Name: generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

PLP er en Associate investigator i Sanford Børns Health Research Center. Dette arbejde er blevet støttet af følgende tilskud til PLP: R01AR056712, R01AR052779 og P30 AR061303 fra National Institute of Health / National Institute of Arthritis og bevægeapparatet og hudsygdomme (NIAMS), MDA og Sanford Børn Health Research Award. Dette arbejde er delvist modtaget forskningsmidler fra Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram i projektet FP7-Health - 2009 ENDOSTEM 241.440 (Aktivering af vaskulatur tilhørende stamceller og muskel stamceller til reparation og vedligeholdelse af muskelvæv) SA blev støttet af. CIRM fællesskab.

1.. Infektion af hESCs Denne protokol kræver højtiter lentivira kodning BAF60C og MyoD 13. Disse konstruktioner er tilgængelige efter anmodning. <ol><li> Anbefalinger før start <ol><li> For at sikre en høj effektivitet af infektion, varmeplader hESCs for infektion feeder-fri betingelser (figur 2A) for at fjerne cellulære konkurrenterne i den virale udbredelse. Faktisk MEF er notorisk lettere at inficere forhold til hESCs og er kompetente til MyoD-medieret konvertering. Således eliminerer MEF&#39;er fra hESC kulturer øger infektion sats. </li><li> Det anbefales at have høj titer lentivira at sikre høj effektivitet for infektion. Muligheder for at forbedre effektiviteten af infektion er omtalt i afsnittet &quot;kontrol infektion&quot;. </li><li> Forbered Matrigelcoatede plader ved tilsætning af 1 ml af 1 mg / ml Matrigel i hver brønd, og efterlade mindst 1 time ved stuetemperatur (eller O / N forseglet ved 4 ° Chvis de tilberedes dagen før). </li></ol></li><li> Infektion procedure <ol><li> Dag før infektionen <ol><li> Tilføj hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement i mediet ved 1.000 X fortynding (2 mM slutkoncentration). </li></ol></li><li> Dag 0 - Infektion med BAF60C Bemærk: Udfør infektion af hESCs med BAF60C først efterfulgt af infektion med MyoD. <ol><li> Adskille en brønd af en 6-brønds plade af hESCs dyrkes som kolonier 14 i en enkelt-cellesuspension ved inkubation med 1 ml TrypLE i 5 minutter ved 37 ° C. </li><li> Overfør suspensionen til et 15 ml rør, der tilsættes 9 ml embryonale medium og centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 rpm. </li><li> Under centrifugering forberede infektionen mix i et rent glas ved tilsætning til 1 ml mTeSR1, polybren (6 mg / ml) og hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement (2 mM). </li><li> Re-suspendere cellepelleten (ca. 5 x 10 5 -1 x 10 6 celler fra en confluent godt af hESCs) med 1 ml infektion mix og pladen ned på en 6-godt lav tilknytning plade, som forhindrer cellerne i at klæbe til plasten. </li><li> Tilføj BAF60C-IRES-GFP-virus i 10 8 MOI og inkuberes i 3 timer i inkubatoren </li><li> Saml cellesuspensionen indeholdende virus og deler ligeligt i to Matrigelcoatede brønde. Derefter tilsættes 2 ml mTeSR1 + hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement til hver brønd og lade O / N i inkubatoren. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Fjern forsigtigt mediet indeholdende virus og erstatte med 2 ml mTeSR1and hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. Celler vil begynde sammenklumpning som vist i figur 2B. </li></ol></li><li> Day2 - Infektion med MyoD <ol><li> Før du fortsætter kontrollere fluorescens status af cellerne under et fluorescens mikroskop for at sørge for at have en høj effektivitet for infektion. Hvis ikke, se afsnittet &quot;kontrol inficereion &quot;. </li><li> Hvis cellerne har nået mindst 80% af sammenløb, fortsæt som følger; ellers vente en ekstra dag forud for proceduren. </li><li> Fjern mediet og tilsæt 1 ml TrypLE reagens, der ikke kobler cellerne. Inkuber 5 min ved 37 ° C. </li><li> Gentag som beskrevet from1.2.2.2 - 1.2.2.6 tilføjer MyoD virus i 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Fjern forsigtigt mediet indeholdende virus og erstatte med 2 ml mTeSR1and hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. </li><li> Plate MEF på matrigel coatede plader på 2,5 x 10 5 / cm 2 for den næste dag at tillade formering af de inficerede celler. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Fjern mediet og tilsæt 1 ml TrypLE reagens, der ikke kobler cellerne. Inkuber 5 min ved 37 ° C. </li><li> Overfør cellerne i et 15 ml Falcon-rør, der tilsættes 9 ml embryonale medium og centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 rpm. </li><li> ReFlyt supernatanten og re-suspendere i 6 ml embryonale medium. </li><li> Fjern mediet fra MEF-holdige 6-brønds plade og plade hESCs 1:2 delingsforholdet, udlevering 3 ml for hver MEF&#39;er indeholdende godt. TIP! Når kolonierne nå sammenløb kan nogle af brøndene i MyoD/BAF60C-infected celler fryses i flydende nitrogen som en reserve lager. Frysning medium omfatter 90% af KOSR og 10% DMSO plus 2 mM hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. De resterende brønde kan derefter udsat for differentiering protokol - se nedenfor for beskrivelse. Hvis flere celler er nødvendige for at producere flere myospheres kan inficerede hESCs opformeres yderligere som følger: </li><li> Fjern mediet og inkuberes med 1 ml af 1 mg / ml collagenase IV i 5 minutter ved 37 ° C. </li><li> Fjern collagenase IV og tilsættes 1 ml af embryonale medium. </li><li> Under en dissektion mikroskop skrabe kolonier med en 10 ml spids. </li><li> Saml bidder af colonies i en 15-ml rør og tillade at sedimentere i 3 min. Derefter fjerne supernatanten, resuspender i embryonale medium og plade på MEF&#39;er plader ved hjælp af et 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Kontrol af infektion <ol><li> Mens formerings cellerne, anbefales det, at pladen de inficerede celler i en mindre skala for at høste til RNA-analyse og udføre protein udtryk analyse ved immunfluorescens med henblik på at kontrollere, om biomarkører, der afspejler den korrekte biologiske status på hvert trin (se Repræsentative resultater). For højtiter lentivirus procentdelen af ​​forventede inficerede celler bør være mindst 80%. </li><li> For at sikre en høj effektivitet, kan lentivirusvektorerne ændres, indførelse af en fluorescerende selektionsmarkør og / eller et antibiotisk resistens. Vores lentiviral plasmid, der udtrykker BAF60C også bærer GFP-fluorescens. </li><li> Sortering hESCs til en fluorescerende markør. I tilfælde af lav effektivitet infektion anbefales at bruge fluorescens enctivated celler (FACS-sortering) for at berige for celler, der udtrykker BAF60C virus og derefter inficere cellerne med høj titer MyoD virus. <ol><li> Tilføj hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement i mediet dagen før sorteringen. </li><li> Den dag i sortering, dissociere cellerne ved TrypLE (som beskrevet på dag 0) og udeluk cellerne i KO udskiftning serum plus hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement i FACS-rør. </li><li> Ved afslutningen af ​​sorteringen, indsamle cellerne i KO udskiftning serum og plade på MEF&#39;er plader tilføje hES Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. </li></ol></li></ol></li></ol> 2.. EB-lignende induktion og Differentiering <ol><li> Induktion og differentiering procedure <ol><li> Dag 0 - EB induktion <ol><li> Sørg for, før du starter differentiering fra BAF60C/Myod-infected hESCs, at have høj antal kolonier i brønden (Figur 2C). </li><li> For hver brønd reFlyt mediet, vaskes med PBS, og der tilsættes 1 ml af 1 mg / ml collagenase IV. Inkuber 5 min ved 37 ° C. </li><li> Fjern collagenase og tilsæt 1 ml EB medium. </li><li> Under en dissektion mikroskop hurtigt mekanisk dissociere kolonierne i 400-800 celleaggregater ved at skrabe med en 10-ml spids. </li><li> Saml bidder af kolonier i et 15 ml rør og tillade at sedimentere i 3 minutter. Fjern supernatanten, resuspender i 3 ml EB medium og overføre cellesuspensionen til en brønd af en 6-brønds lav fastgørelsespladen. