Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
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Los autores desean dar las gracias a todos los colegas que hicieron posible este trabajo, especialmente Maya Balamane, Elizabeth Johnston Blanco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott y Lungani Ndwandwe. Los autores también desean agradecer a todo el personal del Departamento de Salud y personal de África Centro que trabajan el Tratamiento del VIH Hlabisa y el Programa de Atención.

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<div> Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Unión Europea (SANTE 2007 147-790), el Centro de EE.UU. para el control de enfermedades a través de CAPRISA (Título del proyecto: Fortalecimiento de Sistemas de Salud y el fracaso del tratamiento del VIH (VIH- TFC)), y el Programa Común de Investigación suizo africano del sur (SSJRP) beca de investigación titulado &quot;Swiss Prot / Sudáfrica: Proteína Bioinformática Desarrollo de Recursos de patógenos relacionados con la salud importantes&quot;. RL es apoyada por el Wellcome Trust (número de concesión 090999 / Z / 09 / Z). Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia. </div>

Varios de bajo costo métodos internos se han descrito en los esfuerzos para tratar de hacer el genotipado de resistencia del VIH más asequible 33, 34, 36. No hay duda de la necesidad de integrar las pruebas de resistencia a los medicamentos en el continuo de la atención a las personas en tratamiento antirretroviral en entornos con recursos limitados. Sin embargo, la mayoría de los métodos denunciados se centran en la aplicación de genotipado resistencia a los medicamentos en la vigilancia de la resistencia a los medicamentos a nivel de población. El método de genotipificación SATURN / Life Technologies es un protocolo totalmente integrado para la vigilancia y el seguimiento de la farmacorresistencia. Este método fue diseñado para ser un protocolo asequible implementar fuente mayoría abiertos y abiertas recursos bioinformáticos de acceso para la interpretación de la resistencia a los medicamentos y la generación de informes para la gestión clínica. Se ha demostrado a través de la comparación con el método de genotipificación ViroSeq aprobado por la FDA para serprecisa en la identificación de mutaciones de resistencia a medicamentos de un panel de muestras de ensayos de aptitud ANRS, en el 100% de las muestras del panel de laboratorio que fueron amplificados con éxito. La precisión también se evaluó en muestras clínicas de los virus del subtipo C, el subtipo más dominante en el sur de África. El método era tan precisa sobre muestras del subtipo C, ya que era el subtipo A y B. Sin embargo, si el método se utiliza en otras partes del mundo donde CRF02_AG es frecuente, hay una necesidad para la modificación de los cebadores ya que el método fallado para amplificar una de las muestras de panel que ha demostrado tener CRF02_AG. Alternativamente, un conjunto degenerado de cebadores sensibles a todos los virus del grupo M 33, 36 podría ser utilizado en regiones en las que la distribución subtipo es más heterogéneo 38. La sensibilidad de la transcripción inversa y la PCR se puede aumentar mediante la extracción de ARN a partir de mayores volúmenes de plasma, tales como 500 ml. El plasma se puede Centrifuged a 21.000 xg durante 90 minutos para concentrar las partículas virales antes de proceder con el protocolo descrito por el mini-kit de extracción de ARN viral QIAamp. Como se muestra, el nuevo método tiene una ventaja adicional que produce informes completos para la gestión individual del paciente. Estos informes son una consolidación del genotipo, el inmunológico y los datos de vigilancia virológica, así como la historia clínica y el tratamiento de RegaDB. Esto va acompañado de una interpretación de laboratorio detallada del perfil de resistencia seguida de un examen igualmente detallada de la historia clínica del paciente, así como recomendaciones de tratamiento. La utilización de un médico especialista para revisar los informes y proporcionar recomendaciones de tratamiento para los pacientes ofrece la tutoría muy necesaria para los profesionales de enfermería, así como a los médicos sin experiencia, que están proporcionando cada vez ART en Sudáfrica como parte de las recomendaciones de la OMS para el cambio de tareas. Estos clínicainformes han demostrado ser medios de enseñanza eficaces para los médicos con poca o ninguna experiencia en la gestión de resistencia a los medicamentos. Desde la perspectiva del paciente, nuestro método reduce la necesidad de viajar a sitios centralizados para acceder a los servicios de VIH especializados. Por lo tanto, el protocolo descrito considerado en su conjunto ofrece una buena plataforma a través del cual la gestión de la resistencia del VIH se puede integrar, a un costo accesible, en la continuidad de la atención a las personas infectadas por el VIH no ART. Los datos generados se pueden usar para fines epidemiológicos para evaluar la evolución y la transmisión de la resistencia a los medicamentos en la comunidad. El tamaño del fragmento pol generado es lo suficientemente bueno para el análisis filogenético más complejo que producirá mejor comprensión de la epidemia a nivel de la población.

