Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

De auteurs willen graag alle collega&#39;s die dit werk mogelijk gemaakt, vooral Maya Balamane, Elizabeth Johnston Wit, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty erkennen , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, en Lungani Ndwandwe. De auteurs willen ook graag al het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en het Africa Centre personeel dat de Hlabisa HIV behandeling en zorg programma werken bedanken.

<ol>
	<li>Shao, Y., Williamson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+epidemic:+low-+to+middle-income+countries.">The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries.</a> Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).</li><li>Mutevedzi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+a+decentralized+HIV+treatment+programme+in+rural+KwaZulu-Natal,+South+Africa:+does+rapid+expansion+affect+patient+outcomes.">Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes.</a> Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).</li><li>Houlihan, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohort+profile:+Hlabisa+HIV+treatment+and+care+programme.">Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).</li><li>Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+coverage+of+ART+associated+with+decline+in+risk+of+HIV+acquisition+in+rural+KwaZulu-Natal.">High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal.</a> South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).</li><li>Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increases+in+adult+life+expectancy+in+rural+South+Africa:+valuing+the+scale-up+of+HIV+treatment.">Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment.</a> Science. 339, 961-965 (2013).</li><li>Montaner, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+expanding+access+to+highly+active+antiretroviral+therapy+to+curb+the+growth+of+the+HIV+epidemic.">The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic.</a> Lancet. 368, 531-536 (2006).</li><li>Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+voluntary+HIV+testing+with+immediate+antiretroviral+therapy+as+a+strategy+for+elimination+of+HIV+transmission:+a+mathematical+model.">Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model.</a> Lancet. 373, 48-57 (2009).</li><li>Johnson, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+expectancies+of+South+african+adults+starting+antiretroviral+treatment:+collaborative+analysis+of+cohort+studies.">Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies.</a> PLoS Med. 10, (2013).</li><li>Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+impact+of+antiretrovirals+in+resource-poor+settings:+preventing+HIV+infections+whilst+controlling+drug+resistance.">Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).</li><li>Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+antiretroviral+drug+resistance+in+drug-naive+persons.">Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).</li><li>Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+with+reduced+sensitivity+to+zidovudine+(AZT)+isolated+during+prolonged+therapy.">HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy.</a> Science. 243, 1731-1734 (1989).</li><li>Erice, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+primary+infection+with+zidovudine-resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1.</a> N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).</li><li>Williams, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=British+HIV+Association+guidelines+for+the+treatment+of+HIV-1-positive+adults+with+antiretroviral+therapy.">British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy.</a> HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).</li><li>Vandamme, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+recommendations+for+the+clinical+use+of+HIV+drug+resistance+testing:+2011+update.">European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update.</a> AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Department+of+Health.">Department of Health.</a> Clinical guidelines for the management of HIV &amp; AIDS in adults and adolescents. , (2010).</li><li>Conradie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2012+southern+African+ARV+drug+resistance+testing+guidelines.">The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines.</a> S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).</li><li>Manasa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Drug+Resistance+in+South+Africa:+Data+from+10+Years+of+Surveys.">Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).</li><li>Tshabalala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+transmitted+antiretroviral+drug+resistance+among+HIV-1+infected+women+attending+antenatal+clinics+in+Chitungwiza,+Zimbabwe.">Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug+resistance+surveillance+among+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+individuals+in+Angola:+evidence+for+low+level+of+transmitted+drug+resistance.">Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+genetic+diversity+and+transmitted+drug+resistance+in+health+care+settings+in+Maputo,+Mozambique.">HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+drug+resistance+in+antiretroviral-naive+individuals+in+sub-Saharan+Africa+after+rollout+of+antiretroviral+therapy:+a+multicentre+observational+study.">HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study.</a> Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Drug+Resistance+Mutations+Are+Present+in+Six+Percent+of+Persons+Initiating+Antiretroviral+Therapy+in+Lusaka,+Zambia.">HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).</li><li>Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+transmitted+genetic+drug+resistance+in+a+cohort+of+HIV+infected+naive+patients+entering+antiretroviral+treatment+programs+at+two+sites+in+northern+South+Africa.">Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa.</a> J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).</li><li>Iweriebor, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+HIV+in+two+highly+endemic+areas+of+northeastern+South+Africa.">Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa.</a> Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).</li><li>Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiretroviral+drugs+in+newly+diagnosed,+young+treatment-naive+HIV-positive+pregnant+women+in+the+province+of+KwaZulu-Natal+South+Africa.">Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa.</a> J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).</li><li>Nwobegahay, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+antiretroviral+drug+resistance+mutations+and+HIV-I+subtypes+among+newly-diagnosed+drug-naive+persons+visiting+a+voluntary+testing+and+counselling+centre+in+northeastern+South+Africa.">Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa.</a> J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).</li><li>Nwobegahay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+drug-resistant+mutations+in+newly+diagnosed+drug-naive+HIV-1-infected+individuals+in+a+treatment+site+in+the+waterberg+district,+limpopo+province).">Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province).</a> S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).</li><li>Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+net+cost+of+incorporating+resistance+testing+into+HIV/AIDS+treatment+in+South+Africa:+a+Markov+model+with+primary+data.">The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data.</a> J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).</li><li>Dalai, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+molecular+epidemiology+of+subtype+C+HIV-1+in+Zimbabwe.">Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe.</a> AIDS. 23, 2523-2532 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+human+immunodeficiency+virus-1+genotype+resistance+testing+to+determine+highly+active+antiretroviral+therapy+resistance+mutations+in+Hong+Kong.">In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong.</a> Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).</li><li>Lee, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-house+HIV+genotyping+assay+for+the+detection+of+drug+resistance+mutations+in+Southeast+Asian+patients+infected+with+HIV-1.">An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1.</a> J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).</li><li>Aitken, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pragmatic+Approach+to+HIV-1+Drug+Resistance+Determination+in+Resource-Limited+Settings+by+Use+of+a+Novel+Genotyping+Assay+Targeting+the+Reverse+Transcriptase-Encoding+Region+Only.">A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only.</a> J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+low+cost+and+broadly+sensitive+genotyping+assay+for+HIV-1+drug+resistance+surveillance+and+monitoring+in+resource-limited+settings.">Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Technologies.">Life Technologies.</a> Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , (2012).</li><li>Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+HIV-1+diversity+in+Africa:+a+decade+in+review.">Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review.</a> AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).</li></ol>

