Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
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Die Autoren danken allen Kolleginnen und Kollegen, die diese Arbeit möglich gemacht, vor allem Maya Balamane, Elizabeth Johnston Weiß, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty anerkennen , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott und Lungani Ndwandwe. Die Autoren möchten auch alle Mitarbeiter der Abteilung für Gesundheit und Africa Centre Personal, das Hlabisa HIV-Behandlung und Pflege-Programm arbeiten zu danken.

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<div> Diese Arbeit wurde durch den Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Europäische Union (SANTE 2007 147-790), des US-Zentrums für Krankheiten unterstützt Kontrolle über CAPRISA (Projekttitel: Stärkung der Gesundheitssysteme und HIV Behandlungsfehler (HIV- TFC)) und die Schweizer South African Joint Research Programme (SSJRP) Forschungsförderung mit dem Titel &quot;Swiss Prot / Südafrika: Protein Bioinformatics Resource Development für wichtige gesundheitsbezogenen Krankheitserreger.&quot; RL wird durch den Wellcome Trust unterstützt (Fördernummer 090999 / Z / 09 / Z). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren. </div>

Mehrere kostengünstige Inhouse-Verfahren wurden in den Bemühungen, versuchen HIV-Arzneimittelresistenz Genotypisierung erschwinglicher 33, 34, 36, um beschrieben. Es besteht kein Zweifel an der Notwendigkeit, Drogenresistenztests in die Kontinuität der Betreuung für Personen, die antiretrovirale Therapie mit beschränkten Ressourcen zu integrieren. Allerdings konzentrieren sich die meisten der berichteten Verfahren über die Anwendung der Arzneimittel-Resistenz Genotypisierung bei der Überwachung der Arzneimittelresistenz bei einer Bevölkerungsebene. Der Saturn / Life Technologies Genotypisierungsmethode ist eine vollständig integrierte Protokoll für die Überwachung und Kontrolle der Medikamentenresistenz. Diese Methode wurde entwickelt, um eine kostengünstige Umsetzung Protokoll meist Open Source und Open Access Bioinformatik-Ressourcen für die Interpretation von Resistenzen und die Erzeugung von Berichten für die klinische Management. Es wurde durch den Vergleich mit der FDA zugelassen ViroSeq Genotypisierungsmethode zu sein gezeigtpräzise bei der Identifizierung von Arzneimittelresistenzmutationen von einem Gremium von ANRS Eignungsprüfungen Proben in 100% der Laborproben Tafel, die erfolgreich verstärkt wurden. Die Genauigkeit wurde auch an klinischen Proben von Subtyp-C-Viren, die dominierende Subtyp im südlichen Afrika untersucht. Das Verfahren wurde so genau auf Subtyp C-Proben wie am Subtyp A und B. Wenn das Verfahren würde in anderen Teilen der Welt weit verbreitet ist, wo CRF02_AG verwendet werden, gibt es einen Bedarf zur Modifizierung der Primer da das Verfahren gegen eine der Plattenproben, die gezeigt wurde, haben CRF02_AG verstärken. Alternativ kann ein degenerierten Primer empfindlich auf alle Viren der Gruppe M 33, 36 könnten in Regionen eingesetzt werden, wo der Subtyp Verteilung heterogener ist 38. Die Empfindlichkeit der reverse Transkription und PCR kann durch Extrahieren von RNA aus höheren Plasmavolumina wie 500 ml erhöht werden. Das Plasma kann CENTRIF werdenbei 21.000 g für 90 min uged, um die Viruspartikel, bevor mit dem Protokoll, wie durch die virale RNA-Extraktion QIAamp Mini Kit beschrieben fortfahren konzentrieren. Wie gezeigt, hat das neue Verfahren den zusätzlichen Vorteil, dass sie umfassende Berichte zur individuellen Patientenbehandlung erzeugt. Diese Berichte sind eine Konsolidierung des Genotyps, der immunologischen und virologischen Überwachungsdaten sowie klinische