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Kontrollér størrelsen af ​​kolonier og celledød, før du fortsætter. Hvis store bidder er til stede, bryde dem ved forsigtigt at pipettere op og ned med en 5 ml pipette, 3-4 gange. Hvis celledød er meget høj (mange flydende celler og debris) erstatte mediet ved at indsamle de aggregater i en 15 ml rør ved hjælp af tyngdekraften og plade dem med 3 ml frisk EB medium, ellers fortsæt som følger. </li><li> Tilføj 1.5ml frisk EB medium i brøndene </li></ol></li><li> Dag 2 <ol><li> Skift medium ved at indsamle de aggregater fra brønde i en 15-ml rør. Lad dem slå sig ned i 2 min. </li><li> Supernatanten fjernes, erstatte med 3 ml frisk EB medium og omfordele på de samme brønde. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Tilføj 1,5 ml frisk EB medium i brøndene. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Fortsæt som beskrevet i &quot;Dag 2&quot;. </li></ol></li><li> Dag 5 - Myogenic differentiering af EB-lignende klynger (figur 2D). <ol><li> Saml de aggregater, som beskrevet i 2.1.3.1 og vask en gang med 2 ml PBS; tillade aggregeret til sediment. </li><li> Fjern PBS og tilsæt 3 ml medium DM; plade på samme brønde. </li></ol></li><li> Dag 6 - Dag 20 <ol><li> Fra d6 til d20 udskifte mediet med frisk medium hver 3. dag. Repræsentative myospheres er vist i Figur 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Kontrol myosphere differentiering <ol><li> Inden du går videre, anbefales det at kontrollere effektiviteten af myogenic differentiering inden for de myospheres ved at gøre dele af myospheres indlejret i OCT-forbindelse, som beskrevet i et tidligere JOVE protokol 12. Udfør en immunofluorescensfarvning for myogene markører, såsom myognenin (klon F5D, DSHB) og myosin tung kæde (klon MF20, DSHB) (se Repræsentative resultater). TIP! For at få succes med farvning for myogenin på EB sektioner er det vigtigt at udføre antigengenfinding ved behandling med natriumdodecylsulfat (SDS) 0,5% i 5 min. Derudover er det muligt at anvende denne protokol for det dobbelte farvning hjælp F5D og MF20 antistoffer. </li></ol></li></ol> 3. Media Opskrifter <ol><li> ESC medium DMEM-F12 1 mM L-glutamin 20% Knockout Serum Udskiftning medium (KOSR) 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) 50 U / ml penicillin / streptomycin (Pen / Strep) 0,1 mM beta-mercaptoethanol 8 ng / ml basisk fibroblast vækstfaktor (bFGF) </li><li> EB medium DMEM F12 1 mM L-glutamin 15% FBS 5% Horse Serum </li><li> Medium DM DMEF F12 1X ITS Liquid Media Supplement 1X N-2 Supplement </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Den her foreslåede protokol beskriver, hvordan man generere tredimensionelle klynger af kontraktile myofibre (myospheres) direkte fra hESCs. Den foreslåede strategi har den hidtil usete og ekstraordinære potentiale for at producere mini muskler i suspension, der kan være egnet som en &quot;sygdom i en skål&quot; model for både screening assays og udviklingsmæssige undersøgelser. Desuden metode til at generere myospheres fra hESCs er ligetil og kræver ikke nogen FACS-sortering trin under differentiering, som typisk har en negativ indvirkning på udbyttet af udvundne celler. Desuden ville en sortering procedure under differentieringen interfererer med aggregering, da det indebærer en dissociation af EB i enkeltceller. Den foreslåede metode er baseret på den epigenetiske reprograming af hESCs med specifikke faktorer, MyoD og BaAF60C, som ikke er udtrykt i pluripotente embryonale stamceller. MyoD og BAF60C give den &quot;kerne&quot; protein kompleks thpå mærker det genomiske loci, hvorfra transskription forløber at aktivere skelet myogene program. De to faktorer, der leveres til cellerne ved hjælp af lentivirale infektioner, og det er derfor afgørende for at