Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
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著者らは、この作業を可能にしたすべての同僚、特にマヤBalamane、エリザベス·ジョンストンホワイト、シャロンSjoblom、グレッグディングZakh​​ona Gumede、Xolile Kineri、Phindile Mabaso、Lungisa Ndwandwe、ジェームズ·ガーベイ、ギャビンコブ、Senzo Maphanga、Terusha Chettyを承認したいと思います、Keviナイドウ、アンドリューSkingsley、キャサリン·ストット、およびLungani Ndwandwe。著者はまたHlabisa、HIV治療とケアプログラムを働く保健省とアフリカセンター職員のすべての職員に感謝したいと思います。

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<div>保健システムの強化とHIV治療失敗（HIV-：この作品は、ウェルカムトラスト（082384/Z/07/Z）、欧州連合（サンテ2007 147から790）によってサポートされていました、病気のための米国センターはCAPRISA（プロジェクトタイトルを経由して制御しますTFC））、およびスイス南アフリカ共同研究プログラム（SSJRP）と題する研究助成金「スイスのProt /南アフリカ：タンパク質バイオインフォマティクス人材育成は重要な健康関連の病原体」。RLがウェルカムトラストによってサポートされている（認可番号090999 / Z / 09 / Z）。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割も持っていなかった。著者らは、競合の金融利益を宣言していません。 </div>

いくつかの低コストのインハウスの方法は、33、34、36 HIV薬剤耐性遺伝子型決定は、より手頃な価格で提供しようとする努力に記載されている。資源が限られた設定で、抗レトロウイルス療法を受けている人々のためのケアの連続に薬剤耐性検査を統合する必要性に疑問の余地はない。しかし、報告された方法のほとんどは、集団レベルでの薬剤耐性のサーベイランスにおける薬剤耐性遺伝子型決定の適用に焦点を当てる。土星/ライフテクノロジーズの遺伝子型判定法は、薬剤耐性のサーベイランス及びモニタリングのための完全に統合されたプロトコルです。この方法は、臨床管理のための報告書の薬剤耐性と世代の解釈の大部分はオープンソースとオープンアクセスのバイオインフォマティクスのリソースを実装する手頃なプロトコルとして設計されました。 これは、ようにするViroseq遺伝子型判定法を承認したFDAとの比較により示された正常に増幅された実験室用パネルサンプルの100％において、ANRS技能試験試料のパネルからの薬剤耐性変異の同定に正確。精度もサブタイプCウイルス、南部アフリカで最も優勢なサブタイプの臨床サンプルを評価した。それは本方法はCRF02_AGが流行している世界の他の部分で使用される場合は、方法日時プライマーの改変が必要であるサブタイプAおよびBにあったような方法は、サブタイプCサンプル上で正確であったCRF02_AGを有することが示されたパネル試料の一つを増幅するのに失敗しました。あるいは、すべての基Mに感受性のプライマーの縮重セットは、サブタイプの分布が38より不均一である場合は、領域36で使用することができる、33ウイルス。 逆転写およびPCRの感度は、例えば、500ミリリットル、プラズマの高いボリュームからRNAを抽出することにより増加させることができる。プラズマはcentrifすることができますをQIAampウイルスRNA抽出ミニキットに記載されているように、プロトコルを実行する前に、ウイルス粒子を濃縮するために90分間21000×gでuged。 図示のように、新しい方法は、個々の患者管理のための包括的なレポートを生成する追加の利点を有する。これらのレポートは、RegaDBから遺伝子型の統合、免疫学的およびウイルス学的監視データだけでなく、臨床および治療の歴史である。これは、同じように、詳細な患者の病歴の見直しだけでなく、治療勧告が続く抵抗プロファイルの詳細な実験室での解釈を伴う。レポートを確認し、患者のための治療勧告を提供するために、専門の医師の使用はますますタスクシフティングのためのWHOの勧告の一部として南アフリカでARTを提供している看護実践だけでなく、経験の浅い臨床医のための待望の指導を提供します。これらの臨床レポートには、薬剤耐性管理のほとんど、またはまったく経験の臨床医のための効果的な教材であることが示されている。患者の視点から、私たちの方法は、専門家のHIVサービスにアクセスするために、集中サイトに移動する必要がなくなります。 このように、全体として説明されたプロトコルは、HIVの薬剤耐性管理がARTを失敗、HIV感染者のケアの連続に、低コストで、統合することができるような優れたプラットフォームを提供します。生成されたデータは、コミュニティ内の薬剤耐性の発生および送信を評価するために、疫学的目的に使用することができる。生成されたPOL断片の大きさは、集団レベルでの流行のよりよい理解を生成し、より複雑な系統解析には十分である。

