Name: an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings
Uploaded: 2014-03-30T14:00:00
Duration: 19 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

Författarna vill tacka alla kolleger som gjort detta arbete möjligt, speciellt Maya Balamane, Elizabeth Johnston Vit, Sharon Sjöblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, och Lungani Ndwandwe. Författarna vill också tacka all personal på Institutionen för hälsa och Afrika Centre personal som arbetar i Hlabisa HIV Behandling och Omvårdnadsprogrammet.

<ol>
	<li>Shao, Y., Williamson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+epidemic:+low-+to+middle-income+countries.">The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries.</a> Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).</li><li>Mutevedzi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+a+decentralized+HIV+treatment+programme+in+rural+KwaZulu-Natal,+South+Africa:+does+rapid+expansion+affect+patient+outcomes.">Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes.</a> Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).</li><li>Houlihan, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohort+profile:+Hlabisa+HIV+treatment+and+care+programme.">Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).</li><li>Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+coverage+of+ART+associated+with+decline+in+risk+of+HIV+acquisition+in+rural+KwaZulu-Natal.">High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal.</a> South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).</li><li>Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increases+in+adult+life+expectancy+in+rural+South+Africa:+valuing+the+scale-up+of+HIV+treatment.">Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment.</a> Science. 339, 961-965 (2013).</li><li>Montaner, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+expanding+access+to+highly+active+antiretroviral+therapy+to+curb+the+growth+of+the+HIV+epidemic.">The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic.</a> Lancet. 368, 531-536 (2006).</li><li>Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+voluntary+HIV+testing+with+immediate+antiretroviral+therapy+as+a+strategy+for+elimination+of+HIV+transmission:+a+mathematical+model.">Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model.</a> Lancet. 373, 48-57 (2009).</li><li>Johnson, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+expectancies+of+South+african+adults+starting+antiretroviral+treatment:+collaborative+analysis+of+cohort+studies.">Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies.</a> PLoS Med. 10, (2013).</li><li>Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+impact+of+antiretrovirals+in+resource-poor+settings:+preventing+HIV+infections+whilst+controlling+drug+resistance.">Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).</li><li>Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+antiretroviral+drug+resistance+in+drug-naive+persons.">Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).</li><li>Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+with+reduced+sensitivity+to+zidovudine+(AZT)+isolated+during+prolonged+therapy.">HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy.</a> Science. 243, 1731-1734 (1989).</li><li>Erice, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+primary+infection+with+zidovudine-resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1.</a> N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).</li><li>Williams, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=British+HIV+Association+guidelines+for+the+treatment+of+HIV-1-positive+adults+with+antiretroviral+therapy.">British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy.</a> HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).</li><li>Vandamme, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+recommendations+for+the+clinical+use+of+HIV+drug+resistance+testing:+2011+update.">European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update.</a> AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Department+of+Health.">Department of Health.</a> Clinical guidelines for the management of HIV &amp; AIDS in adults and adolescents. , (2010).</li><li>Conradie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2012+southern+African+ARV+drug+resistance+testing+guidelines.">The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines.</a> S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).</li><li>Manasa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Drug+Resistance+in+South+Africa:+Data+from+10+Years+of+Surveys.">Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).