La epidemia de VIH en el sur de África ha ido evolucionando rápidamente 1 con un aumento exponencial concomitante en los individuos en terapia antirretroviral (ART), especialmente en el sur de África 2, 3. Como evidencia del impacto epidemiológico de los programas de tratamiento a gran escala en la reducción de la incidencia de 4 y el aumento de la esperanza de vida en los entornos con recursos limitados (RLS) 5 continúa acumulándose, se intensificarán los esfuerzos para aumentar la cobertura de ART. La evolución de las directrices para el uso del tratamiento como herramienta de prevención 6, 7, bajo la prueba y los programas de tratamiento significa que el número absoluto de personas en tratamiento se incrementará aún más. Un gran número de personas estarán en ART durante períodos más largos de tiempo ya que la esperanza media de vida de las personas en tratamiento antirretroviral se acerca a la de la población no infectada por VIH 8. El desarrollo y la transmisión de la farmacorresistencia del VIH tiene always sido considerado una amenaza para los logros de la ART 12.9. Por lo tanto, hay una necesidad de más rigurosa vigilancia y el control de la resistencia a fármacos como se inician más individuos en ART. Efectuar pruebas de resistencia genotípica de drogas (TRB) se ha utilizado con éxito en los países desarrollados, tanto para la vigilancia y el monitoreo del VIH-1 resistencia a los medicamentos en las personas que reciben tratamiento antirretroviral. En esta configuración, GRT se ha integrado en la continuidad de la atención para el VIH-1 en individuos infectados. La mayoría de las guías internacionales recomiendan TRB para adultos y pacientes pediátricos en su defecto ART (de primera línea y de segunda línea) 13-15, los pacientes pediátricos expuestos a la prevención de la transmisión materno-infantil (PTMI) regímenes pero posteriormente infectan 16, y en entornos con altos niveles de resistencia a los medicamentos de transmisión entre las personas con infección aguda 13-15. Sin embargo, los requisitos de coste, la tecnología y la infraestructura han limitado la implementaciónción de enfoques similares para la supervisión resistencia a los medicamentos en el SPI. El tratamiento de Sudáfrica el VIH y las directrices de seguimiento no se recomienda actualmente el uso de toneladas de registro bruto en la orientación de la elección de la terapia antirretroviral para las personas que fallan regímenes de primera línea 17. Las personas se conectan basado principalmente en virológica parámetros (VIH-1 RNA carga viral). Sin embargo en 2012, el sur de África Los clínicos Sociedad VIH publicó las primeras directrices de las pruebas de resistencia de drogas ARV África del Sur 18. Estas directrices recomiendan las pruebas TRB para todos los adultos en su defecto de primera línea y de segunda línea y para los bebés y niños infectados expuestos a pMTCT 18. Sin embargo, GRT, no se recomienda para las personas de 18 infectados en forma aguda debido a que no hay evidencia actual de altos niveles de resistencia a los medicamentos de transmisión en el sur de África 19-29. Se espera que algunas de estas recomendaciones se integrarán con el tiempo en el tre nacionaldirectrices tamiento y seguimiento de los distintos países de la región. Ya en los 2013 las directrices de tratamiento de Sudáfrica ahora hay recomendación del GRT en el momento del fallo de segunda línea para adultos y al momento de la falla régimen basado en IP de primera o de segunda línea para los niños 30. Se ha demostrado que la incorporación de TRB en