Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
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Os autores gostariam de agradecer a todos os colegas que fizeram este trabalho possível, especialmente Maya Balamane, Elizabeth Johnston Branco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, e Lungani Ndwandwe. Os autores também gostariam de agradecer a todo o pessoal do Departamento de Saúde e pessoal África Centro que trabalham no tratamento do HIV e Hlabisa Programa Care.

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<div> Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), União Europeia (SANTE 2007 147-790), o Centro dos EUA para Controle de Doenças via CAPRISA (título do projeto: Fortalecimento dos Sistemas de Saúde e falência de tratamento do HIV (HIV- TFC)), eo Programa de Investigação Suíça Sul-Africano Conjunta (SSJRP) bolsa de pesquisa intitulado &quot;Swiss Prot / África do Sul: Proteína Bioinformatics Resource Development para importantes patógenos relacionados com a saúde&quot;. RL é apoiado pelo Wellcome Trust (número de concessão 090999 / Z / 09 / Z). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes. </div>

Vários de baixo custo em casa métodos têm sido descritos em esforços para tentar fazer a genotipagem do HIV resistência aos medicamentos mais acessíveis 33, 34, 36. Não há dúvida sobre a necessidade de integrar os testes de resistência à continuidade dos cuidados para as pessoas em terapia anti-retroviral em contextos de recursos limitados. No entanto, a maioria dos métodos relatados focar a aplicação da genotipagem resistência aos medicamentos na vigilância da resistência aos medicamentos em nível populacional. O método de genotipagem Saturno / Life Technologies é um protocolo totalmente integrado para vigilância e monitorização da resistência aos medicamentos. Este método foi projetado para ser um protocolo acessível implementação principalmente de código aberto e aberto recursos de bioinformática de acesso para a interpretação da resistência às drogas e geração de relatórios para a gestão clínica. Foi mostrado através de comparação com o método de genotipagem aprovado pela FDA para ser comercial Viroseqpreciso na identificação de mutações de resistência a partir de um painel de ANRS amostras de ensaios de proficiência, em 100% das amostras do painel de laboratório que foram amplificados com sucesso. A precisão também foi avaliada em amostras clínicas de vírus subtipo C, o subtipo mais dominante na África Austral. O método foi o mais preciso sobre amostras do subtipo C como foi no subtipo A e B. No entanto, se o método poderia ser usado em outras partes do mundo onde CRF02_AG é predominante, há uma necessidade para a modificação dos iniciadores, uma vez o método falhou para amplificar uma das amostras do painel que foi mostrado ter CRF02_AG. Alternativamente, um conjunto degenerado de iniciadores sensíveis a todos os vírus do grupo M 33, 36 podiam ser utilizados em regiões em que a distribuição do subtipo é mais heterogénea 38. A sensibilidade da transcrição reversa e PCR, pode ser aumentada através da extracção de ARN a partir de volumes mais elevados de plasma, tais como 500 ml. O plasma pode ser centrifuged a 21.000 xg durante 90 minutos para concentrar as partículas virais antes de prosseguir com o protocolo como descrito por o mini kit de extração de RNA viral QIAamp. Como mostrado, o novo método tem uma vantagem adicional que produz relatórios abrangentes para a gestão individual do paciente. Estes relatórios são uma consolidação do genótipo, o imunológicos e virológicos dados de monitoramento, bem como a história clínica eo tratamento de RegaDB. Isto é acompanhado por uma interpretação laboratorial detalhada do perfil de resistência seguida de uma análise igualmente detalhada da história clínica do paciente, bem como as recomendações de tratamento. O uso de um especialista médico para examinar os relatórios e fornecer recomendações de tratamento para os pacientes fornece a orientação muito necessária para os profissionais de enfermagem, bem como os médicos inexperientes, que estão cada vez mais oferecendo ART na África do Sul, como parte das recomendações da OMS para o revezamento de tarefas. Estes clínicarelatórios têm se mostrado eficazes auxiliares de ensino para médicos com pouca ou nenhuma experiência em gestão de resistência aos medicamentos. Do ponto de vista do paciente, o nosso método reduz a necessidade de viajar para locais centralizados para acessar serviços de HIV especializadas. Assim, o protocolo descrito como um todo oferece uma boa plataforma através da qual a gestão resistência ao HIV podem ser integrados, a um custo acessível, para a continuidade dos cuidados para as pessoas infectadas pelo HIV não ART. Os dados gerados podem ser usados ​​para fins epidemiológicos para avaliar a evolução e transmissão de resistência às drogas na comunidade. O tamanho do fragmento pol gerado é bom o suficiente para a análise filogenética mais complexo, que irá produzir um melhor entendimento da epidemia a nível populacional.