<div> Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Europese Unie (SANTE 2007 147-790), het Amerikaanse centrum voor ziektepreventie en-bestrijding via CAPRISA (project titel: Health Systems Versterking en HIV Treatment Failure (HIV- TFC)), en de Zwitserse Zuid-Afrikaanse Joint Research Programme (SSJRP) onderzoek subsidie ​​getiteld &quot;Swiss Prot / Zuid-Afrika: Eiwit Bioinformatics Resource Development voor Belangrijke Gezondheidspublicaties Ziekteverwekkers&quot;. RL wordt ondersteund door de Wellcome Trust (licentienummer 090999 / Z / 09 / Z). De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen. </div>

Verschillende lage kosten in-house methoden zijn beschreven in inspanningen om te proberen aan HIV resistentie genotypering meer betaalbare 33, 34, 36 te maken. Er is geen twijfel over de noodzaak om resistentie testen te integreren in het continuüm van zorg voor individuen op antiretrovirale therapie in gebieden met beperkte middelen. Echter, de meeste van de gerapporteerde methoden richten op de toepassing van resistentie genotypering in de surveillance van resistentie op populatieniveau. De Saturn / Life Technologies genotyperingsmethode is een volledig geïntegreerde protocol voor het toezicht en de controle van resistentie. Deze methode is ontworpen om een ​​betaalbare protocol implementeren meestal open source en open middelen toegang bioinformatica voor de interpretatie van resistentie en het genereren van rapporten voor klinische behandeling zijn. Het werd aangetoond door vergelijking met de FDA goedgekeurde Viroseq genotyperingsmethode tenauwkeurig in het identificeren van resistentie mutaties van een panel van ANRS bekwaamheidstesten monsters, in 100% van het laboratorium panel monsters die met succes werden versterkt. De nauwkeurigheid werd ook beoordeeld op klinische monsters van subtype C virussen, de meest dominante subtype in zuidelijk Afrika. De werkwijze was zo nauwkeurig op subtype C monsters als op subtype A en B. Indien de werkwijze worden gebruikt in andere delen van de wereld waar CRF02_AG voorkomt, is het noodzakelijk dat de wijziging van de primers omdat de werkwijze niet een van het paneel monsters die bleek CRF02_AG hebben amplificeren. Als alternatief, een gedegenereerde set primers die gevoelig zijn voor alle groep M virussen 33, 36 kan worden gebruikt in regio&#39;s waar het subtype verdeling is heterogener 38. De gevoeligheid van de reverse transcriptie en PCR kan worden verhoogd door het extraheren van RNA uit hogere volumes plasma, bijvoorbeeld 500 ml. Het plasma kan worden CENTRIFuged bij 21.000 xg gedurende 90 min om de virale deeltjes concentreren voordat u verder gaat met het protocol zoals beschreven door de QIAamp virale RNA-extractie mini kit. Zoals getoond, de nieuwe methode een extra voordeel dat het produceert uitgebreide rapporten voor individuele Patiëntenzorg. Deze rapporten zijn een consolidatie van het genotype, de immunologische en virologische monitoringgegevens evenals de klinische en behandeling geschiedenis van RegaDB. Dit wordt vergezeld van een gedetailleerde laboratorium interpretatie van de weerstand profiel, gevolgd door een even gedetailleerd overzicht van de klinische voorgeschiedenis van de patiënt, alsmede aanbevelingen behandeling. Het gebruik van een gespecialiseerde artsen om de rapporten te beoordelen en aanbevelingen behandeling voor de patiënten biedt de broodnodige mentorschap voor nurse practitioners als onervaren artsen, die steeds meer het verstrekken van ART in Zuid-Afrika in het kader van de aanbevelingen van de WGO voor de taak verschuiven. Deze klinischerapporten is gebleken dat effectieve leermiddelen voor clinici met weinig of geen ervaring met resistentie management. Vanuit een patiënt perspectief onze werkwijze vermindert de noodzaak om te reizen naar centrale locaties om HIV gespecialiseerde diensten. Zo is de beschreven protocol als geheel biedt een goed platform waarlangs HIV resistentie management kan worden geïntegreerd, tegen een betaalbare prijs, in het continuüm van zorg voor HIV-geïnfecteerde individuen falende ART. De gegenereerde data kan gebruikt worden voor epidemiologische doeleinden om de evolutie en de transmissie van resistentie in de gemeenschap te beoordelen. De grootte van de pol fragment gemaakt goed genoeg voor complexere fylogenetische analyse die beter begrip van de epidemie zal produceren op populatieniveau.

