Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke alle kolleger som har gjort dette arbeidet mulig, spesielt Maya Balamane, Elizabeth Johnston hvit, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, og Lungani Ndwandwe. Forfatterne vil også takke alle de ansatte i avdeling for helse og Afrika Senter personell som jobber Hlabisa HIV behandling og pleie Programme.

<ol>
	<li>Shao, Y., Williamson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+epidemic:+low-+to+middle-income+countries.">The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries.</a> Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).</li><li>Mutevedzi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+a+decentralized+HIV+treatment+programme+in+rural+KwaZulu-Natal,+South+Africa:+does+rapid+expansion+affect+patient+outcomes.">Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes.</a> Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).</li><li>Houlihan, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohort+profile:+Hlabisa+HIV+treatment+and+care+programme.">Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).</li><li>Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+coverage+of+ART+associated+with+decline+in+risk+of+HIV+acquisition+in+rural+KwaZulu-Natal.">High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal.</a> South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).</li><li>Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increases+in+adult+life+expectancy+in+rural+South+Africa:+valuing+the+scale-up+of+HIV+treatment.">Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment.</a> Science. 339, 961-965 (2013).</li><li>Montaner, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+expanding+access+to+highly+active+antiretroviral+therapy+to+curb+the+growth+of+the+HIV+epidemic.">The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic.</a> Lancet. 368, 531-536 (2006).</li><li>Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+voluntary+HIV+testing+with+immediate+antiretroviral+therapy+as+a+strategy+for+elimination+of+HIV+transmission:+a+mathematical+model.">Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model.</a> Lancet. 373, 48-57 (2009).</li><li>Johnson, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+expectancies+of+South+african+adults+starting+antiretroviral+treatment:+collaborative+analysis+of+cohort+studies.">Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies.</a> PLoS Med. 10, (2013).</li><li>Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+impact+of+antiretrovirals+in+resource-poor+settings:+preventing+HIV+infections+whilst+controlling+drug+resistance.">Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).</li><li>Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+antiretroviral+drug+resistance+in+drug-naive+persons.">Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).</li><li>Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+with+reduced+sensitivity+to+zidovudine+(AZT)+isolated+during+prolonged+therapy.">HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy.</a> Science. 243, 1731-1734 (1989).</li><li>Erice, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+primary+infection+with+zidovudine-resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1.</a> N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).</li><li>Williams, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=British+HIV+Association+guidelines+for+the+treatment+of+HIV-1-positive+adults+with+antiretroviral+therapy.">British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy.</a> HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).</li><li>Vandamme, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+recommendations+for+the+clinical+use+of+HIV+drug+resistance+testing:+2011+update.">European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update.</a> AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Department+of+Health.">Department of Health.</a> Clinical guidelines for the management of HIV &amp; AIDS in adults and adolescents. , (2010).</li><li>Conradie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2012+southern+African+ARV+drug+resistance+testing+guidelines.">The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines.</a> S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).</li><li>Manasa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Drug+Resistance+in+South+Africa:+Data+from+10+Years+of+Surveys.">Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).