Name: imaging through the pupal case of drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-01-23T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer Akira Chiba para apoio intelectual, apoio material, e ações. Graças à Julia Dallman para comentários.

1. Voar Trabalho <ol><li> Manter moscas em meio padrão fubá-ágar-melaço de levedura à temperatura ambiente 10. </li><li> Para cruzes, isolar virgens dentro de 6 horas de eclosão. Depois de atravessar a machos do genótipo desejado, mudança voa para novos frascos a cada 3-4 dias. </li></ol> Nota: Para estas experiências, linha Gal4 A9 foi usado para conduzir a expressão de transgenes na asa. Fly ações podem ser obtidos a partir do centro de estoque em Bloomington. Ações u...

<ol>
	<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332, 354-358 (2011).</li><li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage:+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell.">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li><li>Ninov, N., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila.">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).</li><li>Edgar, B. A., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+cell+cycle+regulators:+a+fly's+perspective.">Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective.</a> Science. 274, 1646-1652 (1996).</li><li>Wirtz, R. A., Semey, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+kitchen:+equipment,+media+preparation,+and+supplies.">The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies.</a> Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).</li><li>Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+multicolor-labeled+cells+in+Drosophila.">Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila.</a> Development. 140, 1605-1613 (2013).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+is+a+broadly+conserved+feature+of+cell+division+in+pseudostratified+epithelia.">Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia.</a> Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).</li><li>Sauer, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li></ol>

Para visualizar, medir e quantificar características de células em divisão, necessário o desenvolvimento de uma preparação simples para a observação de mitose na ala de pupa vivo de Drosophila por meio de análise confocal de His2AvGFP expressando células. Este método foi utilizado para demonstrar que o ciclo celular na asa de pupa tem semelhanças fortes para célula no epitélio pseudo ciclos em que se movem os núcleos para a superfície apical do epitélio, onde eles entram em mitose. Após telóf...

<html> A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um modelo bem estabelecido para o estudo de vários aspectos da biologia. Pesquisa Drosophila tem uma história rica de experiências genéticas que permite formas sofisticadas de manipulação genética, incluindo expressão, knockdown e mutação. Com o advento de rótulos de proteína fluorescente, este repertório foi expandido para incluir estudos de células e proteínas em animais vivos. O embrião da mosca é um excelente sistema para tais estudos, pois é pequeno e opticamente clara permitindo profunda, de alta resolução de imagem in vivo 1-3. Outros estágios de desenvolvimento da mosca provaram ser menos tratável, exigindo anestesia 4, dissecção e cultura de curto prazo de 5,6, ou a criação de janelas na cutícula para imagens 7,8. Estas manipulações geralmente comprometer o desenvolvimento dos animais no longo prazo ou afectar o animal de modo a limitar de imagem para períodos curtos. ent &quot;&gt; Para estudar novas mutações em genes que se assemelham a reguladores do ciclo celular, é essencial para encontrar uma preparação adequada para estudar o tempo e a fidelidade do ciclo celular. Como a maioria dos ciclos de células embrionárias são truncados (SM ou S-G2-M) e os mutantes em estudo não apresentam defeitos, até estágios mais avançados, foi importante para observar o ciclo celular em tecidos fase de pupa. células epiteliais na pupa tem um ciclo mais típico celular G1-S-G2-M e pupas desta fase são não é capaz de movimentos musculares 9. O ponto de partida inicial para manipulações incluído todo intacta pupas expressando Histone2AV-GFP. Apesar da opacidade aparente do processo de pupa, esta preparação intacta mostrou ser excelente para a longo prazo in vivo de imagens. Essa técnica é simples o suficiente para que pesquisadores de graduação rotineiramente usá-lo para estudar aspectos da biologia celular e de desenvolvimento em Drosophila e ainda a resolução é bom o suficiente para permitir a discriminação de recursos em escala micrométrica. Com este método, as observações dos eventos mais horas, minutos ou segundos são possíveis simplesmente ajustando os parâmetros de séries temporais. Vídeos usando o azul, proteínas fluorescentes verde, amarelo, laranja e vermelho, ou combinações destes, foram feitas. Mais importante, se o cuidado de minimizar a intensidade do laser, mesmo a longo prazo de imagem não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento ou a viabilidade dos animais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly stuff fly pad</td>
			<td style="width:71px;">Genesee scientific</td>
			<td style="width:119px;">59-114</td>
			<td style="width:167px;">for fly anesthetization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CO2 gas</td>
			<td style="width:71px;">Airgas south</td>
			<td style="width:119px;">CD50</td>
			<td>For fly anesthetization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas south</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>CO2 regulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly vials</td>
			<td style="width:71px;">Genesee scientific</td>
			<td>32-113RLBF</td>
			<td>Fly culture</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td>
			<td style="width:71px;">Bloomington Stock center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass bottom dishes #1 1/2</td>
			<td style="width:71px;">WillCo Wells BV</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thiodiethylene Glycol</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">88559</td>
			<td>mountant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Modeling clay</td>
			<td style="width:71px;">art supply store</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Support to position pupae against</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paintbrushes</td>
			<td style="width:71px;">art supply store</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>To manipulate flies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Forceps, Inox #5</td>
			<td style="width:71px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">computer</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>8 Gb RAM for image/movie analysis</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:216px;">Fiji software</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;">Free ware http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>Any fast scanning confocal should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For imaging tissue, cellular and subcellular features</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil (non fluorescent)</td>
			<td style="width:71px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:71px;">any</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td>For fly manipulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging through the pupal case of drosophila melanogaster