und Behandlungsgeschichte von RegaDB. Dies wird durch eine detaillierte Interpretation der Laborresistenzprofil, gefolgt von einem ebenso detaillierte Überprüfung der Krankengeschichte des Patienten sowie Behandlungsempfehlungen begleitet. Die Verwendung von einem Facharzt, um die Berichte zu überprüfen und Behandlungsempfehlungen für die Patienten bietet die dringend benötigte Mentoring für Krankenschwester Praktiker sowie unerfahrene Kliniker, die zunehmend die Bereitstellung sind ART in Südafrika als Teil der WHO-Empfehlungen für die Aufgabenverschiebung. Diese klinischenBerichte haben gezeigt, dass effektive Lernhilfen für Ärzte mit wenig oder keiner Erfahrung in der Arzneimittelresistenzmanagement sein. Aus Patientensicht, reduziert unser Verfahren die Notwendigkeit, zur zentralen Standorten reisen, um HIV-Spezialist Dienste zuzugreifen. Somit ist die beschriebene Protokoll als Ganzes bietet eine gute Plattform, durch die HIV-Arzneimittelresistenz-Management integriert werden können, zu einem erschwinglichen Preis, in der Kontinuität der Betreuung für HIV-infizierten Personen in Ermangelung ART. Die erzeugten Daten können für epidemiologische Zwecke verwendet werden, um die Entwicklung und die Übertragung von Resistenzen in der Gemeinde zu beurteilen. Die Größe des pol-Fragment erzeugt wird, ist gut genug für komplexere phylogenetischen Analyse, die ein besseres Verständnis der Epidemie auf die Bevölkerung produzieren wird.

Die HIV-Epidemie im südlichen Afrika wurde rasch entwickelnden 1 mit einer gleichzeitigen exponentiellen Anstieg der Personen, die antiretrovirale Therapie (ART), vor allem in Südafrika, 2, 3. Als Beweise für die epidemiologische Auswirkungen von großen Behandlungsprogramme bei der Verringerung der Inzidenz 4 und der steigenden Lebenserwartung in begrenzten Ressource-Einstellungen (RLS) 5 weiterhin zu akkumulieren, werden Bemühungen um die Abdeckung zu erhöhen ART intensiviert werden. Die Entwicklung von Richtlinien zur Nutzung der Behandlung als Prävention Werkzeug 6, 7 unter der Test-und Behandlungsprogramme bedeutet, dass die absolute Zahl der Personen, auf die Behandlung wird weiter zunehmen. Eine große Anzahl von Personen auf ART für längere Zeit als die durchschnittliche Lebenserwartung der Menschen auf ART nähert, dass der HIV-infizierten Bevölkerung 8 sein. Die Entwicklung und Übertragung von HIV Resistenzen hat always worden, als eine Bedrohung für die Leistungen der ART 12.09. Somit besteht ein Bedarf für eine strengere Überwachung und Kontrolle der Arzneimittelresistenz als mehr Menschen auf ART eingeleitet. Genotypische Resistenztestung Drogen (BRT) wurde erfolgreich in den entwickelten Ländern verwendet worden, sowohl für die Überwachung sowie die Überwachung der HIV-1-Resistenzen in Personen erhalten ART. In diesen Einstellungen hat GRT in die Kontinuität der Betreuung für HIV-1-infizierten Personen integriert. Die meisten internationalen Leitlinien empfehlen BRT für Erwachsene oder pädiatrische Patienten, bei denen ART (First-Line-und Second-Line) 13-15, anschließend infizierte pädiatrische Patienten, die Prävention der Mutter-zu-Kind-Übertragung (pMTCT) Therapien ausgesetzt, sondern 16, und in den Einstellungen mit Hochebenen übertragen Medikamentenresistenz bei akut infizierten Personen 13-15. Allerdings haben die Kosten, Technologie-und Infrastrukturanforderungen der Umsetzung beschränkttation von ähnlichen Ansätzen zur Arzneimittelresistenz Überwachung in RLS. Die südafrikanische HIV-Behandlung und Überwachung von Richtlinien derzeit nicht empfehlen die Verwendung von BRT in Führungs Wahl der ART für Personen, andernfalls First-Line-Regimen 17. Personen überwiegend auf virologische (HIV-1-RNA-Viruslast) Parametern