</li><li>Tshabalala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+transmitted+antiretroviral+drug+resistance+among+HIV-1+infected+women+attending+antenatal+clinics+in+Chitungwiza,+Zimbabwe.">Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug+resistance+surveillance+among+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+individuals+in+Angola:+evidence+for+low+level+of+transmitted+drug+resistance.">Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+genetic+diversity+and+transmitted+drug+resistance+in+health+care+settings+in+Maputo,+Mozambique.">HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+drug+resistance+in+antiretroviral-naive+individuals+in+sub-Saharan+Africa+after+rollout+of+antiretroviral+therapy:+a+multicentre+observational+study.">HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study.</a> Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Drug+Resistance+Mutations+Are+Present+in+Six+Percent+of+Persons+Initiating+Antiretroviral+Therapy+in+Lusaka,+Zambia.">HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).</li><li>Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+transmitted+genetic+drug+resistance+in+a+cohort+of+HIV+infected+naive+patients+entering+antiretroviral+treatment+programs+at+two+sites+in+northern+South+Africa.">Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa.</a> J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).</li><li>Iweriebor, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+HIV+in+two+highly+endemic+areas+of+northeastern+South+Africa.">Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa.</a> Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).</li><li>Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiretroviral+drugs+in+newly+diagnosed,+young+treatment-naive+HIV-positive+pregnant+women+in+the+province+of+KwaZulu-Natal+South+Africa.">Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa.</a> J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).</li><li>Nwobegahay, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+antiretroviral+drug+resistance+mutations+and+HIV-I+subtypes+among+newly-diagnosed+drug-naive+persons+visiting+a+voluntary+testing+and+counselling+centre+in+northeastern+South+Africa.">Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa.</a> J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).</li><li>Nwobegahay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+drug-resistant+mutations+in+newly+diagnosed+drug-naive+HIV-1-infected+individuals+in+a+treatment+site+in+the+waterberg+district,+limpopo+province).">Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province).</a> S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).</li><li>Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+net+cost+of+incorporating+resistance+testing+into+HIV/AIDS+treatment+in+South+Africa:+a+Markov+model+with+primary+data.">The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data.</a> J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).</li><li>Dalai, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+molecular+epidemiology+of+subtype+C+HIV-1+in+Zimbabwe.">Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe.</a> AIDS. 23, 2523-2532 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+human+immunodeficiency+virus-1+genotype+resistance+testing+to+determine+highly+active+antiretroviral+therapy+resistance+mutations+in+Hong+Kong.">In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong.</a> Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).</li><li>Lee, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-house+HIV+genotyping+assay+for+the+detection+of+drug+resistance+mutations+in+Southeast+Asian+patients+infected+with+HIV-1.">An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1.</a> J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).</li><li>Aitken, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pragmatic+Approach+to+HIV-1+Drug+Resistance+Determination+in+Resource-Limited+Settings+by+Use+of+a+Novel+Genotyping+Assay+Targeting+the+Reverse+Transcriptase-Encoding+Region+Only.">A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only.</a> J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+low+cost+and+broadly+sensitive+genotyping+assay+for+HIV-1+drug+resistance+surveillance+and+monitoring+in+resource-limited+settings.">Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Technologies.">Life Technologies.</a> Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , (2012).</li><li>Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+HIV-1+diversity+in+Africa:+a+decade+in+review.">Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review.</a> AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).</li></ol>