A utilização prolongada de Drosophila como modelo para a biologia celular e de desenvolvimento produziu um conjunto de ferramentas. Em conjunto, estas técnicas têm permitido a análise de células e biologia do desenvolvimento de uma variedade de ângulos metodológicas. Imagens ao vivo é um método emergente para a observação de processos celulares dinâmicos, como a divisão celular ou motilidade celular. Tendo mutações em proteínas isoladas do ciclo celular putativos descaracterizados se tornou essencial para observar a mitose in situ usando imagens ao vivo. A maioria dos estudos de imagem ao vivo em Drosophila têm-se centrado sobre os estágios embrionários que são acessíveis à manipulação e observação por causa de seu pequeno tamanho e claridade óptica. No entanto, nestas fases do ciclo celular é incomum em que falta uma ou ambas as fases gap. Em contraste, as células da asa pupal de Drosophila têm um ciclo celular comum e passam por um período de mitose rápido que mede cerca de 20 horas de desenvolvimento de pupas. É fácil de identify e isolar pupas do palco apropriado para pegar mitose in situ. Montagem pupas intactas a melhor combinação de tratabilidade e durabilidade durante o exame, permitindo experiências de correr por várias horas com um impacto mínimo sobre a viabilidade celular e animal. O método permite a observação de estruturas tão pequenas quanto, ou menor do que, cromossomas voar. Ajuste das definições de microscópio e os detalhes de montagem, permitiu extensão da preparação para visualizar a dinâmica da membrana de células adjacentes e as proteínas marcadas com fluorescência, tais como a tubulina. Este método funciona para todas as proteínas fluorescentes testados e podem captar recursos escala submicrométricas sobre uma variedade de escalas de tempo. Embora limitado ao exterior 20 mM de pupa com um microscópio confocal convencional, esta abordagem para observar proteína e dinâmica celular em tecidos pupa in vivo podem ser geralmente úteis para o estudo da biologia celular e de desenvolvimento nestes tecidos.

As células em epitélio pseudo, tais como o olho de Drosophila em desenvolvimento, ou a camada do ventrículo do sistema nervoso central em desenvolvimento de vertebrados, são submetidos a movimentos nucleares, denominado migração nuclear interkinetic, no tempo, com o ciclo celular. A replicação do ADN ocorre quando os núcleos são em ou perto da superfície da célula basal e introduzir a mitose quando os núcleos de atingir a superfície apical 15,16. As células asa pupa formar um epitélio...

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Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Research

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Biology

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

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