Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
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Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi che hanno reso possibile questo lavoro, in particolare Maya Balamane, Elizabeth Johnston Bianco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, e Lungani Ndwandwe. Gli autori desiderano inoltre ringraziare tutto il personale del Dipartimento di Salute e personale Africa Centro che lavorano la Hlabisa trattamento di HIV e il programma Care.

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<div> Questo lavoro è stato supportato dal Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Unione europea (SANTE 2007 147-790), il Centro statunitense per il controllo delle malattie tramite CAPRISA (titolo del progetto: rafforzamento dei sistemi sanitari e di fallimento del trattamento HIV (HIV- TFC)), e il programma Swiss South African comune di ricerca (SSJRP) assegno di ricerca dal titolo &quot;Swiss Prot / Sudafrica: Proteine ​​Bioinformatica Sviluppo delle risorse per importanti patogeni relative alla salute&quot;. RL è supportato dal Wellcome Trust (codice di autorizzazione 090.999 / Z / 09 / Z). i finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti. </div>

Diversi low cost metodi in-house sono state descritte negli sforzi per cercare di rendere l&#39;HIV farmaco-resistenza genotipizzazione più abbordabile 33, 34, 36. Non vi è alcun dubbio sulla necessità di integrare test di resistenza ai farmaci nel continuum di cura per le persone in terapia antiretrovirale in paesi a risorse limitate. Tuttavia, la maggior parte dei metodi riportati riguardare l&#39;applicazione di farmacoresistenza genotipizzazione nella sorveglianza della resistenza ai farmaci a livello di popolazione. Il metodo di genotipizzazione Saturno / Life Technologies è un protocollo completamente integrato per la sorveglianza e il monitoraggio della resistenza ai farmaci. Questo metodo è stato progettato per essere un protocollo di attuazione conveniente soprattutto open source e aperto le risorse di bioinformatica di accesso per l&#39;interpretazione della resistenza ai farmaci e la generazione di report per la gestione clinica. E &#39;stato dimostrato attraverso il confronto con il metodo di genotipizzazione Viroseq approvato dalla FDA per essereaccurate per identificare mutazioni di resistenza droga da un panel di ANRS campioni di prova di abilità, nel 100% dei campioni di pannelli di laboratorio che sono stati amplificati con successo. La precisione è stata valutata anche su campioni clinici di virus sottotipo C, il sottotipo più dominante in Africa australe. Il metodo era esatto sul sottotipo campioni C come era il sottotipo A e B. Tuttavia, se il metodo potrebbe essere utilizzato in altre parti del mondo dove CRF02_AG è prevalente, vi è la necessità per la modifica dei primer in quanto il metodo fallito per amplificare uno dei campioni del pannello che è stato dimostrato di avere CRF02_AG. In alternativa, una serie di primer degenerato sensibili a tutto gruppo M virus 33, 36 potrebbe essere utilizzata in regioni in cui la distribuzione sottotipo è più eterogenea 38. La sensibilità della trascrizione inversa e PCR può essere aumentata con l&#39;estrazione di RNA da maggiori volumi di plasma, come 500 ml. Il plasma può essere centrifuged a 21.000 xg per 90 min a concentrare le particelle virali prima di procedere con il protocollo come descritto dal mini kit di estrazione di RNA virale QIAamp. Come mostrato, il nuovo metodo ha un ulteriore vantaggio che produce rapporti completi per la gestione del singolo paziente. Queste relazioni sono un consolidamento del genotipo, il immunologici e virologici dati di monitoraggio così come la storia clinica e il trattamento da RegaDB. Questo è accompagnato da una interpretazione laboratorio dettagliata del profilo di resistenza seguita da una revisione altrettanto dettagliata della storia clinica del paziente e raccomandazioni di trattamento. L&#39;utilizzo di un medico specialista per esaminare i rapporti e fornire raccomandazioni per il trattamento per i pazienti fornisce mentorship tanto necessaria per infermieri e medici inesperti, che sono sempre forniscono ART in Sud Africa come parte delle raccomandazioni dell&#39;OMS per le attività di spostamento. Questi clinicarelazioni hanno dimostrato di essere strumenti didattici efficaci per i medici con poca o nessuna esperienza nella gestione della resistenza ai farmaci. Dal punto di vista del paziente, il nostro metodo riduce la necessità di recarsi in luoghi centralizzati per accedere ai servizi di HIV specialistici. Pertanto, il protocollo descritto nel suo complesso offre una buona piattaforma attraverso la quale l&#39;HIV gestione farmacoresistenza può essere integrato, ad un costo accessibile, nel continuum di cure per individui infetti da HIV in mancanza ART. I dati generati possono essere usate per scopi epidemiologici per valutare l&#39;evoluzione e trasmissione di farmacoresistenza nella comunità. La dimensione del frammento pol generato è sufficiente per più complessa analisi filogenetica che produrrà una migliore comprensione della epidemia a livello di popolazione.