</li><li>Tshabalala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+transmitted+antiretroviral+drug+resistance+among+HIV-1+infected+women+attending+antenatal+clinics+in+Chitungwiza,+Zimbabwe.">Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug+resistance+surveillance+among+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+individuals+in+Angola:+evidence+for+low+level+of+transmitted+drug+resistance.">Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+genetic+diversity+and+transmitted+drug+resistance+in+health+care+settings+in+Maputo,+Mozambique.">HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+drug+resistance+in+antiretroviral-naive+individuals+in+sub-Saharan+Africa+after+rollout+of+antiretroviral+therapy:+a+multicentre+observational+study.">HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study.</a> Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Drug+Resistance+Mutations+Are+Present+in+Six+Percent+of+Persons+Initiating+Antiretroviral+Therapy+in+Lusaka,+Zambia.">HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).</li><li>Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+transmitted+genetic+drug+resistance+in+a+cohort+of+HIV+infected+naive+patients+entering+antiretroviral+treatment+programs+at+two+sites+in+northern+South+Africa.">Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa.</a> J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).</li><li>Iweriebor, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+HIV+in+two+highly+endemic+areas+of+northeastern+South+Africa.">Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa.</a> Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).</li><li>Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiretroviral+drugs+in+newly+diagnosed,+young+treatment-naive+HIV-positive+pregnant+women+in+the+province+of+KwaZulu-Natal+South+Africa.">Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa.</a> J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).</li><li>Nwobegahay, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+antiretroviral+drug+resistance+mutations+and+HIV-I+subtypes+among+newly-diagnosed+drug-naive+persons+visiting+a+voluntary+testing+and+counselling+centre+in+northeastern+South+Africa.">Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa.</a> J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).</li><li>Nwobegahay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+drug-resistant+mutations+in+newly+diagnosed+drug-naive+HIV-1-infected+individuals+in+a+treatment+site+in+the+waterberg+district,+limpopo+province).">Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province).</a> S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).</li><li>Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+net+cost+of+incorporating+resistance+testing+into+HIV/AIDS+treatment+in+South+Africa:+a+Markov+model+with+primary+data.">The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data.</a> J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).</li><li>Dalai, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+molecular+epidemiology+of+subtype+C+HIV-1+in+Zimbabwe.">Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe.</a> AIDS. 23, 2523-2532 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+human+immunodeficiency+virus-1+genotype+resistance+testing+to+determine+highly+active+antiretroviral+therapy+resistance+mutations+in+Hong+Kong.">In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong.</a> Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).</li><li>Lee, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-house+HIV+genotyping+assay+for+the+detection+of+drug+resistance+mutations+in+Southeast+Asian+patients+infected+with+HIV-1.">An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1.</a> J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).</li><li>Aitken, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pragmatic+Approach+to+HIV-1+Drug+Resistance+Determination+in+Resource-Limited+Settings+by+Use+of+a+Novel+Genotyping+Assay+Targeting+the+Reverse+Transcriptase-Encoding+Region+Only.">A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only.</a> J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+low+cost+and+broadly+sensitive+genotyping+assay+for+HIV-1+drug+resistance+surveillance+and+monitoring+in+resource-limited+settings.">Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Technologies.">Life Technologies.</a> Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , (2012).</li><li>Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+HIV-1+diversity+in+Africa:+a+decade+in+review.">Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review.</a> AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).</li></ol>