De HIV-epidemie in zuidelijk Afrika is snel 1 evolueren met een gelijktijdige exponentiële toename van individuen op antiretrovirale therapie (ART), met name in Zuid-Afrika 2, 3. Als bewijs van de epidemiologische gevolgen van grootschalige behandelprogramma&#39;s in het verminderen van de incidentie 4 en stijgende levensverwachting in gebieden met beperkte middelen (RLS) 5 blijft ophopen, zal inspannen om ART dekking te verhogen worden geïntensiveerd. De evolutie van de richtlijnen voor het gebruik van de behandeling als preventief instrument 6, 7 onder het testen en behandelen van programma&#39;s betekent dat het absolute aantal mensen op behandeling verder zal toenemen. Grote aantallen individuen zal op ART voor langere tijd als de gemiddelde levensverwachting van mensen op ART nadert dat van de HIV-geïnfecteerde populatie 8. De ontwikkeling en overdracht van HIV resistentie heeft always beschouwd als een bedreiging voor de verworvenheden van ART 9-12. Er is dus een noodzaak van een strengere bewaking en monitoring van resistentie als meer mensen worden geïnitieerd op ART. Genotypische resistentie testen (BRT) is met succes gebruikt in de ontwikkelde landen, zowel voor het toezicht en de monitoring van HIV-1 drug-resistentie bij personen die ART. In deze instellingen, is GRT is geïntegreerd in het continuüm van de zorg voor HIV-1 geïnfecteerde individuen. De meeste internationale richtlijnen adviseren BRT voor volwassen patiënten of kinderen niet ART (eerste lijn en tweede lijn) 13-15, pediatrische patiënten blootgesteld aan preventie van moeder-op-kind overdracht (pMTCT) regimes maar vervolgens geïnfecteerd 16, en in de instellingen met hoge niveaus van overdraagbare resistentie onder acuut geïnfecteerde individuen 13-15. Echter, de kosten, technologie en infrastructuur eisen de uitvoering beperktlegging van een soortgelijke aanpak om resistentie controle in RLS. De Zuid-Afrikaanse hiv-behandeling en richtsnoeren voor monitoring op dit moment geen gebruik van BRT in het begeleiden van de keuze van ART voor individuen niet de eerste lijn regimes 17 aanraden. Individuen ingeschakeld voornamelijk gebaseerd op virologische (HIV-1-RNA virale last) parameters. Maar in 2012, de Zuid-Afrikaanse HIV Artsen Society publiceerde de eerste Zuid-Afrikaanse ARV resistentietest richtlijnen 18. Deze richtlijnen bevelen brt testen voor alle volwassenen falende eerste lijn en tweede lijn ART en voor geïnfecteerde zuigelingen en kinderen blootgesteld aan pMTCT 18. Echter, brt niet aanbevolen 18 voor acuut geïnfecteerde individuen, omdat er geen actueel bewijs voor hoge niveaus van overdraagbare resistentie in zuidelijk Afrika 19-29. Verwacht wordt dat sommige van deze aanbevelingen worden geïntegreerd over de tijd in de nationale treatment en monitoring richtlijnen van de verschillende landen in de regio. Reeds in de 2013 Zuid-Afrikaanse behandelrichtlijnen is er nu aanbeveling van GRT op het moment van de tweede lijn mislukking voor volwassenen en op het moment van eerste-of tweede-lijn PI-gebaseerde regime mislukking voor