L&#39;epidemia di HIV in Africa australe si è evoluto rapidamente 1 con un aumento esponenziale concomitante persone in terapia antiretrovirale (ART), soprattutto in Sud Africa 2, 3. Come prova sull&#39;impatto epidemiologico dei programmi di trattamento su larga scala nel ridurre l&#39;incidenza 4 e aumentando l&#39;aspettativa di vita in contesti a risorse limitate (RLS) 5 continua ad accumularsi, saranno intensificati gli sforzi per aumentare la copertura ART. L&#39;evoluzione di orientamenti verso l&#39;uso del trattamento come strumento di prevenzione 6, 7 sotto test e programmi di trattamento significa che il numero assoluto di individui in trattamento aumenterà ulteriormente. Un gran numero di persone saranno in ART per periodi di tempo più lunghi come l&#39;aspettativa di vita media degli individui su ART si avvicina a quella della popolazione infetta da HIV 8. Lo sviluppo e la trasmissione di resistenza ai farmaci HIV ha Always stato considerato una minaccia per le conquiste della ART 9-12. Pertanto, vi è la necessità per la sorveglianza ed il monitoraggio della resistenza ai farmaci più rigorosa come più individui sono avviate su ART. Test di resistenza ai farmaci genotipica (TSL) è stato utilizzato con successo nei paesi sviluppati, sia per la sorveglianza e il monitoraggio del virus HIV-1 farmaco-resistenza nei soggetti trattati con ART. In queste impostazioni, TSL è stato integrato nel continuum di cura per l&#39;HIV-1 individui infetti. La maggior parte delle linee guida internazionali raccomandano tsl per i pazienti pediatrici mancanza ART (di prima linea e di seconda linea) 13-15 adulto o, pazienti pediatrici esposti alla prevenzione della trasmissione da madre a figlio (PMTCT) regimi, ma successivamente infettati 16, e in ambienti con alti livelli di resistenza trasmessa droga tra gli individui con infezione acuta 13-15. Tuttavia, il costo, la tecnologia e infrastruttura, hanno limitato l&#39;attuazionezione di approcci simili alla droga monitoraggio della resistenza in RLS. Il trattamento South African HIV e il monitoraggio attualmente non raccomandano l&#39;uso di tsl nel guidare la scelta di ART per gli individui in mancanza di prima linea regimi 17. Gli individui sono accesi basata principalmente su parametri (carico virale di HIV-1 RNA) virologica. Tuttavia, nel 2012, il Southern African HIV clinici Society ha pubblicato le prime linee guida del Sud ARV africana test resistenza ai farmaci 18. Queste linee guida raccomandano test tsl per tutti gli adulti in mancanza di prima linea e di seconda linea ART e per i neonati infetti e bambini esposti a PMTCT 18. Tuttavia, TSL non è raccomandato 18 per gli individui con infezione acuta perché non ci sono evidenze attuali livelli elevati di resistenza ai farmaci trasmessa in Sud Africa 19-29. Si prevede che alcune di queste raccomandazioni saranno integrati nel tempo in tre nazionaliatment e monitoraggio linee guida dei vari paesi della regione. Già, in 2013 linee guida di trattamento sudafricani ora c&#39;è la raccomandazione di tsl al momento del guasto di seconda linea per gli adulti e al momento del guasto regime basato-PI-prima o seconda linea per i bambini 30. E &#39;stato dimostrato che l&#39;integrazione GRT nelle linee guida di trattamento in Sud Africa sarebbe potenzialmente costo-neutrale. Considerando il costo dei