umgeschaltet. Doch im Jahr 2012, veröffentlichte der Southern African HIV Kliniker-Gesellschaft die ersten Southern African ARV Resistenzen Prüfrichtlinien 18. Diese Richtlinien empfehlen GRT Test für alle Erwachsenen in Ermangelung First-Line-und Second-Line-ART und für infizierte Säuglinge und Kinder bis 18 pMTCT ausgesetzt. Es wird jedoch nicht empfohlen GRT 18 für akut infizierten Personen, weil es keine aktuellen Belege für hohe übertragen Medikamentenresistenz im südlichen Afrika 19-29. Es wird erwartet, dass einige dieser Empfehlungen werden im Laufe der Zeit in die nationale tre integriert werdenatment Richtlinien und Überwachung der verschiedenen Länder in der Region. Bereits in den 2013 South African Behandlungsrichtlinien gibt es jetzt Empfehlung des GRT zum Zeitpunkt der Second-Line-Ausfall für Erwachsene und bei der ersten oder zweiten Linie PI-basierten Regime Ausfall für Kinder 30. Es hat sich gezeigt, dass die Einbeziehung in die Behandlungsrichtlinien GRT in Südafrika würde möglicherweise kostenneutral sein. In Anbetracht der Kosten der zweiten Zeile Therapie Medikamente, die relativ teurer als die erste Zeile Drogen sind, mit GRT um Patienten, die wirklich brauchen, um zu Zweitlinientherapie identifizieren schaltet werden nicht führen keine zusätzlichen Kosten für das Programm. Darüber hinaus können GRT auch andere Gründe für das Scheitern zu identifizieren, zu sparen Behandlungsmöglichkeiten und generieren Informationen zu neuen Resistenzmuster 31. Daher ist es notwendig, die Kosten der Arzneimittelresistenz Überwachungsmethoden noch weiter, um den Zugang, die Qualität der Versorgung zu verbessern eine Reduzierungd Ergebnisse. Hier präsentieren wir eine Methode entwickelt, um GRT generische (Open Source) Primer für Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Sequenzierung (Tabelle 1) sowie vor allem Open-Source-Software für die Medikamentenresistenz Interpretation zu verwenden. Für die klinische Management, wird das Protokoll durch eine umfassende Überprüfung und Berichterstattung Verfahren mit Fach Interpretation der Labor Resistenzen Bericht mit engen Einhaltung der nationalen Behandlungsrichtlinien ergänzt. Das Protokoll ist in vier Komponenten unterteilt: 1) HIV-Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion, 2) Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation von viralen Targets 3) Sequenzierung und 4) Bioinformatics Verfahren zur Analyse von Chromatogrammen, Ausrichtung, Kuration und Interpretation der Sequenzdaten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1-Resistenzen hat das Potenzial, ernsthaft gefährden die Wirksamkeit und die Auswirkungen der antiretroviralen Therapie (ART). Wie ART-Programme in Afrika südlich der Sahara weiter ausbauen, sollten die Betroffenen auf ART eng für die Entstehung von Resistenzen überwacht werden. Überwachung der Arzneimittelresistenz übertragen, die Übertragung von Virusstämme bereits resistent gegen ART verfolgen ist ebenfalls kritisch. Leider ist Drogenresistenztests immer noch nicht in der Ressourcen begrenzte Einstellungen leicht zugänglich, weil die Genotypisierung ist teuer und erfordert anspruchsvolle Labor-und Datenmanagement-Infrastruktur. Ein offener Zugang genotypische Resistenzüberwachung Drogen Methode, um Personen zu verwalten und zu bewerten übertragen Resistenzen beschrieben. Das Verfahren nutzt kostenlose Open-Source-Software für die Auslegung des Arzneimittelresistenzmuster und die Erzeugung von individuellen Patientenberichte. Die Genotypisierung Protokoll weist eine Verstärkungsrate von mehr als 95% für die Plasmaproben mit avIRAL Last&gt; 1.000 HIV-1 RNA Kopien / ml. Die Empfindlichkeit nimmt deutlich für Viruslast &lt;1.000 HIV-1 RNA Kopien / ml. Das hier beschriebene Verfahren wurde gegen eine Methode der HIV-1-Resistenzen Prüfung durch den US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA), der ViroSeq Genotypisierungsmethode genehmigt validiert. Einschränkungen der hier beschriebenen Verfahren umfassen die Tatsache, daß es nicht automatisiert ist und daß es auch nicht zu den zirkulierenden rekombinanten Form CRF02_AG aus einer Gruppe von Validierungsproben verwendet, obwohl es verstärkt Subtypen A und B aus der gleichen Platte.