kinderen 30. Het is aangetoond dat de integratie van BRT in behandelingsrichtlijnen in Zuid-Afrika potentieel kosten-neutraal zou zijn. Gezien de kosten van de tweede lijnregime geneesmiddelen die relatief duurder dan de eerste lijn drugs, met BRT in patiënten die echt moeten worden geschakeld tweede lijn therapie identificeren extra kosten voor het programma niet optreden. Daarnaast kunnen BRT zich ook over andere redenen voor het falen, conserveren behandelingsopties en het genereren van informatie over opkomende resistentie patronen 31. Daarom moeten de kosten van resistentie bewakingsmethoden verder om de toegang, de kwaliteit van de zorg een verbetering verminderend resultaten. Hier presenteren we een BRT methode ontworpen om generieke (open source) primers gebruikt voor reverse transcriptie polymerase-kettingreactie (PCR) en sequentie (tabel 1), en meestal openbron resistentie interpretatie. Voor klinische behandeling, is het protocol aangevuld door een uitgebreide evaluatie en rapportage methode met gespecialiseerde interpretatie van het laboratorium resistentie rapport met dicht naleving van de nationale behandelrichtlijnen. Het protocol bestaat uit vier componenten: 1) HIV ribonucleïnezuur (RNA) extractie, 2) reverse transcriptie en polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie van virale targets, 3) Sequencing 4) Bioinformatics voor de analyse van chromatogrammen, uitlijning, curation en interpretatie van sequence data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 resistentie heeft de potentie om de effectiviteit en impact van antiretrovirale therapie (ART) ernstig in gevaar brengen. Zoals ART-programma&#39;s in sub-Sahara Afrika verder uit te breiden, moeten individuen op ART nauwlettend worden gecontroleerd op het ontstaan ​​van resistentie. Surveillance verzonden resistentie transmissie van virale stammen al resistent ART volgen is ook kritisch. Helaas, resistentie testen is nog steeds niet gemakkelijk toegankelijk met beperkte middelen, want genotypering is duur en vereist geavanceerde laboratorium-en datamanagement-infrastructuur. Een open toegang genotypische resistentie controle methode om individuen te beheren en te beoordelen overgedragen resistentie wordt beschreven. De methode maakt gebruik van gratis open source software voor de interpretatie van resistentie patronen en het genereren van individuele patiënt rapporten. De genotypering protocol heeft een versterkingsfactor van meer dan 95% voor plasma monsters met avIral load&gt; 1000 HIV-1 RNA kopieën / ml. De gevoeligheid aanzienlijk vermindert virale lading &lt;1000 HIV-1 RNA kopieën / ml. De hier beschreven methode werd gevalideerd aan de hand van een methode van HIV-1 drug-resistentie testen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA), de Viroseq genotyperingsmethode. Beperkingen van de hier beschreven werkwijze is het feit dat het niet geautomatiseerd en dat deze evenmin de circulerende recombinante vorm CRF02_AG een validatie panel monsters versterken, hoewel versterkt subtypes A en B van hetzelfde paneel.