farmaci di seconda linea di regime che sono relativamente più costosi rispetto ai farmaci di prima linea, con TSL per identificare i pazienti che hanno veramente bisogno di essere passato a terapia di seconda linea non comporterà alcun costo aggiuntivo per il programma. Inoltre, GRT può anche identificare altre ragioni per il fallimento, conservare le opzioni di trattamento e generare informazioni sui modelli di resistenza emergenti 31. Pertanto, è necessario ridurre il costo di metodi di monitoraggio della farmaco resistenza ulteriormente per migliorare l&#39;accesso, la qualità delle cure und esiti. Qui, vi presentiamo un metodo GRT progettato per utilizzare generici (open source) primer per la trascrizione inversa, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento (Tabella 1), così come il software open source per lo più per l&#39;interpretazione resistenza ai farmaci. Per la gestione clinica, il protocollo è accompagnato da una revisione e reporting metodo completo con l&#39;interpretazione specialista del farmaco rapporto resistenza laboratorio con stretta aderenza alle linee guida nazionali di trattamento. Il protocollo è diviso in quattro componenti differenti; 1) HIV Acido ribonucleico (RNA) Estrazione, 2) trascrizione inversa e Polymerase Chain Reaction (PCR) amplificazione di bersagli virali, 3) sequenziali e 4) metodi bioinformatici per l&#39;analisi dei cromatogrammi, allineamento, curation e l&#39;interpretazione dei dati di sequenza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
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			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 farmacoresistenza ha il potenziale di compromettere seriamente l&#39;efficacia e l&#39;impatto della terapia antiretrovirale (ART). Poiché i programmi ART nell&#39;Africa sub-sahariana continuano ad espandersi, gli individui su ART devono essere attentamente monitorati per la comparsa di resistenza ai farmaci. Sorveglianza della resistenza trasmessa farmaco per monitorare la trasmissione di ceppi virali resistenti ai già ART è anche critico. Purtroppo, test di resistenza ai farmaci non è ancora facilmente accessibile nelle impostazioni limitate risorse, perché la genotipizzazione è costosa e richiede sofisticate di laboratorio e infrastruttura di gestione dei dati. Un genotipica metodo di monitoraggio farmacoresistenza accesso aperto per gestire gli individui e valutare la resistenza ai farmaci trasmesso e descritta. Il metodo utilizza il software libero e open source per l&#39;interpretazione dei modelli di resistenza ai farmaci e la generazione di report dei singoli pazienti. Il protocollo genotipizzazione ha un indice di amplificazione superiore al 95% per i campioni di plasma con avcarico Iral&gt; 1,000 HIV-1 RNA copie / ml. La sensibilità diminuisce in modo significativo per carica virale &lt;1.000 copie di HIV-1 RNA / ml. Il metodo qui descritto è stato validato nei confronti di un metodo di HIV-1 resistenza Drug Testing approvata dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (FDA), il metodo di genotipizzazione Viroseq. Limiti del metodo qui descritto comprendono il fatto che non è automatizzato e che essa non anche per amplificare la forma circolante CRF02_AG ricombinante da un gruppo di validazione di campioni, anche se amplificato sottotipi A e B dello stesso pannello.