<div> Detta arbete stöddes av Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Europeiska unionen (SANTE 2007 147-790), den amerikanska centret för sjukdomar Styr via CAPRISA (projekttitel: Health Systems Förstärkning och HIV behandlingssvikt (HIV- TFC)), och Schweiziska sydafrikanska gemensamma forskningsprogrammet (SSJRP) forskningsbidrag med titeln &quot;Swiss Prot / Sydafrika: Protein Bioinformatics Resource Development för viktiga Hälsorelaterade patogener&quot;. RL stöds av Wellcome Trust (licensnummer 090.999 / Z / 09 / Z). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen. </div>

Flera lågprisbolag interna metoder har beskrivits i arbetet med att försöka göra HIV-drogmotstånd genotypning billigare 33, 34, 36. Det råder ingen tvekan om behovet av att integrera resistens testning i vårdkedjan för individer på antiretroviral behandling i resursfattiga områden. Men de flesta av de rapporterade metoderna fokuserar på tillämpningen av läkemedelsresistens genotypning i övervakningen av läkemedelsresistens hos en befolkningsnivå. Saturn / Life Technologies genotypning metod är en helt integrerad protokoll för kontroll och övervakning av läkemedelsresistens. Denna metod var avsedd att vara ett prisvärt protokoll genomföra mestadels öppen källkod och öppna resurser åtkomst bioinformatik för tolkning av läkemedelsresistens och generering av rapporter för klinisk behandling. Det visades genom jämförelse med FDA godkända Viroseq genotypning metod för att varakorrekt identifiera drogresistensmutationer från en panel av ANRS kvalifikationsprövning prover, i 100% av laboratoriepanelprover som framgångsrikt förstärks. Noggrannheten bedömdes också på kliniska prover av subtyp C-virus, den mest dominerande subtypen i södra Afrika. Metoden var så exakt på subtyp C-prov som det var på subtyp A och B. Men om metoden skulle kunna användas i andra delar av världen där CRF02_AG är utbredd, finns det ett behov av ändring av primers eftersom metoden misslyckades med att förstärka en av panelprover som visade sig ha CRF02_AG. Alternativt kan en degenererad uppsättning av primrar som är känsliga för alla grupp M virus 33, 36 skulle kunna användas i regioner där subtyp fördelningen är mer heterogen 38. Känsligheten av omvänd transkription och PCR kan ökas genom att man extraherar RNA från större volymer av plasma, t.ex. 500 ml. Plasmat kan centrifuged vid 21.000 xg under 90 minuter för att koncentrera viruspartiklarna innan du fortsätter med det protokoll som beskrivs av QIAamp viralt RNA extraktion mini kit. Såsom visas har det nya förfarandet en ytterligare fördel att den producerar omfattande rapporter för individuell behandling av patienten. Dessa rapporter är en konsolidering av genotyp, immunologiska och virologiska övervakningsuppgifter samt klinisk och behandlingshistorik från RegaDB. Detta åtföljs av en detaljerad laboratorie tolkning av resistensprofil följt av en lika detaljerad genomgång av patientens kliniska historia samt behandlingsrekommendationer. Användningen av en specialistläkare för att granska rapporterna och ger behandlingsrekommendationer för patienterna ger den välbehövliga mentorskap för sjuksköterskor såväl som oerfarna kliniker, som allt oftare tillhandahåller ART i Sydafrika som en del av WHO: s rekommendationer för uppgiften växling. Dessa kliniskarapporter har visat sig vara effektiva läromedel för kliniker med liten eller ingen erfarenhet av drogresistenshantering. Ur ett patientperspektiv, minskar vår metod behovet av att resa till centraliserade webbplatser för att få tillgång till specialist hiv-tjänster. Således, den beskrivna protokollet som helhet ger en bra plattform, där HIV-läkemedelsresistens hantering kan integreras, till en rimlig kostnad, i vårdkedjan för HIV-infekterade individer misslyckas ART. De data som genereras kan användas för epidemiologiska syften att bedöma utvecklingen och överföring av resistens i samhället. Storleken på pol fragment genereras är bra nog för mer komplexa fylogenetisk analys som kommer att producera bättre förståelse av epidemin på befolkningsnivå.