las guías de tratamiento en Sudáfrica sería potencialmente costo-neutral. Teniendo en cuenta el costo de los medicamentos de segunda línea régimen que son relativamente más caros que los fármacos de primera línea, utilizando TRB para identificar a los pacientes que realmente necesitan ser cambiado a la terapia de segunda línea no supondrá ningún coste adicional para el programa. Además, GRT también puede identificar otras razones para el fracaso, la conservación de las opciones de tratamiento y generar información sobre los patrones de resistencia emergentes 31. Por lo tanto, es necesario para reducir el coste de los métodos de monitoreo de resistencia a fármacos aún más con el fin de mejorar el acceso, la calidad de un cuidadolos resultados d. A continuación, presentamos un método TRB destinados a utilizar (de código abierto) cebadores genéricos para la transcripción reversa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación (Tabla 1), así como software de código abierto en su mayoría para la interpretación resistencia a los medicamentos. Para la gestión clínica, el protocolo se complementa con un método integral y notificando a la interpretación especialista del informe resistencia a los medicamentos de laboratorio con una estrecha adhesión a las directrices nacionales de tratamiento. El protocolo se divide en cuatro componentes diferentes: 1) Ácido VIH ribonucleico (ARN) Extracción, 2) transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación de dianas virales, 3) Secuenciación y 4) los métodos de bioinformática para el análisis de los cromatogramas, alineación, curación y la interpretación de los datos de secuencia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

VIH-1 resistencia a los medicamentos tiene el potencial de comprometer seriamente la eficacia y el impacto de la terapia antirretroviral (ART). Como los programas de TAR en África subsahariana siguen expandiéndose, las personas en tratamiento antirretroviral deben ser estrechamente monitorizados para la aparición de resistencia a los medicamentos. La vigilancia de la farmacorresistencia transmitida para rastrear la transmisión de cepas virales resistentes a los antirretrovirales ya es también crítico. Desafortunadamente, las pruebas de resistencia a los medicamentos aún no es de fácil acceso en los entornos con recursos limitados, ya que la genotipificación es caro y requiere de laboratorio sofisticado y la infraestructura de gestión de datos. Un acceso abierto método de seguimiento de la resistencia genotípica al fármaco para gestionar personas y evaluar la resistencia a fármacos de transmisión se describe. El método utiliza el software libre de código abierto para la interpretación de los patrones de resistencia a los medicamentos y la generación de informes individuales de los pacientes. El protocolo de determinación del genotipo tiene una tasa de amplificación de más de un 95% para las muestras de plasma con AVcarga iral&gt; 1000 VIH-1 RNA copias / ml. La sensibilidad disminuye significativamente para cargas virales &lt;1.000 copias de ARN del VIH-1 / ml. El método descrito aquí se valida con un método para el VIH-1 resistencia a los fármacos de ensayo aprobados por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos (FDA), el método de genotipificación ViroSeq. Limitaciones del método descrito aquí incluyen el hecho de que no está automatizado y que también falló para amplificar la forma circulante CRF02_AG recombinante a partir de un panel de validación de muestras, aunque se amplificó subtipos A y B de la misma panel.

