Name: brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons at JoVE.com

Эта работа финансировалась за счет грантов НИЗ DA15169 и DA035224 в HEM

Вся обработка животных и сбор урожая ткани проводили в соответствии с руководящими принципами университета Массачусетс медицинской школы Комитета Уходу за животными использования (IACUC), следуя утвержденной протокол № A1506 (Меликян, PI). Обязательные решения <p ...

<ol>
	<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway.">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li><li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glucose+transport+by+insulin:+traffic+control+of+GLUT4.">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li><li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations.">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li><li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders.">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li><li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-independent+endocytosis:+mechanisms+and+function.">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li><li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+unplugged:+multiple+ways+to+enter+the+cell.">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li><li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses.">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li><li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses.">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li><li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP.">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li><li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li><li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area:+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats.">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li><li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons:+Behavioral+correlates+in+GluRA(-/-)+mice.">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li><li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+mechanisms+of+addiction:+the+role+of+reward-related+learning+and+memory.">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li><li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system.">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li><li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism.">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical,+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization.">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li><li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines.">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li><li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter.">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters.">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li><li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis.">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li><li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs.">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li><li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons.">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li></ol>

Несмотря на многолетний знаний, которые эндоцитотический оборот критически воздействия синаптической передачи сигналов в мозге, она оказалась сложной для количественного измерения изменения в экспрессии поверхностных белков у взрослых нейронов. В этой работе мы сообщаем надежный п...

Эндоцитотических торговля является повсеместное клеточный механизм, что точно настраивает ПЛАЗМАЛЕММЫ презентация различных интегральных мембранных белков. Эндоцитоз обеспечивает жизненно важных питательных веществ к внутриклеточной среде 1 и уменьшает чувствительность рецепторов сигналов в ответ на активацию рецепторов 2. Эндоцитотических утилизации обратно в мембране может дополнительно повысить клеточную сигнализацию за счет увеличения уровня экспрессии белка на клеточной поверхности 3. Кроме того, возмущения с торговлей людьми мембраны вовлечены в многочисленные заболевания и патологические состояния, 4,5, подчеркнув необходимость расследовать молекулярные механизмы, которые регулируют белковый торговлей эндоцитического. В то время как многие белки используют классические клатрином зависит интернализации механизмы, монтажные доказательства в течение последних нескольких лет показывает, что несколько клатрином независимым эндоцитотических механизмы регулируют эндоцитического потенциал растущего массивабелки 6,7. Таким образом, необходимость исследовать эндоцитотических механизмы, облегчающие торговлей физиологических соответствующих систем значительно вырос. В мозге, эндоцитотический торговля рецепторов, ионных каналов и нейромедиаторов перевозчиков имеет первостепенную роль в создании синаптическую пластичность 8-11 и реагирования на наркотики 12-15, в конечном счете, влияющих возбудимость нейронов и синаптических ответов. На сегодняшний день большинство исследований нейронных торговли людьми полагаться либо на гетерологичными систем экспрессии или культивируемых первичных нейронов, ни один из которых может надежно отражают механизмы на игре у взрослых нейронов. Здесь мы сообщаем подход, который использует поверхностную биотинилирование количественно измерить уровни поверхностного белка в острых срезах мозга, полученных из взрослых грызунов. Используя этот подход, мы представляем данные, демонстрирующие, что мышь полосатой переносчиков дофамина быстро усваивает в реОтклик на форболового эфира опосредованного протеинкиназы С (РКС) активации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">sulfo NHS-SS-biotin</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Streptavidin agarose</td>
			<td style="width:83px;">Pierce</td>
			<td>20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Vibrating microtome sectioner</td>
			<td style="width:83px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:83px;">various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Milli-cell mesh-bottomed inserts (8&#181;m pore size)</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PI8P 012 50</td>
			<td>These can be washed by hand and re-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons

Регулируемый эндоцитотический торговля является центральным механизмом содействия разнообразные нейромодуляторного событий, за счет динамического управления рецептор, ионный канал, и представление транспортера клеточной поверхностью на минут масштабе времени. Существует широкий разнообразие механизмов, которые контролируют эндоцитического оборотом отдельных белков. Исследования следственные молекулярные основы торговли были в первую очередь полагаться на поверхности биотинилирования количественно измерить изменения в экспрессии поверхностных мембранных белков в ответ на экзогенные стимулы и генной инженерии. Тем не менее, этот подход был в основном ограничивается культивируемых клеток, которые не могут добросовестно отражают физиологически соответствующие механизмы на игре у взрослых нейронов. Кроме того, культурные подходы клеток может привести к недооценке региональной специфики различия в механизмах торговли людьми. Здесь мы описываем подход, который простирается на клеточной поверхности биотинилирование к острой подготовки мозга среза. Мыпоказывают, что этот метод обеспечивает высококачественный подход для измерения быстрые изменения в поверхностных уровней мембранного белка у взрослых нейронов. Такой подход, вероятно, находят широкое применение в области нейронов эндоцитотического людьми.

Нейронов допамина транспортер интернализуется в ответ на РКС активации в клеточных линиях 16-20. Несмотря на многие докладов, демонстрирующих РКС-индуцированные потери DAT поверхности в различных клеточных линий и систем экспрессии, она была сложной, чтобы подтвердить этот вывод в ...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons at JoVE.com

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Нейронов торговля мембрана динамически управляет ПЛАЗМАЛЕММЫ наличие белка и существенно влияет нейротрансмиссию. На сегодняшний день, это была сложной для измерения нейронов эндоцитического торговлей взрослых нейронов. Здесь мы описываем высокоэффективную, количественный метод измерения быстрые изменения в экспрессии белка поверхности экс естественных условиях в острых срезах мозга.

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Using an ÃƒÅ½Ã‚Â±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Острая взрослом мозге нарезки в физиологической температуре

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Изображения в реальном времени GLUT4 белка оборота первичной нейронов гипоталамуса мыши с помощью микроскопии деконволюция

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Альтернативный подход к изучению основных событий в нейродегенеративные, используя срезы мозга крысы Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Использование ближнего инфракрасного флуоресценции и высокого разрешения сканирования для измерения экспрессии белка в мозге грызунов

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...