A epidemia de HIV na África Austral vem evoluindo rapidamente 1, com um aumento exponencial concomitante em indivíduos em terapia anti-retroviral (ART), especialmente na África do Sul 2, 3. Como evidência sobre o impacto epidemiológico de programas de tratamento em larga escala na redução da incidência 4 e aumento da expectativa de vida em contextos de recursos limitados (SPI) 5 continua a acumular, os esforços para aumentar a cobertura ART será intensificado. A evolução das orientações para a utilização de tratamento como um instrumento de prevenção de 6, 7, sob o teste e programas de tratamento significa que o número absoluto de indivíduos em tratamento irá aumentar. Um grande número de pessoas estará em ART por longos períodos de tempo em que a expectativa de vida média das pessoas em TARV que se aproxima da população não infectada pelo HIV 8. O desenvolvimento e transmissão de resistência ao HIV tem always sido considerado uma ameaça para as conquistas da ART 9-12. Assim, há uma necessidade de vigilância e monitorização da resistência aos medicamentos mais rigoroso quanto mais pessoas são iniciadas no ART. Testes de resistência genotípica (GRT) tem sido usado com sucesso em países desenvolvidos, tanto para a vigilância, bem como o monitoramento do HIV-1 resistência a drogas em indivíduos que recebem ART. Nesses ambientes, GRT foi integrado no continuum de cuidados para o HIV-1 indivíduos infectados. A maioria das diretrizes internacionais recomendam GRT para pacientes adultos ou pediátricos falhando ART (de primeira linha e de segunda linha) 13-15, pacientes pediátricos expostos a prevenção da transmissão mãe-filho (PMTCT) regimes, mas posteriormente infectou 16, e em locais com altos níveis de resistência a drogas transmitido entre os indivíduos com infecção aguda 13-15. No entanto, os requisitos de custo, tecnologia e infra-estrutura têm limitado a implementação de abordagens semelhantes para o monitoramento da resistência de droga em RLS. O tratamento Africano Sul HIV e diretrizes de monitoramento atualmente não recomendam o uso de GRT para orientar escolha de ART para indivíduos falhando regimes de primeira linha 17. Os indivíduos estão ligados principalmente com base em (HIV-1 RNA carga viral) parâmetros virológicos. No entanto, em 2012, o Sul Africano HIV médicos Society publicou as primeiras diretrizes de teste a resistência aos medicamentos ARV Africano do Sul 18. Estas diretrizes recomendam o teste GRT para todos os adultos na falta de primeira linha e de segunda linha ART e para crianças infectadas e crianças expostas ao pMTCT 18. No entanto, não é recomendado GRT 18 para indivíduos com infecção aguda, porque não há evidência atual para altos níveis de resistência a drogas transmitida no sul da África 19-29. Espera-se que algumas destas recomendações será integrado ao longo do tempo para o tre nacionaltamento e acompanhamento das diretrizes dos diversos países da região. Já, nas diretrizes de tratamento 2013 Sul-Africano agora há recomendação do TAB no momento da falha de segunda linha para adultos e no momento da falha regime de primeira ou de segunda linha baseada em PI para as crianças 30. Demonstrou-se que a incorporação de TAB em orientações de tratamento na África do Sul seria potencialmente