opnå en høj effektivitet for infektion af begge faktorer i alle celler. Dette kan opnås ved hjælp af høj titer virus eller virus udstyret med selektionsmarkører. Dyrkningsbetingelser spiller også en vigtig rolle i at optimere omfanget af den myogene differentiering. Vi foreslår en serum differentiering protokol for differentieringen af ​​MyoD/BAF60C udtrykke hESCs i klynger af myogene forstadier, efterfulgt af inkubation i serum-frit defineret medium (indeholdende insulin transferrin - ITS) for at opnå konvertering af myogene forstadier i skelet myotuber. Det er imidlertid muligt, at andre definerede medier kan opnå tilsvarende eller bedre myogene differentiering. En strømbegrænsning af protokollen er, at det bygger på anvendelsen af ​​føtalt bovint serum, som ud over at indeholdening mange animalske proteiner og stoffer, viser parti-til-parti variationer. Dette kan resultere i lavere effektivitet eller heterogenitet myogenic konvertering inden myospheres. Notatet, ikke alle de EB-lignende strukturer, der stammer fra BAF60/MyoD-expressing hESCs er myospheres; nemlig nogle er EB-lignende aggregater fuldt sammensat af myofibre. Antallet af myospheres normalt fra hESCs udtrykker BAF60C og MyoD kan variere fra 30 til 60%, som anslået af immunfarvning på EB sektioner udføres ved afslutningen af ​​protokollen (se resultater). En potentiel tilgang til at berige en kultur fad kun myospheres ville være at bruge en myogenic reporter. Dette vil gøre det lettere at kassere de delvist eller ikke differentierede EB-lignende klynger og vælge kun myospheres. Endelig vil en bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund den tidsmæssige krav i de faktorer, der er indført være nyttigt at forbedre metoden til levering. For eksempel er hvis BAF60C og MyoD kræves kun til short tid til at &quot;kick&quot; cellerne i den rigtige retning, kunne blive anvendt metoder baseret på modificeret mRNA levering. Derimod, hvis der kræves faktorer for en længere tid, før cellerne udnytte deres endogene proteiner, et episomalt fremgangsmåde ville blive anbefalet at eliminere variabilitet og ukontrollerede virkninger på grund af integration i genomet. Endelig kan vi konstatere, at det er obligatorisk at udtrykke BAF60C før eller på samme tid som MyoD (aldrig efter) for at opnå embryonale konvertering til skelet muskler. Kravet om forudgående udtryk for BAF60C formentlig afhængig af sin rolle i pre-indstilling af epigenetiske landskab for korrekt MyoD kromatin distribution via genomet 6,15. Som sådan kunne fremtidige protokoller forbedres ved forbindelser eller andre manipulationer, der fremmer BAF60C udtryk i hESCs.

På grund af deres unikke evne til selv at forny og samtidig bevare pluripotency er de menneskelige embryonale stamceller (hESCs) betragtes som en uvurderlig ressource i regenerativ medicin. Stem cellemedieret repopulation af syge muskler og hESC-eller induceret pluripotente stamceller (IPSC)-afledt generation af skeletmuskulatur til in vitro sygdom modellering er centrale mål for undersøgelser med henblik på at identificere behandlinger, og belyse patogenesen af mange neuromuskulære sygdomme. Imidlertid har disse undersøgelser er blevet udfordret af modstanden af ​​hESCs til at konvertere til skeletmuskelceller og ved mangel på oplysninger om den molekylære regulering af embryonale-engagement mod skelet myogenese. Faktisk tidligere forsøg på at generere skeletmuskulaturen stamfædre fra hESCs viste, at kun embryoid krop (EB)-afledte afkom eller mesenkymceller er kompetente til at aktivere skelet myogenese efter ektopisk udtryk for transskriptionsaktivatorer (f.eksPAX3 eller Myf5) 1-3 eller ved udsættelse for specifikke dyrkningsbetingelser 4-5. Vi har tidligere vist, at SWI / SNF komponent BAF60C (kodet af SMARCD3), er en væsentlig bestanddel af det transkriptionelle maskineri, der gør det muligt MyoD-medieret aktivering af muskel-specifikke loci 