Hiv-epidemin i södra Afrika har snabbt 1 utvecklas med en samtidig exponentiell ökning av individer på antiretroviral behandling (ART), särskilt i Sydafrika 2, 3. Som bevis på den epidemiologiska effekterna av storskaliga behandlingsprogram för att minska förekomsten 4 och ökad förväntad livslängd i resursfattiga områden (RLS) 5 fortsätter att ackumuleras, kommer insatser för att öka ART täckning intensifieras. Utvecklingen av riktlinjer mot användningen av behandling som ett förebyggande verktyg 6, 7 under testet och behandla program innebär att det absoluta antalet individer på behandling kommer att öka ytterligare. Ett stort antal personer kommer att vara på ART för längre perioder som den genomsnittliga livslängden för individer på ART närmar sig den för HIV oinfekterade befolkningen 8. Utveckling och överföring av HIV resistens har Always ansetts vara ett hot mot resultaten av ART 9-12. Det finns således ett behov av mer rigorös kontroll och övervakning av läkemedelsresistens som fler individer initieras på ART. Genotypisk resistens testar (BRT) har använts med framgång i utvecklade länder, både för övervakning och uppföljning av HIV-1 resistens hos personer som får ART. I dessa inställningar har BRT integrerats i vårdkedjan för HIV-1-infekterade individer. De flesta internationella riktlinjer rekommenderar BRT för vuxen eller barn misslyckas ART (första linjens och andra linjens) 13-15, barn som utsätts för förebyggande av mor-till barn (PMTCT) regimer men därefter smittade 16, och i miljöer med höga halter av överförd resistens hos akut infekterade individer 13-15. Däremot har kostnads, teknik och infrastruktur krav begränsat genomföranförandet av liknande metoder för läkemedelsresistens övervakning i RLS. Den sydafrikanska HIV-behandling och övervakningsriktlinjer för närvarande inte rekommendera användning av BRT i att vägleda val av ART för individer misslyckas första linjens regimer 17. Individer kopplas främst baserad på virologiska (HIV-1-RNA virusmängd) parametrar. Men under 2012, Södra Afrikas HIV Clinicians Society publicerade de första sydliga riktlinjer Afrikanska ARV resistens testning 18. Riktlinjerna rekommenderar GRT testning för alla vuxna missar första linjens och andra linjens ART och för infekterade spädbarn och barn som utsätts för PMTCT 18. Dock är BRT rekommenderas inte 18 för akut infekterade individer eftersom det inte finns några aktuella bevis för höga nivåer av överförd resistens i södra Afrika 19-29. Det förväntas att en del av dessa rekommendationer kommer att integreras med tiden i den nationella Treatment och övervaknings riktlinjer i de olika länderna i regionen. Redan på 2013 sydafrikanska behandlingsriktlinjer finns det nu rekommendation av BRT vid andra linjens misslyckande för vuxna och vid första eller andra linjens PI-baserad behandling misslyckande för barn 30. Det har visat sig att införliva BRT i behandlingsriktlinjer i Sydafrika skulle vara potentiellt kostnadsneutralt. Med tanke på kostnaden för den andra linjens behandling läkemedel som är relativt dyrare än första linjens läkemedel, med hjälp av BRT för att identifiera patienter som verkligen behöver byta till andra linjens behandling kommer inte att leda någon extra kostnad för programmet. Dessutom kan BRT också identifiera andra orsaker till misslyckanden, spara behandlingsalternativ och generera information om nya resistensmönster 31. Därför är det nödvändigt att minska kostnaderna för läkemedelsresistens övervakningsmetoder ytterligare i syfte att förbättra tillgängligheten, kvaliteten på vården end utfall. Här presenterar vi ett BRT metod som syftar till att använda generiska (öppen källkod) primer för omvänd transkription, polymeraskedjereaktion (PCR) och sekvensering (tabell 1), samt mestadels öppen källkod för drogmotstånd tolkning. För klinisk behandling, är det protokoll som kompletteras av en omfattande översyn och rapporteringsmetod med specialist tolkning av laboratorie resistens rapport med nära anslutning till de nationella behandlingsriktlinjer. Protokollet är indelat i fyra olika delar, 1) HIV ribonukleinsyra (RNA) Utvinning, 2) Omvänd transkription och Polymerase Chain Reaction (PCR) av virala mål, 3) Sekvense och 4) bioinformatiska metoder för analys av kromatogram, anpassning, säkring och tolkning av sekvensdata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 resistens har potential att allvarligt äventyra effektiviteten och effekten av antiretroviral terapi (ART). Som ART-program i Afrika söder om Sahara fortsätter att expandera, bör individer på ART övervakas noga för uppkomsten av läkemedelsresistens. Övervakning av de överförda läkemedelsresistens för att spåra överföringen av virala stammar som redan är resistenta mot ART är också kritisk. Tyvärr är drogresistensbestämning fortfarande inte lätt tillgängliga i resurs begränsade inställningar, eftersom genotypning är dyr och kräver avancerad laboratorie-och datahantering infrastruktur. En öppen tillgång genotypisk läkemedelsresistens övervakningsmetod för att hantera individer och bedöma överföras resistens beskrivs. Metoden använder fri programvara med öppen källkod för tolkning av drogresistensmönster och generering av enstaka patientrapporter. The genotyping protokollet har en förstärkningshastighet som överstiger 95% för plasmaprover med AViral belastning&gt; 1000 HIV-1 RNA kopior / ml. Känsligheten minskar avsevärt för virusnivåer &lt;1,000 HIV-1 RNA kopior / ml. Den metod som beskrivs här validerades mot en metod för HIV-1 resistens provning godkänt av den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotypning metoden. Begränsningar av den metod som beskrivs här hör att det inte är automatiserad och att det inte heller förstärka cirkulerande rekombinanta formen CRF02_AG från en valideringspanel av prover, även om den förstärkta subtyper A och B från samma panel.