De gevalideerde was een modificatie van een eerder beschreven werkwijze 20. De Viroseq genotyperingsmethode, dat door de FDA heeft goedgekeurd, werd gebruikt als referentiemethode in de validatie. Een panel van bekwaamheidstesten monsters verkregen van de Franse nationale agentschappen voor onderzoek naar AIDS en Virale Hepatitis (ANRS) werd gebruikt in de primaire vergelijking tussen de twee methoden. De twee genotyperingswerkwijzen waren 100% concordant in het identificeren van alle klinisch belangrijke drug-resistentie mutaties zoals uitgelegd door het HIVDB programma voor de monsters die met succes werden versterkt door beide methoden. Zoals getoond in Tabel 6, de nucleotide sequenties van de drie paren waren 99.5% identiek. De voorspelde aminozuursequenties zijn 100% identiek. Een monster van de vijf niet met succes konden worden versterkt door Viroseq. Naast het monster niet geamplificeerd door Viroseq de eigen methode niet een tweede monster dat werd getoond amplificereneen circulerende recombinante virus (CRF02_AG) zijn door Viroseq. De drie monsters die versterkt met beide methoden waren subtype B (twee monsters) en subtype A (een monster). <img alt="Figuur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figuur 5. Gebruik van een HKY Neighbor Deelnemen boom gedaan als onderdeel van opeenvolging kwaliteitsborging. Er zijn vier paren / clusters van sequentie met zeer korte genetische afstanden. De genetische afstand tussen RES655 en RES655_1 (dezelfde monsters gesequenced op verschillende dagen) is 0.003. Het is een mogelijke fout met de RES637_1/RES638 paar als hun genetische afstand is te kort (0.075) voor monsters uit verschillende epidemiologisch gekoppelde individuen. Er is nog RES637 op de boom met een afstand van 0,075 in vergelijking met RES638_1. De CQ01/CQ02 cluster suggereert dat de twee monstersvan het panel zijn duplicaten van hetzelfde monster. Ze cluster samen met het subtype B referentie sequentie bevestigt het subtype toegewezen door de REGA Subtypering tool. CQ05 en CQ04 geclusterd met subtypes A en G respectievelijk, terwijl de REGA subtyping hulpmiddel geclassificeerd ze als A en CRF02_AG respectievelijk. Een ander handig hulpmiddel voor HIV subtypering en recombinatie is SCUEL, dat beschikbaar is op http://www.datamonkey.org is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> Een panel van vijf monsters werd gebruikt om de nauwkeurigheid van het eigen methode beoordelen. Tien repliceren genotypen werden gegenereerd voor elk van de vijf monsters. Met behulp van de 16 capillaire 3130xl genetische analyzer, 48 van de 50 genotypen werden gegenereerd uit 24 runs, bereid op dezelfde dag. Voor alle vijf monsters, de voorspelde aminozuursequenties waren 100% concordant tussen replicaten. Voor de nucleïnezuursequenties, there was&gt; 99% paarsgewijs gelijkenis. Gedurende de eerste twee jaren van de toepassing van deze methode werden zestig monsters willekeurig herhaald RNA extractie de sequentie. Er waren geen statistisch significante verschillen tussen de sequentie kwaliteit score en het aantal gemengde basen tussen de herhalingen. Zowel de nucleotide-en aminozuursequenties paarsgewijze vergelijkingen voor de zestig paren waren meer dan 99% identiek. Dus de drug resistentie mutaties voor alle paren waren 100% concordant. Kostenreductie De reactie volumes RT PCR en sequencing werden met minstens de helft ten opzichte van de oorspronkelijke methode 20, 32, zonder aan de kwaliteit van de gegenereerde sequenties. Dit stelde een kostenreductie van 50% van de RT-en PCR-stappen. De nieuwe methode werd oorspronkelijk ontworpen voor zes sequencing primer sequentie<html> Alle 99 codons van het protease-gen en de eerste 300 codons van het reverse transcriptase gen 20, 32. Vergelijkbare methoden gebruiken ook zes tot acht primers 33, 34. Enkele recent gepubliceerde methoden hebben gebruikt minder dan zes primers, hoewel soms sequencing de protease en RT genen seprately 35, 36. We wilden het aantal sequencing primers verminderen 6-4 (figuur 6) <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figuur 6. Vergelijking aaneengesloten sequenties van zes vs vier sequencing primers voor het genereren van het 1197 bp pol-sequentie die alle 99 HIV-1 protease codons en de eerste 300 codons van het reverse transcriptase gen.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. Sequenties uit een set van 17 monsters geproduceerd zes primers werden vergeleken met sequenties gegenereerd na uitsluiting van twee primers (MAW46 en RTY). De subtypen waren 14 subtype C, twee subtype B, en een subtype A. Er waren geen significante verschillen in volgorde kwaliteitsscores. Ook de gemiddelde paarsgewijze gelijkheid tussen de 17 paren van nucleïnezuur was 99% en 100% op het aminozuurniveau. Zo verminderen de sequencing primers 6-4 resulteerde in een verlaging van de kosten sequencing met bijna een derde. De enige proprietary software tool gebruikt in dit protocol was Geneious voor volgorde assemblage. De drug resistentie interpretatie hulpmiddelen, evenals het rapport genereren tools zijn allemaal gratis, open toegang gereedschappen. Dit vermindert de kosten verder door het elimineren van de kosten voor het gebruik van eigen software. Verder collective onderhandelingen kon de reagentia voor dit protocol te worden verpakt in een kit voor