<div> Dette arbeidet ble støttet av Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), EU (SANTE 2007 147-790), det amerikanske senteret for smittevern via CAPRISA (prosjekttittel: Health Systems Styrking og HIV behandlingssvikt (HIV- TFC)), og den sveitsiske sørafrikanske Joint Research Programme (SSJRP) forskningsstipend tittelen &quot;Swiss Prot / Sør-Afrika: Protein Bioinformatikk Resource Development for viktige helserelatert Patogener&quot;. RL er støttet av Wellcome Trust (stipend nummer 090999 / Z / 09 / Z). finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser. </div>

Flere lavpris in-house metoder har blitt beskrevet i arbeidet med å prøve å få HIV legemiddelresistens genotyping rimeligere 33, 34, 36. Det er ingen tvil om behovet for å integrere legemiddelresistens testing i kontinuum av omsorg for enkeltpersoner på antiretroviral behandling i ressurs-begrensede innstillinger. Men de fleste av de rapporterte metoder fokuserer på anvendelse av legemiddelresistens genotyping i overvåking av resistens på et samfunnsnivå. Saturn / Livet Technologies genotyping metoden er en fullt integrert protokoll for overvåking og oppfølging av legemiddelresistens. Denne metoden ble utviklet for å være en rimelig protokoll implementere meste åpen kildekode og åpne ressurser tilgang bioinformatikk for tolkningen av legemiddelresistens og generering av rapporter for klinisk ledelse. Det ble vist gjennom sammenligning med FDA godkjente Viroseq genotyping metode for å værenøyaktig i å identifisere legemiddelresistens mutasjoner fra et panel av ANRS kvalitetstestprøver, i 100% av laboratoriepanelprøver som ble vellykket forsterket. Nøyaktigheten ble også vurdert på kliniske prøver av subtype C virus, den mest dominerende subtype i det sørlige Afrika. Fremgangsmåten var nøyaktig som på undertype C-prøvene som det var på undertype A og B. Imidlertid, hvis fremgangsmåten skal anvendes i andre deler av verden hvor CRF02_AG er utbredt, er det behov for modifisering av de primere ettersom metoden unnlatt å forsterke en av panelprøver som ble vist å ha CRF02_AG. Alternativt kan en degenerert sett av primere som er følsomme for alle gruppe M virus 33, 36 kan anvendes i områder hvor subtype fordelingen er mer heterogen 38.. Følsomheten av revers transkripsjon og PCR kan økes ved å ekstrahere RNA fra høyere volumer av plasma, for eksempel 500 ml. Plasmaet kan sentrifugeuged på 21 000 xg i 90 min å konsentrere viruspartikler før du fortsetter med protokollen som beskrevet av QIAamp viral RNA ekstraksjon mini kit. Som vist, har den nye metoden en ekstra fordel at den produserer omfattende rapporter for individuell pasientbehandling. Disse rapportene er en konsolidering av genotype, immunologiske og virologisk overvåkingsdata samt klinisk og behandlingshistorikk fra RegaDB. Dette er ledsaget av en detaljert laboratorie tolkning av motstandsprofil, etterfulgt av et like detaljert gjennomgang av pasientens kliniske historie samt behandling anbefalinger. Bruken av en spesialist med å gjennomgå rapportene og gi behandling anbefalinger for pasientene gir sårt tiltrengte mentorer for sykepleier utøvere samt uerfarne klinikere, som i økende grad gir ART i Sør-Afrika som en del av WHOs anbefalinger for oppgaven giring. Disse kliniskerapporter har vist seg å være effektive læremidler for klinikere med liten eller ingen erfaring i legemiddelresistens ledelse. Fra et pasientperspektiv, reduserer vår metode behovet for å reise til sentraliserte områder for å få tilgang til spesialist HIV-tjenester. Dermed blir beskrevet protokoll som helhet gir en god plattform der HIV legemiddelresistens ledelse kan bli integrert, til en rimelig pris, i den behandling for HIV-infiserte individer sviktende ART. Dataene som genereres kan brukes for epidemiologiske formål å bedømme utviklingen og overføring av legemiddelresistens i samfunnet. Størrelsen på pol fragment generert er god nok for mer komplekse fylogenetisk analyse som vil gi bedre forståelse av epidemien på populasjonsnivå.