custo-neutro. Considerando o custo dos medicamentos de segunda linha regimen que são relativamente mais caro do que as drogas de primeira linha, usando TAB para identificar os pacientes que realmente precisam para ser transferido para tratamento de segunda linha não acarretará qualquer custo adicional para o programa. Além disso, o TAB também pode identificar outras razões para o fracasso, conservar as opções de tratamento e gerar informações sobre os padrões de resistência emergentes 31. Portanto, é necessário reduzir o custo dos métodos de monitoramento de resistência a drogas ainda mais, a fim de melhorar o acesso, a qualidade dos cuidados de umd resultados. Aqui, apresentamos um método GRT projetado para usar genéricos (open source) primers para a transcrição reversa, reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento (Tabela 1), bem como software de código aberto na maior parte para a interpretação resistência aos medicamentos. Para abordagem clínica, o protocolo é complementado por uma análise e descrição método abrangente, com interpretação especialista do relatório resistência a drogas de laboratório, com cerca adesão às diretrizes nacionais de tratamento. O protocolo é dividido em quatro componentes diferentes: 1) Ácido HIV ribonucleico (ARN) de extracção, 2) da transcrição reversa e reacção de polimerase em cadeia (PCR) amplificação de alvos virais, 3) Sequenciação e 4) métodos de bioinformática para análise dos cromatogramas, alinhamento, curadoria e interpretação de dados de seqüência.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 resistência à droga tem o potencial de comprometer seriamente a eficácia eo impacto da terapia anti-retroviral (ART). Como os programas de arte em África subsaariana continua a expandir-se, os indivíduos em TARV devem ser cuidadosamente monitorizados para o aparecimento de resistência às drogas. Vigilância da resistência às drogas transmitida para acompanhar a transmissão de cepas virais já resistentes a ART também é crítica. Infelizmente, o teste de resistência a drogas ainda não é facilmente acessível em contextos de recursos limitados, porque a genotipagem é caro e requer laboratório sofisticado e infra-estrutura de gerenciamento de dados. Um método de monitoramento da resistência genotípica acesso aberto para gerir pessoas e avaliar a resistência aos medicamentos transmitida é descrito. O método utiliza o software livre de código aberto para a interpretação dos padrões de resistência às drogas e à geração de relatórios individuais dos pacientes. O protocolo de genotipagem tem uma taxa de amplificação maior do que 95% para as amostras de plasma com avcarga Iral&gt; 1000 de HIV-1 de cópias de ARN / ml. A sensibilidade diminui significativamente para cargas virais &lt;1000 cópias de RNA do HIV-1 / ml. O método descrito aqui foi validado contra um método de HIV-1 resistência a drogas de teste aprovados pelos Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA), o método de genotipagem comercial Viroseq. As limitações do método aqui descrito incluem o facto de que não é automatizado e que também não conseguiu amplificar a forma circulante CRF02_AG recombinante a partir de um painel de amostras de validação, embora amplificado subtipos A e B a partir do mesmo painel.