Den validerade metoden var en modifiering av en tidigare rapporterad metod 20. Den Viroseq genotypning metod, som har godkänts av FDA, användes som referensmetod i valideringen. En panel av kvalifikationsprövning prover från de franska nationella kontoren för forskning om aids och viral hepatit (ANRS) användes i den primära jämförelsen mellan de två metoderna. De två genotypning metoder var 100% samstämmiga i att identifiera alla kliniskt viktiga läkemedelsresistensassocierade mutationer som tolkas av HIVDB program för proverna som framgångsrikt förstärks av båda metoderna. Såsom visas i tabell 6, nukleotid-sekvenserna för de tre paren var 99,5% identiska. De förutsagda aminosyrasekvenserna var 100% identisk. Ett urval av fem kunde inte med framgång förstärks av Viroseq. Förutom provet inte amplifieras genom Viroseq underlät intern metod för att amplifiera ett andra prov som visadesvara en cirkulerande rekombinanta viruset (CRF02_AG) genom Viroseq. De tre prov som förstärkta med båda metoderna var subtyp B (två prov) och subtyp A (ett prov). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figur 5. Användning av en HKY granne Sammanfogning träd göras som en del av sekvens kvalitetssäkring. Det finns fyra par / grupper av sekvens med mycket korta genetiska avstånden. Den genetiska avståndet mellan RES655 och RES655_1 (samma prover sekvens på olika dagar) är 0,003. Det är ett potentiellt fel med RES637_1/RES638 paret som deras genetiska avståndet är för kort (0,075) för prover från olika epidemiologiskt olänkade individer. Det finns en annan RES637 på trädet med ett avstånd på 0,075 vid jämförelse med RES638_1. Den CQ01/CQ02 kluster tyder på att de två provernafrån panelen är dubbletter av samma prov. De kluster tillsammans med subtyp B referenssekvensen bekräftar subtyp tilldelats av REGA Subtyp verktyget. CQ05 och CQ04 klustrade med subtyper A och G respektive, medan REGA subtypverktyget klassificerat dem som A och CRF02_AG respektive. Ett annat användbart verktyg för HIV subtyping och rekombination är SCUEL, som finns tillgänglig på http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> En panel av fem prover användes för att fastställa precisionen hos den interna metoden. Tio upprepade genotyper genererades för vardera av de fem proverna. Med hjälp av 16 Kapillär 3130xl genetisk analysator, 48 av de 50 genotyper genererades från 24 körningar, beredd på samma dag. För alla fem proverna, de förutsagda aminosyrasekvenserna var 100% överensstämmande bland replikat. För nukleinsyrasekvenser, there var&gt; 99% parvisa likhet. Under de två första åren av användning av denna metod, har sextio prover upprepas slumpmässigt från RNA-extraktion till sekvensering. Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader mellan sekvensen kvalitetsresultat och antalet blandade baser mellan replikaten. Både nukleotid-och aminosyra parvisa jämförelser för de sextio paren var större än 99% identiska. Således drog resistensmutationer för alla par var 100% samstämmiga. Kostnadsminskning De reaktionsvolymer för RT-PCR och sekvensering har reducerats med åtminstone hälften, jämfört med den ursprungliga metoden 20, 32, utan att kompromissa med kvaliteten på de sekvenser som genereras. Detta möjliggjorde en minskning av kostnaden för 50% för RT-och PCR-stegen. Den nya metoden var ursprungligen utformad för att fungera med sex sekvenseringsprimer till sekvens<html> alla 99 kodonen av proteasgenen och de första 300 kodonen av omvänt transkriptas-genen 20, 32. Liknande metoder använder också sex till åtta primers 33, 34. Några nyligen publicerade metoder har använt mindre än sex grundfärger, även om det ibland sekvensering av proteas-och RT-gener seprately 35, 36. Vi sökte att minska antalet sekvenseringsprimrar från sex till fyra, (figur 6) <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figur 6. Jämförelse av kontinuerliga sekvenser från sex vs fyra sekvenseringsprimrar för generering av det 1197 bp stora pol-sekvens som omfattar alla 99 HIV-1-proteas-kodon och de första 300 kodonen av omvänt transkriptas-genen.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. Sekvenser från en uppsättning av 17 prover genererade från sex primrar jämfördes med sekvenserna som genereras efter uteslutning av två primers (MAW46 och if). De subtyper var 14 undertyp C, två subtyp B, och en subtyp A. Det fanns inga signifikanta skillnader i sekvens kvalitetsresultat. Återigen, den genomsnittliga parvisa identiteten mellan de 17 paren av nukleinsyra var 99% respektive 100% på aminosyranivå. Sålunda minskar sekvenseringsprimrar från sex till fyra resulterade i en minskning av den sekvense kostnaden med nästan en tredjedel. Den enda egenutvecklade programvara verktyg som används i detta protokoll var Geneious för sekvens montering. De läkemedelsresistens tolkningsverktyg, samt rapporten genererar verktyg är alla fria och öppna tillgång till verktyg. Detta minskar kostnaderna ytterligare genom eliminering av de kostnader som är förknippade med användningen av proprietär programvara. Vidare Kollektive förhandlingar tillät