HIV-epidemien i det sørlige Afrika har utviklet seg raskt en med en samtidig eksponentiell økning i personer på antiretroviral terapi (ART), spesielt i Sør-Afrika to, tre. Som bevis på epidemiologiske virkningen av storskala behandlingsprogrammer i å redusere forekomsten fire og økende levealder i ressurs-begrensede innstillinger (RLS) 5 fortsetter å hope seg opp, vil arbeidet med å øke ART dekning intensiveres. Utviklingen av retningslinjene til bruk av behandlingen som et forebyggende verktøy 6, 7 under test og behandle programmer betyr at det absolutte antall individer for behandling vil øke ytterligere. Et stort antall individer vil være på ART for lengre perioder av gangen som den gjennomsnittlige levealder for personer på ART nærmer seg at av HIV infisert befolkningen åtte. Utvikling og overføring av HIV legemiddelresistens har alltiys vært betraktet som en trussel mot prestasjoner av ART 9-12. Således er det et behov for en mer rigorøs overvåking og kontroll av legemiddelresistens som flere individer er initiert på ART. Genotypisk legemiddelresistenstesting (GRT) har vært brukt med hell i utviklede land, både for overvåking samt overvåking av HIV-1 resistens hos personer som får ART. I disse innstillingene, har GRT blitt integrert i den behandling for HIV-1 infiserte individer. De fleste internasjonale retningslinjer anbefaler GRT for voksne eller pediatriske pasienter som sviktet ART (første-og andrelinje) 13-15, pediatriske pasienter eksponert for forebygging av mor-til-barn smitte (PMTCT) regimer, men senere smittet 16, og i miljøer med høye nivåer av overført resistens hos akutt infiserte individer 13-15. Imidlertid har kostnadene, teknologi og infrastruktur krav begrenset gjennomføringtering av lignende tilnærminger til narkotika motstand overvåking i RLS. Den sørafrikanske HIV behandling og overvåking retningslinjer for øyeblikket ikke anbefale bruk av GRT i guiding valg av ART for personer sviktende første-linjen regimene 17. Enkeltpersoner er slått primært basert på virologisk (HIV-1 RNA) parametre. Men i 2012, Southern African HIV Klinikere Society publiserte de første Southern African ARV legemiddelresistens testing retningslinjer 18. Disse retningslinjene anbefaler GRT testing for alle voksne sviktende første-og andrelinje ART og for infiserte spedbarn og barn utsatt for PMTCT 18. Imidlertid er GRT ikke anbefalt 18 for akutt infiserte individer, fordi det ikke er noen strøm bevis for høye nivåer av overført legemiddelresistens i Sør-Afrika 19-29. Det er forventet at noen av disse anbefalingene vil bli integrert over tid inn i det nasjonale treling og overvåking retningslinjer for de ulike landene i regionen. Allerede i 2013 sørafrikanske retningslinjer for behandling er det nå anbefaling av GRT på tidspunktet for andre-linjefeil for voksne og på tidspunktet for første-eller andre-linjen PI-basert regime fiasko for barn 30. Det har vist seg at å innlemme GRT inn retningslinjer for behandling i Sør-Afrika ville være potensielt kostnadsnøytralt. Tatt i betraktning kostnadene for de andre behandling legemidler som er relativt dyrere enn de første linje narkotika, bruker GRT å identifisere pasienter som virkelig trenger å bli byttet til andre linje behandling vil ikke medføre noen ekstra kostnader til programmet. I tillegg kan GRT også identifisere andre årsaker til svikt, bevare behandlingstilbud og generere informasjon om nye resistensmønstre 31. Derfor er det nødvendig å redusere kostnadene for legemiddelresistens overvåkingsmetoder enda lenger for å forbedre tilgang, kvaliteten på pleien end utfall. Her presenterer vi en GRT metode utviklet for å bruke generiske (open source) primere for revers transkripsjon, polymerase chain reaction (PCR) og sekvensering (tabell 1), så vel som for det meste åpen kildekode programvare for legemiddelresistens tolkning. For klinisk ledelse, er protokollen kompletteres av en omfattende gjennomgang og rapporteringsmetode med spesialist tolkning av laboratorielegemiddelresistens rapport med nær tilslutning til de nasjonale retningslinjer for behandling. Protokollen er delt inn i fire ulike komponenter; 1) HIV ribonukleinsyre (RNA) Extraction, 2) Omvendt transkripsjon og Polymerase Chain Reaction (PCR) forsterkning av virale mål, 3) Sekvensering og 4) Bioinformatikk metoder for analyse av chromatograms, justering, curation og tolkning av sekvensdata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 resistens har potensial til å seriøst kompromiss effektiviteten og virkningen av antiretroviral terapi (ART). Som ART programmer i Afrika sør for Sahara fortsetter å ekspandere, bør individer på ART overvåkes nøye for fremveksten av legemiddelresistens. Overvåking av overført narkotika motstand å spore overføring av virusstammer som allerede er resistente mot ART er også kritisk. Dessverre, er resistens testing fortsatt ikke er lett tilgjengelig i ressurs begrensede innstillinger, fordi genotyping er dyrt og krever avansert laboratorium og datastyring infrastruktur. En åpen tilgang genotypisk legemiddelresistens overvåking metode for å håndtere individer og vurdere overført resistens er beskrevet. Metoden bruker fri programvare med åpen kildekode for tolkningen av legemiddelresistens mønstre og generering av individuelle pasientrapporter. Den genotyping protokollen har en forsterkning hastighet på større enn 95% for plasmaprøvene med viral belastning&gt; 1000 HIV-1 RNA kopier / ml. Følsomheten reduseres betydelig for viral belastning &lt;1000 HIV-1 RNA kopier / ml. Metoden som beskrives her ble validert mot en metode for HIV-1 resistens testing godkjent av United States Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotyping metode. Begrensninger av metoden beskrevet her inkluderer det faktum at den ikke er automatisert og at det også kunne forsterke den sirkulerende rekombinant form CRF02_AG fra en validerings panel av prøver, selv om det forsterkede undergrupper A og B fra det samme panelet.