Il metodo convalidato era una modifica di un metodo riportato in precedenza 20. Il metodo di genotipizzazione Viroseq, che è stato approvato dalla FDA, è stato utilizzato come metodo di riferimento per la convalida. Un gruppo di campioni di prova di abilità ottenuti dalle Agenzie nazionali francesi per la ricerca sull&#39;AIDS e l&#39;epatite virale (ANRS) è stato utilizzato nel confronto principale tra i due metodi. I due metodi di genotipizzazione sono state del 100% concorde nell&#39;individuare tutti clinicamente importanti mutazioni associate alla resistenza droga come interpretato dal programma HIVDB per i campioni che sono stati amplificati con successo con entrambi i metodi. Come mostrato in Tabella 6, le sequenze nucleotidiche dei tre coppie erano 99,5% identico. Le sequenze amminoacidiche predette erano identici al 100%. Un campione su cinque non poteva essere amplificato con successo da Viroseq. In aggiunta al campione non amplificato dal Viroseq, il metodo in-house omesso di amplificare un secondo campione che è stato mostratoessere un virus ricombinante circolante (CRF02_AG) da Viroseq. I tre campioni amplificati con entrambe le metodologie erano sottotipo B (due campioni) e sottotipo A (un campione). <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;uso di un vicino di giunzione albero HKY fatto come parte della garanzia della qualità sequenza. Ci sono quattro coppie / gruppi di sequenza con distanze molto brevi genetiche. La distanza genetica tra RES655 e RES655_1 (stessi campioni sequenziati in giorni diversi) è 0.003. Il è un potenziale errore con la coppia RES637_1/RES638 come la loro distanza genetica è troppo breve (0.075) per i campioni provenienti da diversi individui epidemiologico scollegate. C&#39;è un altro RES637 sull&#39;albero con una distanza di 0,075 rispetto al RES638_1. Il cluster CQ01/CQ02 suggerisce che i due campionidal pannello sono duplicati dello stesso campione. Essi raggruppano insieme alla sequenza di riferimento sottotipo B confermando il sottotipo assegnato dallo strumento REGA Subtyping. CQ05 e CQ04 raggruppati con sottotipi A e G, rispettivamente, considerando che lo strumento REGA subtyping li ha classificati come A e CRF02_AG rispettivamente. Un altro strumento utile per subtyping HIV e ricombinazione è SCUEL, che è disponibile a http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> Un gruppo di cinque campioni è stato utilizzato per valutare la precisione del metodo in house. Dieci genotipi replicati sono stati generati per ciascuno dei cinque campioni. Utilizzando l&#39;analizzatore genetico 16 Capillare 3130xl, 48 dei 50 genotipi sono stati generati da 24 piste, preparate lo stesso giorno. Per tutti i cinque campioni, le sequenze amminoacidiche predette erano 100% concorde tra replicati. Per le sequenze di acido nucleico, there era&gt; 99% di somiglianza a coppie. Durante i primi due anni di utilizzo di questo metodo, sessanta campioni sono stati ripetuti in modo casuale da estrazione di RNA a sequenziamento. Non ci sono state differenze statisticamente significative tra il punteggio di qualità sequenza e il numero di basi misti tra le repliche. Sia il nucleotidiche e amminoacidiche confronti a coppie per i sessanta coppie erano superiore al 99% identico. Così le mutazioni di farmacoresistenza per tutte le coppie erano 100% concorde. Riduzione dei costi I volumi di reazione di RT, PCR e sequenziamento sono stati ridotti di almeno la metà, rispetto al metodo originale 20, 32, senza compromettere la qualità delle sequenze generate. Ciò ha consentito una riduzione dei costi del 50% per le fasi RT e PCR. Il nuovo metodo è stato originariamente progettato per funzionare con sei sequenziamento primer sequenza<html> tutti i 99 codoni del gene della proteasi e le prime 300 codoni della trascrittasi inversa gene 20, 32. Metodi simili usano anche sei a otto iniettori 33, 34. Alcuni metodi recentemente pubblicati hanno utilizzato meno di sei primer, anche se a volte il sequenziamento dei geni della proteasi e RT seprately 35, 36. Si è cercato di ridurre il numero di primer di sequenziamento da sei a quattro, (figura 6) <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figura 6. Confronto di sequenze contigue sei confrontarli quattro primer di sequenziamento per la generazione della sequenza pol 1197 bp che copre tutti i 99 HIV-1 proteasi codoni e le prime 300 codoni del gene trascrittasi inversa.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. Sequenze di una serie di 17 campioni generati da sei inneschi sono stati confrontati con sequenze generate dopo l&#39;esclusione di due primer (MAW46 e RTY). I sottotipi erano 14 sottotipo C, due sottotipo B, e un sottotipo A. Non ci sono state differenze significative nei punteggi di qualità sequenza. Ancora una volta, l&#39;identità pairwise media tra le 17 coppie di acido nucleico è stata del 99% e il 100% sul livello amminoacidico. Così, riducendo i primer di sequenziamento da sei a quattro determinato una riduzione del costo sequenziamento di quasi un terzo. L&#39;unico strumento software proprietario utilizzato in questo protocollo è stato Geneious per l&#39;assemblaggio sequenza. Gli strumenti di interpretazione farmaco-resistenza, nonché la relazione di generare strumenti sono tutti gratuiti, strumenti di accesso aperto. Questo riduce il costo ulteriore eliminando i costi associati con l&#39;uso di software proprietario. Inoltre, collective negoziazione ha consentito