南部アフリカにおけるHIVの流行は、特に南アフリカ2、3に、抗レトロウイルス療法（ART）を個人の付随指数関数的な増加と共に急速に1を進化されています。発症4を削減し、資源の限られた設定で、平均寿命（RLS）を5増加させるのに大規模な治療プログラムの疫学的影響に関するエビデンスとして蓄積し続け、ARTのカバレッジを向上させる努力が強化されます。テスト対象の予防ツール6、7のような処理の使用に向けたガイドラインの進化とプログラムを扱うには、治療上の個人の絶対数がさらに増加することを意味します。 ARTを個人の平均寿命は、HIV感染していない人口8のそれに近づくように多数の個体は、より長期間の技術になります。 HIVの薬剤耐性の発生および伝達がALWAを有するYS ART 9月12日の業績への脅威と考えられて。したがって、より多くの個人がARTに開始される、より厳格な監視と薬剤耐性の監視が必要とされている。 遺伝子型薬剤耐性（GRT）試験は、監視のためだけでなく、ARTを受ける個体におけるHIV-1薬剤耐性の両方の監視、先進国で成功裏に使用されている。これらの設定では、GRTは、HIV-1感染者のケアの連続体に統合されました。ほとんどの国際ガイドラインはレジメン小児患者は、母子感染（PMTCT）の防止にさらされ、大人やアート（第一ラインと第2ラインの）13〜15を失敗小児患者のためにGRTをお勧めしますが、その後16を感染させ、との設定で急性感染した個体間で送信される13-15薬剤耐性の高レベル。しかし、コスト、技術、およびインフラストラクチャの要件は、インプリメンが限られているRLSにおける薬剤耐性のモニタリングと同様のアプローチテーション。 南アフリカHIV治療とモニタリングのガイドラインは、現在のファーストラインは17をレジメン失敗個人のARTの選択を導くのにGRTを使用することをお勧めしません。個人は、主にウイルス学（HIV-1 RNAウイルス量）のパラメータに基づいて切り替えられる。しかし2012年に、南部アフリカのHIV臨床医協会は、第一南部アフリカARV薬剤耐性検査の指針18を発表した。これらのガイドラインは、第一ラインと第2ラインのアートを失敗し、すべての大人のためとPMTCT 18にさらされ、感染した幼児や子供のためにGRT検査をお勧めします。アフリカ南部19-29の透過薬剤耐性の高いレベルには現在の証拠がないので、GRTは、急性感染者のための18をお勧めしません。それは、これらの勧告のいくつかは、国家TREに時間をかけて統合されることが期待される地域の様々な国のガイドラインをatmentおよび監視。すでに、2013年南アフリカの治療ガイドラインに大人のためのセカンドラインに障害が発生した時には、子どもたち30の第一選択または第二選択のPIベースのレジメンの失敗時のGRTの勧告は今そこにある。 それは南アフリカの治療ガイドラインにGRTを組み込むことは、潜在的にコスト中立的になることが示されている。真の二次治療に切り替えられる必要がある患者を同定するGRTを用いて、比較的より高価な第一選択薬よりもセカンドラインレジメン薬のコストを考慮すると、プログラムに追加のコストを生じない。また、GRTも、失敗の他の理由を特定し、治療の選択肢を節約し、新たな耐性パターン31についての情報を生成することができます。したがって、さらに、アクセス、ANケアの質を向上させるために、薬剤耐性の監視方法のコストを低減することが必要であるDの成果。 ここでは、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および配列決定した（ 表1）、ならびに薬剤耐性の解釈のために主にオープンソースソフトウェアのための一般的な（オープンソースの）プライマーを使用するように設計GRT法を提案する。臨床管理のために、プロトコルは、国の治療ガイドラインに密着した研究室で薬剤耐性のレポートの専門家の解釈を包括的レビューおよび報告の方法によって補完されている。プロトコルは、4つの異なる成分に分割され、1）HIVリボ核酸（RNA）の抽出、2）逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ウイルス標的の増幅、3）配列決定クロマトグラム、アラインメントの分析のため4）バイオインフォマティクス法キュレーションとシーケンスデータの解釈。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1薬剤耐性は真剣に抗レトロウイルス療法（ART）の有効性および耐衝撃性を損なう可能性を秘めている。サハラ以南のアフリカのアートプログラムは拡大を続けているため、ARTを個人が密接に薬剤耐性の出現を監視する必要があります。 ARTにすでに耐性ウイルス株の伝播を追跡するため送信された薬剤耐性の監視も重要である。ジェノタイピングは高価であり、洗練された実験室およびデータ管理インフラストラクチャを必要とするため、残念ながら、薬剤耐性検査は、まだ限られたリソースの設定中に容易にアクセスすることはできません。個人を管理し、送信された薬剤耐性を評価するためのオープンアクセスの遺伝子型薬剤耐性監視方法について説明する。この方法は、薬剤耐性パターンの解釈と個々の患者のレポートの生成のための無料のオープンソースソフトウェアを使用しています。遺伝子型決定プロトコルはavを有する血漿サンプルについて、95％以上の増幅率を有しているIRALロード&gt;千のHIV-1 RNAコピー/ mlである。感度は、ウイルス負荷&lt;千HIV-1 RNAコピー/ mlのために著しく低下する。ここで説明する方法は、米国食品医薬品局（FDA）、Viroseqジェノタイピング法によって承認されたテスト結果にHIV-1薬剤耐性の方法と比較して検証した。ここで説明する方法の限界は、それが自動化され、それは同じパネルからサブタイプAおよびBを増幅したものの、それはまた、サンプルの検証パネルからの循環組換え型のCRF02_AGを増幅するのに失敗したことがないという事実が挙げられる。