El método validado fue una modificación de un método descrito previamente 20. El método de genotipificación ViroSeq, que ha sido aprobado por la FDA, se utilizó como método de referencia en la validación. Un panel de muestras de ensayos de aptitud obtenidos de las agencias nacionales de francés para la Investigación sobre el SIDA y la hepatitis viral (ANRS) se utilizó en la comparación principal entre los dos métodos. Los dos métodos de genotipificación fueron 100% concordantes en la identificación de todas las mutaciones clínicamente importantes asociadas a la resistencia de la droga tal como fue interpretado por el programa HIVDB para las muestras que fueron amplificados con éxito por ambos métodos. Como se muestra en la Tabla 6, las secuencias de nucleótidos de los tres pares eran 99,5% idéntica. Las secuencias de aminoácidos predichas eran 100% idénticas. Una muestra de cada cinco no pudo ser amplificado con éxito por ViroSeq. Además de la muestra no amplificada por ViroSeq, el método de la casa no pudo amplificar una segunda muestra, que se muestraser un virus recombinante de circulación (CRF02_AG) por ViroSeq. Las tres muestras que amplificaron con ambas metodologías eran del subtipo B (dos muestras) y el subtipo A (una muestra). <img alt="La figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figura 5. El uso de un Vecino Participar árbol HKY hecho como parte de la garantía de calidad de secuencias. Hay cuatro pares / grupos de secuencia con las distancias genéticas muy cortos. La distancia genética entre RES655 y RES655_1 (mismas muestras en secuencia en diferentes días) es 0,003. El es un posible error con el par RES637_1/RES638 como su distancia genética es demasiado corto (0.075) para muestras de diferentes individuos no vinculadas epidemiológicamente. Hay otro RES637 en el árbol con una distancia de 0,075 cuando se compara con RES638_1. El clúster CQ01/CQ02 sugiere que las dos muestrasdesde el panel son duplicados de la misma muestra. Se agrupan junto con la secuencia de referencia subtipo B que confirma el subtipo asignado por la herramienta REGA Subtipificación. CQ05 y CQ04 agrupan con los subtipos A y G, respectivamente, mientras que la herramienta de subtipificación REGA los clasificó como A y CRF02_AG respectivamente. Otra herramienta útil para los subtipos y la recombinación del VIH es SCUEL, que está disponible en http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> Se utilizó un panel de cinco muestras para evaluar la precisión del método en-casa. Diez genotipos replicados se generaron para cada una de las cinco muestras. Usando el analizador genético 16 Capilar 3130xl, 48 de los 50 genotipos fueron generados a partir de las 24 carreras, preparados en el mismo día. Para todas las cinco muestras, las secuencias de aminoácidos predichas fueron 100% concordantes entre repeticiones. Para la secuencias de ácido nucleico, THere era&gt; 99% de similitud por pares. Durante los dos primeros años de la utilización de este método, sesenta muestras se repiten al azar de la extracción de RNA a secuenciación. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre la puntuación de calidad de secuencia y el número de bases mixtas entre las repeticiones. Tanto el de nucleótidos y de aminoácidos comparaciones por pares para las sesenta pares fueron mayores que 99% idéntica. Por lo tanto las mutaciones de resistencia a fármacos para todos los pares fueron 100% concordantes. Reducción de costes Los volúmenes de reacción para RT, PCR y secuenciación se redujeron en al menos la mitad, en relación con el método original 20, 32, sin comprometer la calidad de las secuencias generadas. Esto permitió una reducción en el costo de 50% para las etapas de RT y PCR. El nuevo método fue diseñado originalmente para trabajar con seis cebador de secuenciación para secuenciar<html> todos los 99 codones del gen de la proteasa y los primeros 300 codones del gen de la transcriptasa inversa 20, 32. Métodos similares también utilizan seis a ocho cebadores 33, 34. Algunos métodos recientemente publicados han utilizado menos de seis cebadores, aunque a veces la secuenciación de la proteasa y los genes RT seprately 35, 36. Hemos tratado de reducir el número de cebadores de secuenciación de seis a cuatro, (Figura 6) <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figura 6. Comparación de secuencias contiguas de seis vs cuatro cebadores de secuenciación para la generación de la secuencia de Pol 1197 pb que cubre todos los 99 VIH-1 codones de la proteasa y los primeros 300 codones del gen de la transcriptasa inversa.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. Secuencias de un conjunto de 17 muestras generadas a partir de seis cebadores se compararon con las secuencias generadas después de la exclusión de dos cebadores (MAW46 y RTY). Los subtipos fueron 14 el subtipo C, dos subtipo B, y un subtipo A. No hubo diferencias significativas en las puntuaciones de calidad de secuencias. Una vez más, la identidad promedio pairwise entre los 17 pares de ácido nucleico fue de 99% y 100% en el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, la reducción de los cebadores de secuenciación de seis a cuatro resultó en una reducción en el costo de secuenciación en casi un tercio. La única herramienta de software propio que se utiliza en este protocolo fue Geneious para la secuencia de montaje. Las herramientas de interpretación resistencia a los medicamentos, así como el informe de la generación de herramientas son todo, herramientas de acceso abierto y gratuito. Esto reduce el coste aún más mediante la eliminación de los costos asociados con el uso de software propietario. Además, collective