Fremgangsmåten ble validert en modifikasjon av en tidligere rapportert fremgangsmåte 20. Den Viroseq genotyping metoden, som har blitt godkjent av FDA, ble brukt som referansemetoden i valideringen. Et panel av kvalitetstestprøver innhentet fra de franske nasjonale kontorene for forskning på AIDS og viral hepatitt (ANRS) ble brukt i den primære sammenligning mellom de to metodene. De to genotyping metodene var 100% konkordant i å identifisere alle klinisk viktige legemiddelresistensassosierte mutasjoner som tolket av HIVDB program for de prøvene som ble vellykket forsterket med begge metodene. Som vist i tabell 6, hvor nukleotidsekvensene til de tre parene var 99,5% identiske. De spådde aminosyresekvensene var 100% identiske. En prøve av fem ikke kunne være vellykket amplifisert ved Viroseq. I tillegg til den prøven ikke forsterket av Viroseq, sviktet husets fremgangsmåte for å forsterke en andre prøve som var vistå være en sirkulerende rekombinant virus (CRF02_AG) av Viroseq. De tre prøver som utdypes med begge metoder var subtype B (to prøver) og subtype A (én prøve). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figur 5. Bruk av en HKY Neighbor Bli treet gjøres som en del av sekvensen kvalitetssikring. Det er fire par / klynger av sekvens med veldig korte genetiske avstander. Den genetiske avstanden mellom RES655 og RES655_1 (samme prøvene sekvensert på ulike dager) er 0.003. Det er en potensiell feil med RES637_1/RES638 paret som deres genetiske avstanden er for kort (0.075) for prøver fra ulike epidemiologisk opphevet tilknytningen individer. Det er en annen RES637 på treet med en avstand på 0,075 i forhold til RES638_1. Den CQ01/CQ02 klynge tyder på at de to utvalgenefra panelet er duplikater av den samme prøven. De klynge sammen med subtype B referansen sekvens bekrefter subtype tildeles av REGA inndeling i undergrupper verktøyet. CQ05 og CQ04 gruppert med undertypene A og G henholdsvis, mens REGA inndeling i undergrupper verktøy klassifisert dem som A og CRF02_AG hhv. Et annet nyttig verktøy for HIV inndeling i undergrupper og rekombinasjon er SCUEL, som er tilgjengelig på http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> Et panel på fem prøver ble brukt for å bedømme nøyaktigheten av den in-house-metoden. Ti replikate genotyper ble samlet for hvert av de fem prøver. Bruke 16 kapil 3130xl genetisk analysator, ble 48 av de 50 genotyper generert fra 24 nedfarter, utarbeidet på samme dag. For alle fem prøvene, den anslåtte aminosyresekvensene var 100% konkordant blant gjentak. For nukleinsyresekvenser, there var&gt; 99% parvise likheten. I løpet av de to første årene av bruk av denne metoden, ble seksti prøver gjentatt tilfeldig fra RNA ekstraksjon til sekvensering. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller mellom sekvensen kvalitet poengsum og antall blandede baser mellom replikatene. Både nukleotid-og aminosyre parvise sammenligninger for de seksti parene var mer enn 99% identisk. Dermed stoffet resistensmutasjonene for alle parene var 100% konkordant. Kostnadsreduksjon Reaksjonsvolumer for RT, PCR og sekvensering ble redusert med minst halvparten, i forhold til den opprinnelige metoden 20, 32, uten å gi avkall på kvaliteten av sekvensene generert. Dette muliggjort en reduksjon av kostnadene med 50% for RT-og PCR-trinn. Den nye metoden ble opprinnelig utviklet for bruk med seks sekvense primer til sekvens<html> alle 99 kodoner av protease-genet og de ​​første 300 kodoner av den reverse transkriptase gene 20, 32.. Lignende metoder også bruke seks til åtte primere 33, 34. Noen nylig publiserte metoder har brukt mindre enn seks primere, men noen ganger sekvensering av protease og RT gener seprately 35, 36. Vi har søkt å redusere antall sekvense primere 6-4, (figur 6) <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figur 6. Sammenligning av etterfølgende sekvenser fra seks vs fire sekvense primere for generering av den 1197 bp pol-sekvens som omfatter alle 99 HIV-1-protease-kodon og de ​​første 300 kodoner av revers transkriptase-genet.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større bilde. Sekvenser fra et sett av 17 prøver som er generert fra seks primere ble sammenlignet med sekvenser som er generert etter uttrekk av to primere (MAW46 og rty). Subtypene var 14 subtype C, to subtype B, og en undertype A. Det var ingen signifikante forskjeller i sekvens kvalitetspoeng. Igjen var den gjennomsnittlige parvise identitet mellom de 17 parene av nukleinsyre ble 99% og 100% på aminosyrenivået. Dermed redusere sekvense primere 6-4 resulterte i en reduksjon i sekvense kostnadene med nesten en tredjedel. Den eneste proprietær programvare verktøy som brukes i denne protokollen var Geneious for sekvens montering. De legemiddelresistens tolkningsverktøy, samt rapporten genererer verktøy er gratis, åpen tilgang til verktøy. Dette reduserer kostnadene ytterligere ved å eliminere