検証方法は、以前に報告された方法20の修正だった。 FDAによって承認されているViroseq遺伝子型決定法は、検証中の参照方法として使用した。エイズの研究とウイルス性肝炎（ANRS）フランス国立機関から取得した技能試験サンプルのパネルは2つの方法の間、一次比較に使用した。 2遺伝子型決定法は正常に両方の方法により増幅したサンプルについて、HIVDBプログラムによって解釈されるすべての臨床的に重要な薬剤耐性関連変異を同定することに100パーセント一致した。 表6に示すように、三対のヌクレオチド配列は99.5％同一であった。予測されるアミノ酸配列は100％同一であった。 5のうち一つのサンプルは正常にViroseqにより増幅することができませんでした。 Viroseqによって増幅されていない試料に加えて、社内の方法が示された第二の試料を増幅するのに失敗したViroseqによって循環組換えウイルス（CRF02_AG）されるように。両方の方法論を用いて増幅3のサンプルは、サブタイプB（2サンプル）およびサブタイプA（1サンプル）となりました。 <img alt="図5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> 図5。シーケンスの品質保証の一環として行わHKY近隣参加ツリーの使用。非常に短い遺伝的距離との配列の4組/クラスターがあります。 RES655とRES655_1（別の日に、配列決定同じサンプル）間の遺伝距離は0.003である。それらの遺伝的距離が異なる疫学的にリンクされていない個人からのサンプルのために（0.075）が短すぎるようRES637_1/RES638ペアとの潜在的なエラーです。 RES638_1に比べて0.075の距離がツリー上の別のRES637があります。 CQ01/CQ02クラスタは、二つのサンプルを示唆しているパネルでも同様のサンプルの重複があります。彼らはREGAサブタイピングツールによって割り当てられ、サブタイプを確認するサブタイプB参照配列と一緒にクラスタ化する。 REGAのサブタイピングツールは、それぞれAとCRF02_AGとしてそれらを分類し、一方、CQ05とCQ04は、それぞれのサブタイプAおよびGとクラスター。のHIVサブタイプとの再結合のための別の有用なツールがhttp://www.datamonkey.orgで入手可能ですSCUELです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> 5つのサンプルのパネルは、社内方法の精度を評価した。十複写遺伝子型が5つの試料のそれぞれについて生成された。 16キャピラリジェネティックアナライザーを用いて、50の遺伝子型の48は同じ日に調製した24ラン、から生成した。すべての5つのサンプルについて、予測されたアミノ酸配列が反復の間で100％一致した。核酸配列は、目のためのERE&gt; 99％対ごとの類似性があった。 このメソッドの使用の最初の2年間に、60サンプルが配列決定にRNA抽出からランダムに繰り返した。シーケンス品質スコアと複製物との間に混合塩基の数の間には統計的に有意な差は認められなかった。 60組のヌクレオチドおよびアミノ酸対比較の両方が99％以上同一であった。したがって、すべての対に対する薬剤耐性変異は100％一致した。 コスト削減 RT、PCRおよび配列決定のための反応量は、生成シーケンスの品質に妥協することなく、独自の方法20、32と比較して、少なくとも半分に短縮されました。これは、RTおよびPCR段階用の50％のコスト削減を可能にした。 新方式は、元々の配列に6配列決定プライマーで動作するように設計されました<html>プロテアーゼ遺伝子および逆転写酵素遺伝子20、32の最初の300コドンの全てのコドン99。同様の方法はまた、六から八プライマー33、34を使用しています。時にはseprately 35、36、プロテアーゼおよびRT遺伝子の配列を決定するが、いくつかの最近発表された方法には、6個未満のプライマーを使用している。我々は、（ 図6）、六から四配列決定プライマーの数を減らすことが求められて<img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> 図6。全99 HIV-1プロテアーゼコドンおよび逆転写酵素遺伝子の最初の300コドンをカバーする1197 bpのpol配列の生成のための6つの4対配列決定プライマー由来の連続配列の比較。242/51242fig6highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 17サンプルのセットからの配列は、2つのプライマー（MAW46とRTY）を除外した後に生成された配列と比較した6のプライマーから生成された。サブタイプは、シーケンスの品質スコアに有意差はなかった14のサブタイプCつのサブタイプB、一つのサブタイプA.あった。再度、核酸の17対の間の平均ペアワイズ同一性は、アミノ酸レベルで99％および100％であった。したがって、六から四配列決定プライマーを低減ほぼ3分のシーケンシングコストの低減をもたらした。 