la negociación permitió a los reactivos para este protocolo para ser empaquetados en un estuche para facilitar el acceso de Life Technologies y está disponible como las Tecnologías de Saturno / Life método de genotipificación de 37. Por otra parte, los miembros de Saturno puede acceder a los reactivos a un precio con descuento. Ámbito clínico El protocolo descrito ha sido implementado en el control y la vigilancia de la resistencia a las drogas en una comunidad rural de KwaZulu-Natal. Un total de 604 genotipos fueron generados a partir de muestras clínicas, entre diciembre de 2010 y mayo de 2013, a una tasa de amplificación de 95% para las muestras con una carga viral&gt; 1000 ARN copias / ml. Este estudio clínico de resistencia del VIH fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación Biomédica de la Universidad de KwaZulu-Natal (BF052/10 ref.) y el Comité de Investigación de la Salud del Departamento de Salud de KwaZulu-Natal (ref. HRKM 176/10). Los informes individuales de los pacientes fueron generados y enviados de vuelta a las clínicaspara el manejo del paciente. Setenta y dos (72) genotipos también fueron generados como parte de un estudio de vigilancia de la resistencia a los medicamentos de transmisión, anidan dentro de un amplio estudio de vigilancia del VIH de base poblacional prospectivo. Las muestras primarias fueron toda pinchazo sangre recogida en microtubos EDTA. En genotipado hubo una tasa de amplificación de 79% 19. Ética aprobación para el genotipado de las muestras del estudio de vigilancia se obtuvo de la Universidad de Comité de Ética de la Investigación Biomédica de KwaZulu-Natal (BE066107 ref.). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nombre Primer </td><td> Secuencia </td><td> Longitud </td><td> Dirección </td><td> Posición HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Adelante </td><td> 2028-2050 </td><td> Primera ronda de PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Reverse </td><td> 3539-3509 </td><td> Primera ronda de PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Adelante </td><td> 2147-2166 </td><td> Segunda ronda de PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 3462-3441 </td><td> Segunda ronda de PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Adelante </td><td> 2486-2508 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Reverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Adelante </td><td> 2956-2994 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Reverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> RT-Y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Reverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Secuenciación </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Adelante </td><td> 2251-2277 </td><td> Secuenciación </td></tr></tbody></table> Tabla 1. La transcripción, PCR, y cebadores de secuenciación personalizados utilizados en la generación de un fragmento de 1197 pb Pol cubriendo todos los 99 VIH-1 codones de la proteasa y los primeros 300 codones del gen trascriptase inversa inversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2. dNTP / Primer mezcla para la reacción de transcripción inversa. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (ml) / reacción </td><td> Concentración / reacción </td></tr><tr><td> Primera Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Superíndice III transcriptasa inversa (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Mezcla de enzimas para la reacción de transcripción inversa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (ml) / reacción </td><td> Concentración final / Reacción </td></tr><tr><td> DEPC agua tratada </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tampón de PCR (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> mezcla de dNTP (10 mM) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Cebador Froward (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Cebador inverso (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq polimerasa (5 U / ml) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> Total parcial </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Master mezcla para la PCR anidada. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (ml) / reacción </td><td> Concentración / reacción </td></tr><tr><td> DEPC agua tratada </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Secuenciación de búfer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> Grandes terminador mezcla de secuenciación del tinte </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Total </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 5. Mezcla maestra para las reacciones de secuenciación. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> ViroSeq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA Similitud </td></tr><tr><td> ID de la muestra </td><td> Subtipo </td><td> El nivel de calidad </td><td> PR mutaciones </td><td> Mutaciones en RT </td><td> Subtipo </td><td> El nivel de calidad </td><td> Mutaciones PR </td><td> RT mutaciones </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> La </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> La </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Resul comparativots de un análisis paralelo entre el método de genotipificación ViroSeq y el método de la casa usando un panel de muestras proporcionada por la ANRS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

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Un método de monitoreo asequible VIH-1 Resistencia a los medicamentos para los entornos con recursos limitados

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