid nødvendigeå skape den ønskede mengden av død. Målretting ~ 20% overlevelse er et ideelt utgangspunkt for å studere vernetiltak, mens 80% er like ideelt for intervensjoner som forverre de skadelige effektene av AS. En annen viktig påminnelse er tidspunktet da observatør score døde / levende ormer. Hvis tiden for analysen er utvidet utover 24 timer, kan dataene være misvisende siden døde ormer blir stadig vanskeligere å identifisere. Dette kan være på grunn av snekkeskrotter blir forholdsvis transparent over tid, men også til det faktum at befruktede embryo kan utvikle seg til avkom post-mortem innsiden av skrotter og avbryte dem som de oppstår. Analysen av neuronal morfologi kan bli endret for å se på protein uttrykk mønstre 18, atom fragmentering 4 og andre parametere 19 ved å erstatte en orm belastning som uttrykker den aktuelle genetisk kodet markør. En siste påminnelse er at visualisering avnevronale prosesser bør gjøres mindre enn 30 minutter etter å plassere ormer på lysbildet. Dyr holdt under anestesi på lysbilder for lengre perioder kan fremvise AS uavhengig skade. Justere mengden av dyr pr glide henhold til den tid som trenges for å spore og analysere dem.

C. elegans er en nematode som har vært i omfattende bruk som en flercellet eukaryote modellorganisme siden introduksjonen av Brenner en. Det er en billig, enkel og allsidig modell, som tillater enkel koblinger mellom genetiske forandringer og fenotypiske endringer to. Iskemi er kjennetegnet ved en mangel på næringsstoffer og oksygen til et vev, etterfulgt av reperfusjon, når en serie av reaktive oksygenforbindelser fremstilles 3 og mesteparten av skaden oppstår. I 2002 ble en modell av ischemi / reperfusjon (IR) i C. elegans ble utviklet fire involverer sende hele ormen til anoksi, næringsmangel og varmestress for ca 20 timer etterfulgt av 24 timer under normale forhold. Selv om denne modellen er teknisk sett en anoksi-sult (AS) tilstand, oppstår celledød gjennom mekanismer som er konservert hos pattedyr, inkludert skade indusert av oksidanter under reperfusjon &lt;sup&gt;. 5 Videre, i likhet med pattedyr IR, skade indusert av AS i C. elegans kan forebygges ved iskemisk prekondisjonering 6,7 eller bedøvende prekondisjonering 8,9. Protokollene nedenfor demonstrerer hvordan å etterligne IR i C. elegans bruker AS-modellen, hvordan å score morfologiske og atferdsmessige forandringer som følge av AS, og hvordan man skal tilpasse protokollen på en måte som gjør at forsøket skal gjennomføres med en lavere initiell investering ved hjelp av en skreddersydd, lett-bygget kammer alternativ .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1146">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">N2&#160; strain</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">Wild type strain</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">TU2583</td>
			<td style="width:453px;">integrated fluorescent transgene used to label touch neurons</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CB1338 mec-3 (e1338)IV</td>
			<td style="width:269px;">CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)</td>
			<td style="width:208px;">CB1338</td>
			<td style="width:453px;">canonical mec-3 mutant that is touch insensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:269px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:208px;">0030 120.086</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Nikon USA</td>
			<td style="width:208px;">TE2000-U</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td style="width:269px;">Sheldon Manufacturing Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Model 2005</td>
			<td style="width:453px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Eyelash Pick</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:453px;">An eyelash pick can be prepared by attaching&#160; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hypoxic Chamber</td>
			<td style="width:269px;">Coy</td>
			<td style="width:208px;">8307030</td>
			<td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anoxia-starvation model for ischemia/reperfusion in c. elegans

Protokoller for anoksi / sult i de genetiske modellorganisme C. elegans simulere iskemi / reperfusjon. Worms separeres fra bakteriell mat og plassert under anoxia i 20 timer (simulert ischemi), og deretter flyttet til en normal atmosfære med mat (simulert reperfusjon). Denne eksperimentelle paradigme resulterer i økt død og neuronal skade, og teknikkene er presentert for å vurdere levedyktigheten til organisme, endringer i morfologien av berøring neuron prosesser, så vel som berøringsfølsomheten, som representerer de atferdsmessige utgangs av neuronal funksjon. Til slutt blir en fremgangsmåte for å konstruere hypoksiske inkubatorer ved hjelp av vanlig kjøkkenoppbevaringsbeholdere beskrevet. Tilsetningen av en massestrømningsstyreenhet tillater endringer som skal gjøres til gassblandingen i spesial inkubatorer, og et sirkulerende vannbad tillater både temperaturkontroll og gjør det lett å identifisere lekkasjer. Denne metoden gir et rimelig alternativ til kommersielttilgjengelige enheter.

Utsette C. elegans til 20 timer av AS ved 26 ° C i en tilpasset lab-laget inkubasjon kammer som beskrevet (punkt 3.6.2) resulterte i betydelig dødelighet (figur 1A) 5. Etterfølgende fluorescerende avbildning av Punctum og pauser i GFP merket nevronale prosesser av overlevende bekreftet tilstedeværelsen av morfologiske abnormaliteter (figur 2). De overlevende også reagert dårlig på lys kroppen veggen touch (Figur 1B). Denne modellen har blitt brukt av flere grupper for å studere hvordan genetisk predisposisjon, farmasøytisk intervensjon, og metabolske plastisitet påvirker AS avhengige utfall 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figur 1. C. elegans overlevelse og touch respons etterAS. A) Andel av ormer som utviser 24 timers post-AS overlevelse. N2 belastningen er den villtype genetisk bakgrunn, og KWN85 inneholder en integrert transgenet som etiketter mec nevroner med GFP. B) Response å røre stimuli av levende C. elegans (N2 Strain) etter AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figur 2. Berørings nevroner modifikasjoner etter AS. Touch nevron (PLML og PLMR) abnormaliteter som kroket prosesser og pauser (A) eller opphopning av GFP tilslag i prosessene (B) ble overvåket i gjenlevende bedøvet C. elegans<html> ans etter AS. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figur 3. Pels hakke. Et samlet øyevipper hakke. I det innfelte, en detalj av øyen limt til tannpirker av tre. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figur 4. Lab-laget hypoksisk kammer inne i vannbad. En lukket beholder klar for å starte forsøket. Pilene viser inngangen gass og exit og flasken vekten brukes til å holde den fra flytende. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Detaljer av indre og ytre side av beholderlokket. A) Ytre side av beholderlokket, noe som indikerer at røret og dets kontakt er festet til den tidligere laget hull. B) Ytre side av beholderlokket, noe som indikerer at røret som er festet til den tidligere laget hull.

Watch this Scientific Journal Video about An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans at JoVE.com

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i<em&gt; C. elegans</em

En protokoll er beskrevet som bruker anoksi / sult i C. elegans å modellere iskemi / reperfusjon. Funksjonelle utfall inkluderer økt dødelighet, synlige misdannelser i GFP-merket nevronale prosesser, og nedskrevne atferdsmessige reaksjoner som krever nervecellefunksjon.

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Research

JoVE Journal

Biology

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening for å identifisere Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Chemotaxis analysen

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

En metode for dyrking Embryonic<em&gt; C. elegans</em&gt; Celler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Gransker spredning og Toxicity of prion-lignende Proteiner Bruke metazoan modellorganisme<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...