O método validado foi uma modificação de um método previamente relatado 20. O método de genotipagem comercial Viroseq, que foi aprovado pela FDA, foi usado como o método de referência para a validação. Um painel de amostras de ensaios de proficiência obtidas a partir das Agências Nacional Francês para Pesquisa sobre Aids e Hepatites Virais (ANRS) foi usado na comparação preliminar entre os dois métodos. Os dois métodos de genotipagem foram 100% concordantes na identificação de todas as mutações clinicamente importantes associadas a resistência a drogas como interpretado pelo programa HIVDB para as amostras que foram amplificados com sucesso por ambos os métodos. Como mostrado na Tabela 6, as sequências de nucleótidos dos três pares foram de 99,5% idênticas. As sequências de aminoácidos previstas eram 100% idêntica. Uma amostra de cada cinco não poderia ser amplificado com sucesso por comercial Viroseq. Em adição à amostra amplificada não por comercial Viroseq, o método em casa não conseguiu amplificar uma segunda amostra que foi mostradoser um vírus recombinante circulante (CRF02_AG) pelo comercial Viroseq. As três amostras que amplificaram com as duas metodologias foram subtipo B (duas amostras) e subtipo A (uma amostra). <img alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figura 5. O uso de um vizinho Juntando árvore HKY feito como parte da garantia de qualidade seqüência. Há quatro pares / grupos de seqüência com as distâncias genéticas muito curtos. A distância genética entre RES655 e RES655_1 (mesmas amostras seqüenciadas em dias diferentes) é 0,003. O é um erro potencial com o par RES637_1/RES638 como sua distância genética é muito curta (0,075) para amostras de diferentes indivíduos não vinculados epidemiologicamente. Há um outro RES637 na árvore com uma distância de 0,075 quando comparado com RES638_1. O aglomerado CQ01/CQ02 sugere que as duas amostrasa partir do painel são duplicados da mesma amostra. Eles agrupam com a sequência de referência subtipo B confirmando o subtipo atribuído pela ferramenta REGA subtipos. CQ05 e CQ04 agrupado com os subtipos A e G, respectivamente, enquanto que a ferramenta REGA subtyping deles classificados como A e CRF02_AG respectivamente. Outra ferramenta útil para subtipagem e recombinação do HIV é SCUEL, que está disponível no http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Um painel de cinco amostras foi usado para avaliar a precisão do método de casa. Dez genótipos replicados foram gerados para cada uma das cinco amostras. Usando o analisador genético 16 capilar 3130xl, 48 dos 50 genótipos foram gerados a partir de 24 pistas, preparados no mesmo dia. Para todas as cinco amostras, as sequências de aminoácidos previstas eram 100% concordante entre repetições. Para sequências de ácidos nucleicos a, there era&gt; 99% de similaridade aos pares. Durante os primeiros dois anos da utilização deste método, sessenta amostras foram repetidas aleatoriamente de extracção de ARN para a sequenciação. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre o índice de qualidade de sequência eo número de bases mistas entre as repetições. Ambas as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para as comparações de pares sessenta pares foram maiores do que 99% idêntica. Assim, as mutações de resistência para todos os pares foram 100% concordantes. Redução de custos Os volumes de reacção de RT, PCR e sequenciação foram reduzidas em pelo menos a metade, em relação ao método original de 20, 32, sem comprometer a qualidade das sequências geradas. Isto permitiu uma redução no custo de 50% para as etapas de RT e PCR. O novo método foi originalmente concebido para funcionar com seis seqüenciamento cartilha para seqüência<html> todos os 99 codões do gene da protease e os primeiros 300 codões do gene da transcriptase reversa 20, 32. Métodos semelhantes também utilizar seis a oito iniciadores 33, 34. Alguns métodos publicados recentemente usaram menos de seis primers, embora às vezes o seqüenciamento do protease e genes RT seprately 35, 36. Buscou-se reduzir o número de iniciadores de sequenciação de seis para quatro, (Figura 6) <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> A Figura 6. Comparação de sequências contíguas de seis vs quatro iniciadores de sequenciação para a geração da sequência pol 1197 pb abrangendo todos os 99 HIV-1 codões e os primeiros 300 codões do gene da transcriptase reversa.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. Sequências de um conjunto de 17 amostras geradas a partir de seis iniciadores foram comparados com sequências geradas após a exclusão de dois iniciadores (MAW46 e RTY). Os subtipos foram 14 subtipo C, dois subtipo B, e um subtipo A. Não houve diferenças significativas nos índices de qualidade de seqüência. Mais uma vez, a identidade emparelhados média entre os 17 pares de ácido nucleico era de 99% e 100% em relação ao nível de aminoácidos. Assim, reduzindo os iniciadores de sequenciação de seis para quatro resultou numa redução no custo de sequenciação em quase um terço. A única ferramenta de software proprietário usado neste protocolo foi Geneious para montagem seqüência. As ferramentas de interpretação resistência às drogas, bem como o relatório de geração de ferramentas são todos, ferramentas gratuitas de acesso aberto. Isto reduz o custo adicional, eliminando os custos associados com o uso de software proprietário. Além disso, CollectiVe negociação permitiu que os reagentes para este protocolo para ser empacotado em um kit para facilitar o acesso da Life Technologies e está disponível como as Tecnologias de Saturno / Vida método 37 genotipagem. Além