このプロトコルで使用される唯一の独自のソフトウェアツールは配列アセンブリのGeneiousであった。薬剤耐性解釈ツールならびにレポート生成ツールは、すべて無料で、オープンアクセスツールです。これは、独自のソフトウェアの使用に伴うコストをなくすことによって、コストをさらに低減する。さらに、collectivEネゴシエーションは、このプロトコルのための試薬 ​​はライフテクノロジーズから簡単にアクセスするためのキットにパッケージ化と土星/ライフテクノロジーズは、メソッド37の遺伝子型を特定として提供されてすることができた。また、土星のメンバーは割引価格での試薬にアクセスすることができます。 臨床背景 記載されているプロトコルは、クワズールナタールの農村コミュニティの監視や薬剤耐性のサーベイランスに実装されています。 604遺伝子型の合計&gt;千RNAコピー/ mlのウイルス量の試料の95％の増幅率で2010年12月と2013年5月の間、臨床サンプルから生成した。この臨床HIVの薬剤耐性の研究はクワズールナタール大学（参考のBF052/10）の生物医学研究倫理委員会と健康のクワズールナタール局（参照HRKM 10分の176）の健康の研究委員会によって承認された。個々の患者のレポートが生成され、診療所に送り返されました患者管理のため。 72個（72）の遺伝子型はまた、送信された薬剤耐性の研究の調査の一部として生成大規模な前向き集団ベースのHIVサーベイランス調査内にネストされた。主なサンプルは、EDTAマイクロチューブに集め、針を刺す全血だった。ジェノタイピングで79％で19の増幅率があった。調査研究からのサンプルの遺伝子型判定のための倫理承認はクワズールナタール生物医学研究倫理委員会（参考文献BE066107）の大学から入手した。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>プライマー名</td><td>シーケンス</td><td>長さ</td><td>方向</td><td> HXB2ポジション</td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td>フォワード</td><td> 2028-2050 </td><td>第一回目のPCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td>リバース</td><td> 3539-3509 </td><td>第一回目のPCR </td></tr><tr><td>プロ1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> 20 </td><td>フォワード</td><td> 2147-2166 </td><td>第二ラウンドのPCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td>リバース</td><td> 3462-3441 </td><td>第二ラウンドのPCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td>フォワード</td><td> 2486-2508 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td>リバース</td><td> 2630-2604 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td>フォワード</td><td> 2956-2994 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td>リバース</td><td> 3129-3101 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> RT-Y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td>リバース</td><td> 2967-2946 </td><td>シークエンシング</td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td>フォワード</td><td> 2251-2277 </td><td>シークエンシング</td></tr></tbody></table> 表1。 、、PCRを逆転写し、すべての99のHIV-1プロテアーゼコドンと逆trascriptase遺伝子の最初の300コドンをカバーする1197 bpのPOLフラグメントの生成に使用されるカスタムプライマーの配列を決定する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21（5pmol/ml） </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td>のdNTP（10 mM）を</td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> 表2。のdNTP /プライマーは、逆転写反応混合する。 <table border= &quot;0&quot; CELLPADDING = &quot;0&quot; CellSpacingの &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td>試薬</td><td>体積（ml）/反応</td><td>濃度/反応</td></tr><tr><td>第一鎖バッファー（10×） </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム（25ミリモル） </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT（0.1M） </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNアーゼOUT（40単位/ ml） </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td>上付きIII逆転写酵素（200U/ml） </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。酵素は、逆転写反応混合する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>試薬</td><td>体積（ml）/反応</td><td>最終濃度/反応</td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> PCRバッファー（10×） </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（50 mM）を</td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPミックス（10 mM）を</td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td>偏屈なプライマー（5ピコモル/ ml）を</td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td>リバースプライマー（5ピコモル/ ml）を</td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td>プラチナTaqポリメラーゼ（5単位/ ml） </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td>小計</td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 表4。ネステッドPCR用マスターミックス。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>試薬</td><td>体積（ml）/反応</td><td>濃度/反応</td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td>シークエンシングバッファー（5X） </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>プライマー（3.2ピコモル/ ml）を</td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td>ビッグダイターミネーターシーケンミックス</td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td>合計</td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> 表5。シークエンシング反応用マスターミックス。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4">社内</td><td rowspan="2"> ％のNa類似性</td></tr><tr><td>検体ID </td><td>サブタイプ</td><td>品質スコア</td><td> PR変異</td><td> RT変異</td><td>サブタイプ</td><td>品質スコア</td><td>広報の変異</td><td> RT変異</td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L、I54L、V82A、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L、I54L、V82、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L、I54L、V82A、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L、I54L、V82A、L90M </td><td> D67N、T69D、K70R、M184V、T215V、K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V、V82F、I84V </td><td> M41L、L74I、L210W、T215Y、V108I、Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> 表6。比較resulViroseqのジェノタイピング法とANRSによって提供されたサンプルのパネルを使用して、社内の方法との間に並列解析からのTS。

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

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