reagenserna för detta protokoll för att paketeras in i en sats för enkel åtkomst från Life Technologies och finns som Saturn / Life Technologies genotypning metod 37. Dessutom kan Saturnus medlemmar tillgång reagenserna till ett rabatterat pris. Klinisk miljö Den beskrivna protokollet har genomförts i kontroll och övervakning av läkemedelsresistens i en landsbygd i KwaZulu-Natal. Sammanlagt 604 genotyper genererades från kliniska prover mellan december 2010 och maj 2013 vid en förstärkning på 95% för prov med virusnivåer&gt; 1,000 RNA kopior / ml. Denna kliniska HIV-drogmotstånd studien godkändes av biomedicinsk forskningsetiska kommittén vid University of KwaZulu-Natal (ref. BF052/10) och Kommittén för hälsoforskning i KwaZulu-Natal Department of Health (ref. HRKM 176/10). Genererades och skickades tillbaka till klinikerna Individuella patientrapporterför behandling av patienten. Sjuttio två (72) genotyper också genereras som en del av en övervakning av överförd resistens studie, kapslade i en stor prospektiv populationsbaserad hiv-övervakning studie. Delprov var nålstick helblod i EDTA mikrorör. Vid genotypning fanns en förstärkningsnivå på 79% 19. Etiskt godkännande för genotypning av prover från övervaknings studien erhölls från University of KwaZulu-Natal biomedicinsk forskningsetiska kommittén (ref. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Namn </td><td> Sekvens </td><td> Längd </td><td> Riktning </td><td> HXB2 Position </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Framåt </td><td> 2028-2050 </td><td> 1: a omgången PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Omvänd </td><td> 3539-3509 </td><td> 1: a omgången PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> 20 </td><td> Framåt </td><td> 2147-2166 </td><td> 2: a omgången PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Omvänd </td><td> 3462-3441 </td><td> 2: a omgången PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Framåt </td><td> 2486-2508 </td><td> Sekvensering </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Omvänd </td><td> 2630-2604 </td><td> Sekvensering </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Framåt </td><td> 2956-2994 </td><td> Sekvensering </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Omvänd </td><td> 3129-3101 </td><td> Sekvensering </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Omvänd </td><td> 2967-2946 </td><td> Sekvensering </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Framåt </td><td> 2251-2277 </td><td> Sekvensering </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Omvänd transkription, PCR och sekvense anpassade primrar som används vid genereringen av en 1197 bp-pol-fragmentet som täcker alla 99 HIV-1-proteas-kodon och de första 300 kodonen av den omvända trascriptase genen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 2. dNTP / Primer mix för den omvända transkriptionsreaktionen. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volym (ml) / reaktion </td><td> Koncentration / reaktion </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Upphöjd III omvänt transkriptas (200U/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Enzymblandning för den omvända transkriptionsreaktionen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volym (ml) / reaktion </td><td> Slutlig koncentration / Reaktion </td></tr><tr><td> DEPC-behandlat vatten </td><td> 18,4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR-buffert (10x) </td><td> 2,5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTP-blandning (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Överförts primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Omvänd primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq-polymeras (5 U / ml) </td><td> 0,1 </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Delsumma </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Master Mix för kapslade PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volym (ml) / reaktion </td><td> Koncentration / reaktion </td></tr><tr><td> DEPC-behandlat vatten </td><td> 6,1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequencing Buffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> Big Dye terminatorsekvense mix </td><td> 0,4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 5. Master Mix för sekvenseringsreaktioner. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % NA Likhet </td></tr><tr><td> Prov-ID </td><td> Subtype </td><td> Kvalitetsresultat </td><td> PR Mutationer </td><td> RT-mutationer </td><td> Subtype </td><td> Kvalitetsresultat </td><td> PR-mutationer </td><td> RT Mutationer </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99,9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98,4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> ETT </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> ETT </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabell 6. Jämförande Results från en parallell analys mellan Viroseq genotypning metod och den interna metoden med användning av en panel av prover som tillhandahålls av ANRS.

Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Motstånd Drogtester för HIV-1 infekterade individer misslyckas antiretroviral terapi (ART) kan vägleda framtida terapier och förbättra behandlingsutfallet. Optimera individuella och befolkningshälsoresultat i hög hiv-prevalens men resursfattiga områden i slutändan kommer att kräva överkomliga och tillgängliga läkemedelsresistens genotypning och metoder för tolkning.

En prisvärd HIV-1 Drug Resistance Monitoring Metod för Resurs Limited inställningar

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Metod för Novel läkemedel mot cancer utveckling med hjälp av tumör explants av kirurgiska preparat


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

En Orthotopic Murina Model of Human Prostate cancer metastaser

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Tekniker för Processing Eyes Inopererade med en retinal Protes för lokaliserad Histopatologisk analys: Del 2 Epiretinal Implantat med Retinala Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapslings Thermogenic preadipocyter för transplantation till fettvävnad Depåer

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Genomförande av<em&gt; In Vitro</em&gt; Läkemedelsresistens Analyser: maximera potentialen för att avslöja kliniskt relevant resistensmekanismer

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

En förbättrad metod för Rapid Intubation av luftstrupen hos möss

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

En ny metod för administration av läkemedel och vätskor i nödsituationer och inställningar

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Infusion av bukspottskörteln: En effektiv och selektiv metod för läkemedels- och virusleverans

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimerad LC-MS/MS metod för High-throughput analys av kliniska prover av ivakaftor, dess huvudmetaboliter och lumakaftor i biologiska vätskor av cystisk fibros patienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...