gemakkelijke toegang van Life Technologies en is beschikbaar als de Saturn / Life Technologies genotyperingsmethode 37. Bovendien kan Saturnus leden toegang tot de reagentia tegen een gereduceerde prijs. Klinische setting De beschreven protocol is geïmplementeerd in de monitoring en bewaking van resistentie in een landelijke gemeenschap in KwaZulu-Natal. Een totaal van 604 genotypen werden gegenereerd uit klinische monsters tussen december 2010 en mei 2013 in een versterking van 95% voor monsters met een viral load&gt; 1000 RNA kopieën / ml. Deze klinische HIV resistentie onderzoek werd goedgekeurd door het Biomedical Research Ethics Committee van de Universiteit van KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) en het Comite voor Onderzoek van de Gezondheid van de KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10). Individuele patiënt rapporten zijn gegenereerd en teruggestuurd naar de kliniekenvoor een goede behandeling. Tweeënzeventig (72) genotypen werden ook gegenereerd als onderdeel van een surveillance van overdraagbare resistentie studie, genesteld in een grote prospectieve basis van de bevolking HIV-surveillance studie. De primaire monsters waren naaldprik bloed in EDTA microtubes verzameld. Bij genotypering was er een versterking van 79% 19. Ethiek goedkeuring voor de genotypering van monsters uit de surveillance studie werd verkregen van de Universiteit van KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee (ref. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Naam </td><td> Sequentie </td><td> Lengte </td><td> Richting </td><td> HXB2 Positie </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Vooruit </td><td> 2028-2050 </td><td> 1e ronde PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverse </td><td> 3539-3509 </td><td> 1e ronde PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> 20 </td><td> Vooruit </td><td> 2147-2166 </td><td> 2e ronde PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 3462-3441 </td><td> 2e ronde PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Vooruit </td><td> 2486-2508 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Vooruit </td><td> 2956-2994 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Vooruit </td><td> 2251-2277 </td><td> Sequencing </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reverse transcriptie PCR en sequencing aangepaste primers gebruikt bij het ​​genereren van een 1197 bp fragment pol die alle 99 HIV-1 protease codons en de eerste 300 codons van het omgekeerde trascriptase gen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. dNTP / Primer mix voor de reverse transcriptie reactie. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volume (ml) / reactie </td><td> Concentratie / reactie </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Superscript III reverse transcriptase (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. Enzym mix voor de reverse transcriptie reactie. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volume (ml) / reactie </td><td> Eindconcentratie / Reaction </td></tr><tr><td> DEPC behandeld water </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR Buffer (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Froward primer (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Reverse primer (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq polymerase (5 U / ml) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> Subtotaal </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Master mix voor de geneste PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volume (ml) / reactie </td><td> Concentratie / reactie </td></tr><tr><td> DEPC behandeld water </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequencing Buffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> Big Dye terminator Sequencing mix </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 5. Master mix voor de sequentie reacties. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA Gelijkenis </td></tr><tr><td> Sample ID </td><td> Subtype </td><td> Kwaliteitsscore </td><td> PR Mutaties </td><td> RT mutaties </td><td> Subtype </td><td> Kwaliteitsscore </td><td> PR mutaties </td><td> RT Mutaties </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> Een </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> Een </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabel 6. Vergelijkende Results uit een parallelle analyse tussen de Viroseq genotyperingsmethode en de eigen methode met behulp van een panel van monsters die door de ANRS.

Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Methode voor het nieuwe anti-kanker medicijn ontwikkeling met behulp van Tumor Explantaten van Chirurgische Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Een orthotope muizenmodel van menselijke prostaatkankercellen Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor gelokaliseerde Histopathologisch Analyse: Part 2 Epiretinal Implantaten met Retina Kopspijkers

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

Een nieuwe benadering voor de administratie van medicijnen en vloeistoffen in noodscenario&#39;s and Settings

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Pancreas duct infusie: een effectieve en selectieve methode van drug en virale levering

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...