Die validierte Verfahren war eine Modifikation eines früher berichteten Verfahren 20. Die ViroSeq Genotypisierung Methode, die von der FDA zugelassen wurde, wurde als Referenzmethode in der Validierung. Ein Panel von Eignungsprüfungsproben aus den Französisch Nationalen Agenturen für Forschung über Aids und Hepatitis (ANRS) erhalten in der Primär Vergleich zwischen den beiden Methoden. Die beiden Genotypisierung Methoden waren bei der Identifizierung aller klinisch relevanten Arzneimittelresistenz-assoziierten Mutationen wie von der HIVDB Programm für die Proben, die erfolgreich von beiden Methoden verstärkt wurden interpretiert 100% übereinstimm. Wie in Tabelle 6 gezeigt, waren die Nukleotidsequenzen der drei Paare 99,5% identisch. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen zu 100% identisch. Eine Probe von fünf nicht erfolgreich durch ViroSeq verstärkt werden. Neben der Probe nicht durch ViroSeq verstärkt, habe die Hausmethode, eine zweite Probe, die gezeigt wurde, verstärkenein umlauf rekombinanten Virus (CRF02_AG) durch ViroSeq sein. Die drei Proben, die mit beiden Methoden verstärkt waren Subtyp B (zwei Proben) und Subtyp A (eine Probe). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> 5. Verwendung eines HKY Nachbar Joining Baum als Teil der Qualitätssicherung Reihenfolge getan. Es gibt vier Paare / Cluster-Sequenz mit sehr kurzen genetischen Distanzen. Der genetische Abstand zwischen RES655 und RES655_1 (gleiche Proben an verschiedenen Tagen sequenziert) beträgt 0,003. Das ist eine potenzielle Fehler mit dem RES637_1/RES638 Paar als ihre genetische Distanz ist zu kurz (0,075) für Proben aus verschiedenen epidemiologisch nicht verknüpften Personen. Es ist ein weiteres RES637 auf dem Baum mit einem Abstand von 0,075 im Vergleich zu RES638_1. Die CQ01/CQ02 Cluster nahe, dass die zwei Probenvon der Platte sind Duplikate der gleichen Probe. Sie Cluster zusammen mit dem Subtyp B Referenzsequenz Bestätigung der Subtyp von der REGA Subtypisierung Werkzeug zugeordnet. CQ05 und CQ04 mit Subtypen A und G jeweils gruppierten, während die REGA Subtypisierung Werkzeug klassifiziert sie als A und CRF02_AG sind. Ein weiteres nützliches Tool für die HIV-Subtypen und Rekombination SCUEL, die an http://www.datamonkey.org ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Ein Panel von fünf Proben wurde verwendet, um die Genauigkeit der Hausmethode beurteilt. Zehn Wiederholungs Genotypen wurden für jede der fünf Proben erzeugt. Verwendung der Kapillare 16 3130xl Genetic Analyzer, 48 der 50 Genotypen von 24 Läufen erzeugt wird, am gleichen Tag hergestellt. Für alle fünf Proben wurden die vorhergesagten Aminosäuresequenzen zu 100% übereinstimm zwischen Wiederholungen. Für die Nukleinsäuresequenzen, there war&gt; 99% paarweise Ähnlichkeit. Während der ersten zwei Jahre der Anwendung dieses Verfahrens, sechzig Proben wurden zufällig aus RNA-Extraktion zur Sequenzierung wiederholt. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Sequenz Qualitätsfaktor und der Anzahl der gemischten Basen zwischen den Wiederholungen. Sowohl die Nukleotid-und Aminosäurepaarweise Vergleiche der sechzig Paare waren mehr als 99% identisch ist. So waren die Arzneimittel-Resistenz-Mutationen für alle Paare 100% übereinstimm. Kostenreduzierung Die Reaktionsvolumina für RT-PCR und Sequenzierung wurden mindestens die Hälfte, bezogen auf das ursprüngliche Verfahren 20, 32 reduziert wird, ohne auf die Qualität der erzeugten Sequenzen. Dies ermöglichte eine Verringerung der Kosten von 50% für die RT-und PCR-Stufen. Die neue Methode wurde ursprünglich entwickelt, um mit sechs Sequenzierprimer Sequenz arbeiten<html> Alle 99 Codons des Protease-Gens und die ersten 300 Kodons des Reverse-Transkriptase-Gen 20, 32. Ähnliche Verfahren auch sechs bis acht Primer 33, 34. Einige kürzlich veröffentlichten Methoden sind weniger als sechs Primer verwendet, wenn auch manchmal die Sequenzierung der Protease-und RT-Gene seprately 35, 36. Wir versuchten, die Anzahl von Sequenzierungsprimer von sechs auf vier zu reduzieren (Fig. 6) <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> 6. Vergleich von aufeinanderfolgenden Sequenzen von sechs vs vier Sequenzierungsprimer für die Erzeugung des 1197 bp pol-Sequenz, die alle 99 HIV-1-Protease-Codons und die ersten 300 Kodons des Reverse-Transkriptase-Gens.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. Sequenzen aus einem Satz von 17 Proben von sechs Primern erzeugt wurden, Sequenzen nach dem Ausschluss von zwei Primern (MAW46 und RTY) erzeugt, verglichen. Die Subtypen waren 14 Subtyp C, zwei Subtyp B und einen Subtyp A. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Sequenz Qualitätswerte. Auch die durchschnittliche paarweise Identität zwischen den 17 Paaren von Nukleinsäure betrug 99% und 100% auf der Aminosäureebene. Daher ist die Verringerung der Sequenzierprimer von sechs auf vier zu einer Reduktion in der Sequenzierungskosten um fast ein Drittel. Das einzige, proprietäre Software-Tool in diesem Protokoll verwendet wurde, war für Geneious Sequenz Montage. Die Medikamentenresistenz Interpretationswerkzeuge, sowie der Bericht Erzeugung Tools sind alle kostenlos, Open-Access-Tools. Dies verringert die Kosten durch den Wegfall der Kosten, die mit der Verwendung proprietärer Software verbunden. Ferner collectivE Verhandlungen erlaubt die Reagenzien für dieses Protokoll in einem Kit für den einfachen Zugriff von Life Technologies verpackt werden und ist als Saturn / Life Technologies Genotypisierung Verfahren 37 zur Verfügung. Darüber hinaus können Mitglieder Saturn die Reagenzien zu einem vergünstigten Preis zu gelangen. Klinische Einstellung Das beschriebene Protokoll wurde in der Kontrolle und Überwachung der Medikamentenresistenz in einer ländlichen Gemeinde in der Provinz KwaZulu-Natal umgesetzt. Insgesamt 604 Genotypen wurden aus klinischen Proben zwischen Dezember 2010 und Mai 2013 bei einer Verstärkung von 95% für Proben mit Viruslast&gt; 1.000 RNA Kopien / ml erzeugt. Diese klinische HIV-Arzneimittelresistenz Studie wurde von der Ethikkommission Biomedical Research der Universität von KwaZulu-Natal (Ref. BF052/10) und des Gesundheitsforschungsausschuss der KwaZulu-Natal-Abteilung der Gesundheit (vgl. HRKM 176/10) zugelassen. Individuelle Patientenberichte wurden erzeugt und zurück zu den Kliniken geschicktzum Patientenmanagement. Siebzig zwei (72) Genotypen wurden auch als Teil eines Überwachungs der übertragenen Resistenzen Studie erzeugt, innerhalb einer großen prospektiven populationsbasierten Studie HIV-Überwachung verschachtelt. Die primären Proben waren Nadelstich Vollblut in EDTA-Röhrchen gesammelt. Bei Genotypisierung gab es eine Verstärkungsrate von 79% 19. Ethik-Zulassung für die Genotypisierung von Proben aus der Surveillance-Studie wurde von der Universität von KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee (siehe BE066107) erhalten. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Namen </td><td> Folge </td><td> Länge </td><td> Richtung </td><td> HXB2 Position </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Vorwärts </td><td> 2028-2050 </td><td> Ersten PCR-Runde </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Umge </td><td> 3539-3509 </td><td> Ersten PCR-Runde </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Vorwärts </td><td> 2147-2166 </td><td> 2. Runde PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Umge </td><td> 3462-3441 </td><td> 2. Runde PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Vorwärts </td><td> 2486-2508 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Umge </td><td> 2630-2604 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Vorwärts </td><td> 2956-2994 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Umge </td><td> 3129-3101 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Umge </td><td> 2967-2946 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Vorwärts </td><td> 2251-2277 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reverse Transkription, PCR und Sequenzierung individuelle Primer bei der Erzeugung eines 1197 bp pol-Fragment, das alle 99 HIV-1-Protease-Codons und die ersten 300 Kodons des Rückwärts trascriptase Gens verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. dNTP / Primer mischen für die reverse Transkription Reaktion. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; Cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ml) / Reaktion </td><td> Konzentration / Reaktion </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Superscript Reverse Transcriptase III (200U/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Enzym-Mix für die reverse Transkription Reaktion. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ml) / Reaktion </td><td> Endgültige Konzentration / Reaktion </td></tr><tr><td> DEPC behandeltem Wasser </td><td> 18,4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR-Puffer (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTP-Mix (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Froward Primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Rückwärts-Primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq-Polymerase (5 U / ml) </td><td> 0,1 </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Zwischensumme </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Master-Mix für die verschachtelte PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ml) / Reaktion </td><td> Konzentration / Reaktion </td></tr><tr><td> DEPC behandeltem Wasser </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenzierungspuffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> Big Dye Terminator Sequencing-Mix </td><td> 0,4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Mastermix für den Sequenzierungsreaktionen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> ViroSeq </td><td align="center" colspan="4"> Sonstige Innen </td><td rowspan="2"> NA% Ähnlichkeit </td></tr><tr><td> Proben-ID </td><td> Unterart </td><td> Quality Score </td><td> PR-Mutationen </td><td> RT-Mutationen </td><td> Unterart </td><td> Quality Score </td><td> PR-Mutationen </td><td> RT Mutationen </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99,9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98,4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Vergleichende Results von einer parallelen Analyse zwischen dem ViroSeq Genotypisierung Methode und der Hausmethode unter Verwendung einer Reihe von Proben durch die ANRS Verfügung gestellt.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

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