kostnadene ved bruk av proprietær programvare. Videre collective forhandling tillot reagenser for denne protokollen til å bli pakket inn i et kit for enkel tilgang fra Life Technologies og er tilgjengelig som Saturn / Life Technologies genotyping metode 37. Videre kan Saturn medlemmer tilgang til reagenser til en rabattert pris. Klinisk Setting Den beskrevne protokollen er implementert i overvåking av resistens i et bygdesamfunn i KwaZulu-Natal. Totalt 604 genotyper ble generert fra kliniske prøver mellom desember 2010 og mai 2013 en forsterkning sats på 95% for prøver med virusmengde&gt; 1000 RNA kopier / ml. Denne kliniske HIV legemiddelresistens Studien ble godkjent av Biomedisinsk forskningsetiske komité ved University of KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) og helseforskningskomiteen i KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10). Enkelte pasientrapporter ble generert og sendt tilbake til klinikkenefor behandlingen av pasienten. Sytti to (72) genotyper ble også dannet som en del av et overvåkningssystem for overført legemiddelresistens studien, nestet i en stor potensiell populasjonsbasert HIV overvåkning studien. Den primære prøvene var nålestikk fullblod samlet i EDTA mikrorør. Ved genotyping var det en forsterkning prosent på 79% 19. Etikk godkjenning for genotyping av prøver fra overvåkningen studien ble hentet fra University of KwaZulu-Natal Biomedisinsk forskningsetiske komité (ref. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer navn </td><td> Sequence </td><td> Lengde </td><td> Direction </td><td> HXB2 Stilling </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Forward </td><td> 2028-2050 </td><td> Første runde PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverse </td><td> 3539-3509 </td><td> Første runde PCR </td></tr><tr><td> Pro-en </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> 20 </td><td> Forward </td><td> 2147-2166 </td><td> Andre runde PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 3462-3441 </td><td> Andre runde PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Forward </td><td> 2486-2508 </td><td> Sekvense </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Sekvense </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Forward </td><td> 2956-2994 </td><td> Sekvense </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Sekvense </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Sekvense </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Forward </td><td> 2251-2277 </td><td> Sekvense </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Revers transkripsjon, PCR og sekvense tilpassede primere som brukes i produksjon av et 1197 bp pol-fragment som dekker alle de 99 HIV-1 Protease-kodon og de ​​første 300 kodoner av den omvendte trascriptase genet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mm) </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 2. dNTP / Primer blandes for revers transkripsjon reaksjon. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volum (ml) / reaksjons </td><td> Konsentrasjon / reaksjon </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Hevet III revers transkriptase (200U/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Enzym blande for revers transkripsjon reaksjonen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volum (ml) / reaksjons </td><td> Endelig konsentrasjon / Reaction </td></tr><tr><td> DEPC behandlet vann </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR Buffer (10x) </td><td> 2,5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mm) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Froward primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Omvendt primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Platina Taq-polymerase (5 U / ml) </td><td> 0,1 </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Delsum </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Master miksen for nestet PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volum (ml) / reaksjons </td><td> Konsentrasjon / reaksjon </td></tr><tr><td> DEPC behandlet vann </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sekvense Buffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> Big Dye terminator Sekvense mix </td><td> 0,4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Total </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 5. Master mix for sekvenseringsreaksjoner. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA Likhet </td></tr><tr><td> Sample ID </td><td> Subtype </td><td> Kvalitetspoeng </td><td> PR Mutasjoner </td><td> RT mutasjoner </td><td> Subtype </td><td> Kvalitetspoeng </td><td> PR mutasjoner </td><td> RT Mutasjoner </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabell 6. Comparative results fra en parallellanalyse mellom Viroseq genotyping metoden og in-house metode ved hjelp av et panel av prøver gitt av ANRS.

Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Resistens testing for HIV-1 infiserte individer sviktende antiretroviral terapi (ART) kan veilede fremtidige terapier og forbedre behandlingsresultatene. Optimalisere individuelle og befolkningshelseutfall i høy HIV-prevalens men ressurs-begrensede innstillinger til slutt vil kreve rimelig og tilgjengelig legemiddelresistens genotyping og tolkningsmetoder.

En rimelig HIV-1 Drug Resistance Monitoring Metode for Ressurs Limited Innstillinger

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

En orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastase

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Teknikker for Processing Eyes implantert med en retinal protese for Lokalisert Histopatologisk analyse: Del 2 Epiretinal Implantater med retina Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Innkapsling Thermogenic preadipocytes for Transplantasjon inn fettvev depoter

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementering av<em&gt; In Vitro</em&gt; Legemiddelresistens Analyser: maksimere potensialet for Avdekke klinisk relevante resistensmekanismer

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En forbedret fremgangsmåte for Rapid intubering av trakea hos mus

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

A Novel Approach for administrasjonen av medisiner og Fluids i nødsituasjoner og innstillinger

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Pankreaskanalinfusjon: En effektiv og selektiv metode for legemiddel- og viruslevering

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimalisert LC--MS-/ MS metoden for høy gjennomstrømming analyse av klinisk prøver av Ivacaftor, store metabolitter og Lumacaftor i biologiske væsker Cystic Fibrosis pasienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metoden for etablering av en In Vitro blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...