disso, os membros Saturno pode acessar os reagentes a um preço com desconto. Ambiente clínico O protocolo descrito foi implementado no monitoramento e vigilância da resistência às drogas em uma comunidade rural na província de KwaZulu-Natal. Um total de 604 genótipos foram gerados a partir de amostras clínicas, entre dezembro de 2010 e maio de 2013, uma taxa de ampliação de 95% para as amostras com carga viral&gt; 1.000 RNA cópias / ml. Este estudo clínico resistência ao HIV foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica da Universidade de KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) e do Comitê de Investigação da Saúde do Departamento de KwaZulu-Natal da Saúde (ref. HRKM 176/10). Relatórios individuais dos pacientes foram gerados e enviados de volta para as clínicaspara o doente. Setenta e dois (72) genótipos também foram gerados como parte de um sistema de vigilância de resistência a drogas estudo transmitida, aninhada dentro de um estudo de vigilância de grande potencial de base populacional HIV. As amostras primárias foram todo agulha picada sangue coletado em microtubos EDTA. Na genotipagem houve uma taxa de ampliação de 79% 19. Aprovação de Ética para a genotipagem de amostras a partir do estudo de vigilância foi obtida a partir da Universidade do Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica KwaZulu-Natal (ref. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome do iniciador </td><td> Seqüência </td><td> Comprimento </td><td> Direção </td><td> Posição HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Para a frente </td><td> 2028-2050 </td><td> 1 ª eliminatória PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverso </td><td> 3539-3509 </td><td> 1 ª eliminatória PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Para a frente </td><td> 2147-2166 </td><td> 2 PCR rodada </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverso </td><td> 3462-3441 </td><td> 2 PCR rodada </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Para a frente </td><td> 2486-2508 </td><td> Sequenciamento </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverso </td><td> 2630-2604 </td><td> Sequenciamento </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Para a frente </td><td> 2956-2994 </td><td> Sequenciamento </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverso </td><td> 3129-3101 </td><td> Sequenciamento </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverso </td><td> 2967-2946 </td><td> Sequenciamento </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Para a frente </td><td> 2251-2277 </td><td> Sequenciamento </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Transcrição, PCR e iniciadores de sequenciação personalizados utilizados na geração de um fragmento de 1197 pb de pol cobrindo todas as 99 HIV-1 protease e os codões dos primeiros 300 codões do gene trascriptase inversas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Rt21 (5pmol/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> de dNTP (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. dNTP / mistura de iniciadores para a reacção de transcrição reversa. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; espaçamento das = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reação </td><td> Concentração / reação </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Sobrescrito III transcriptase reversa (200U/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Enzima misturar para a reacção de transcrição reversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reação </td><td> Concentração Final / Reaction </td></tr><tr><td> DEPC água tratada </td><td> 18,4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tampão de PCR (10x) </td><td> 2,5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> mistura de dNTP (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Froward iniciador (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Primer reverso (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq polimerase (5 U / ml) </td><td> 0,1 </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Subtotal </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Mix Master para a PCR aninhada. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) / reação </td><td> Concentração / reação </td></tr><tr><td> DEPC água tratada </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenciamento Buffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Iniciador (3,2 pmol / mL) </td><td> 0,5 </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> Big Dye terminator mix Seqüenciamento </td><td> 0,4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Total </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 5. Mix Master para as reações de seqüenciamento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Comercial Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> Similaridade% de NA </td></tr><tr><td> Amostra ID </td><td> Subtipo </td><td> Índice de qualidade </td><td> PR Mutações </td><td> Mutações RT </td><td> Subtipo </td><td> Índice de qualidade </td><td> Mutações PR </td><td> RT Mutações </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99,9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,2 </td><td> M46L, I54L, V82Um, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98,4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Resul Comparativats de uma análise paralela entre o método de genotipagem comercial Viroseq e o método em casa, utilizando um painel de amostras fornecidas pelo ANRS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

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