i reagenti per questo protocollo da confezionare in un kit per un facile accesso da Life Technologies ed è disponibile come Saturn / Life Technologies metodo 37 genotipizzazione. Inoltre, i membri Saturno può accedere ai reagenti ad un prezzo scontato. Ambito Clinico Il protocollo descritto è stato implementato il monitoraggio e la sorveglianza della resistenza ai farmaci in una comunità rurale in KwaZulu-Natal. Un totale di 604 genotipi sono stati generati da campioni clinici tra dicembre 2010 e maggio 2013 con un tasso di amplificazione del 95% per i campioni con carica virale&gt; 1.000 RNA copie / ml. Questo studio clinico di HIV farmaco-resistenza è stato approvato dal Comitato Etico di Ricerca Biomedica dell&#39;Università di KwaZulu-Natal (rif. BF052/10) e il Comitato Health Research del Dipartimento di KwaZulu-Natal della Salute (rif. HRKM 176/10). Relazioni dei singoli pazienti sono stati generati e rispediti alle clinicheper la gestione del paziente. Settantadue (72) genotipi sono stati generati come parte di una sorveglianza della resistenza ai farmaci trasmessa studio, annidati all&#39;interno di un ampio studio prospettico di sorveglianza HIV basato sulla popolazione. I campioni primari erano l&#39;ago puntura sangue intero raccolto in microtubi EDTA. Al genotipizzazione c&#39;era un tasso di amplificazione di 79% 19. Approvazione etica per la genotipizzazione di campioni dallo studio di sorveglianza è stato ottenuto presso l&#39;Università di KwaZulu-Natal Ricerca Biomedica Comitato Etico (rif. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome Primer </td><td> Sequenza </td><td> Lunghezza </td><td> Direzione </td><td> Posizione HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Avanti </td><td> 2028-2050 </td><td> 1 ° Turno PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverse </td><td> 3539-3509 </td><td> 1 ° Turno PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Avanti </td><td> 2147-2166 </td><td> Turno PCR seconda </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 3462-3441 </td><td> Turno PCR seconda </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Avanti </td><td> 2486-2508 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Avanti </td><td> 2956-2994 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Sequencing </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Avanti </td><td> 2251-2277 </td><td> Sequencing </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Trascrizione, PCR e sequenziamento primer personalizzati utilizzati nella generazione di un frammento di 1197 bp pol copre tutti i 99 HIV-1 proteasi codoni e le prime 300 codoni del gene trascriptase inversa inverse. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. dNTP / Primer miscela per la reazione di trascrizione inversa. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reazione </td><td> Concentrazione / reazione </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mm) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Apice III trascrittasi inversa (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Enzima miscela per la reazione di trascrizione inversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reazione </td><td> Concentrazione Finale / Reazione </td></tr><tr><td> DEPC acqua trattata </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR Buffer (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MGCI 2 (50 mm) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> miscela dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Primer Froward (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Primer reverse (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq Polymerase (5 U / ml) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> Totale parziale </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Master mix per la nested PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reazione </td><td> Concentrazione / reazione </td></tr><tr><td> DEPC acqua trattata </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequencing Buffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3.2 pmol / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> Big Dye terminator mix Sequencing </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 5. Master mix per le reazioni di sequenziamento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA somiglianza </td></tr><tr><td> ID campione </td><td> Sottotipo </td><td> Punteggio di qualità </td><td> PR Mutazioni </td><td> Mutazioni RT </td><td> Sottotipo </td><td> Punteggio di qualità </td><td> Mutazioni PR </td><td> RT Mutazioni </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> La </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> La </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabella 6. Resul comparativats da una analisi parallela tra il metodo di genotipizzazione Viroseq e il metodo internamente con un pannello di campioni forniti dal ANRS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Test di resistenza ai farmaci per l&#39;HIV-1 individui infetti in mancanza di terapia antiretrovirale (ART) in grado di guidare le terapie future e migliorare i risultati del trattamento. Ottimizzazione dei singoli e della popolazione esiti di salute in alta prevalenza di HIV, ma a risorse limitate in ultima analisi richiederà conveniente e accessibile genotipizzazione resistenza ai farmaci e metodi di interpretazione.

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