6. Vi har for nylig opdaget, at en selektiv mangel på BAF60C giver på hESCs modstandsdygtigheden over for MyoD-medieret aktivering af skelet myogenese 7, der ellers er observeret i BAF60C udtrykker somatiske celler 8-10, en proces, der almindeligvis omtales som myogene konvertering. Tvunget udtryk for BAF60C giver MyoD til direkte at aktivere skelet myogenese i hESCs, på specifikke dyrkningsbetingelser, med BAF60C og MyoD pålægge en epigenetisk signatur, der forpligter hESCs mod myogenic afstamning 7. Notatet, tidligere proteom analyse afslørede selektiv mangel på BAF60C, blandt SWI / SNF komponenter i ESC 11.. Vi brugte denne viden til at pålægge en epigenetisk engagement hESCs på myogenic afstamning, der fører til dannelse af en homogen population af skeletmyoblaster der kunne aggregeres til at danne tredimensionale kontraktile strukturer (myospheres), der funktionelt efterligne miniaturiserede skeletmuskulatur 7. Faktisk vores metode til generering af skeletmuskulaturen stamfædre fra hESCs afhængig af epigenetiske engagement hESCs til myogenic afstamning, som er fænotypisk latent indtil cellerne udsættes for differentiering signaler, såsom celle sammenlægning og kultur i differentiering medium (se specifik protokol). Denne strategi tillader udvidelse af en homogen population af hESCs, der er epigenetisk forpligtet til skeletmuskulaturen afstamning og egnet til dannelse af tredimensionelle kontraktile myospheres der rekapitulere histologiske og funktionelle egenskaber af skeletmuskler. De myospheres giver de første beviser på miniaturiserede muskler udnyttes til en &quot;sygdom i en skål&quot; model af muskelsygdomme. Når der genereres fra patientens afledt iPSCs disse myospheres har potentiale til at belyse mangeårige udviklingsmæssige spørgsmål og patogenesen af ​​sjældne sygdomme, ud over at tilbyde det enorme potentiale som et redskab til high throughput screening af terapeutiske forbindelser. Vi bemærker også, at en øjeblikkelig udlæsning af myosphere analyse kunne tilvejebringes ved immunhistokemi på strækninger, som er beskrevet i en JOVE protokol af Gomes et al. 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Generering af en homogen og rigelig population af skeletmuskelceller fra humane embryonale stamceller (hESCs) er et krav for cellebaserede behandlingsformer og for en &quot;sygdom i en skål&quot; model af menneskelige neuromuskulære sygdomme. Større forhindringer, såsom lav tæthed og heterogenitet af befolkningen i rente, samt en manglende protokoller for dannelsen af ​​tre-dimensionelle kontraktile strukturer har begrænset anvendelser af stamceller til neuromuskulære lidelser. Vi har designet en protokol, der overvinder disse grænser ved ektopisk indførelse af definerede faktorer i hESCs - musklen beslutsomhed faktor MyoD og SWI / SNF kromatin remodellering kompleks komponent BAF60C - der er i stand til at omprogrammere hESCs i skeletmuskelceller. Her beskriver vi den protokol, etableret for at generere hESC-afledte myoblaster og fremme deres klyngedannelse i tredimensionale miniaturiserede strukturer (myospheres), som funktionelt efterligne miniaturiserede skeletmuskulatur 7 </sup&gt;.

Figur 1A viser en skematisk af protokollen foreslået at generere myospheres fra hESCs. De kritiske skridt til at kontrollere (angivet med pile) er effektiviteten af ​​infektionen i hESCs og myogenic konvertering inden for de myospheres. I vores eksperimenter, vi drage fordel af en lentivirusvektor kodning BAF60C der bærer GFP-fluorescens. Vi plejer at inficere cellerne med BAF60C og FACS-sortering 72 timer efter infektionen at berige for befolkningen udtrykker BAF60C. Når cellerne nå op på omkring 70-80% af sammenløb, vi inficere med MyoD lentivirus. Efter den første infektion der normalt to eller tre dage for cellerne at nå dette konfluens. Figur 1B viser ekspressionsniveauer af exogene gener som fold induktion i forhold til hESCs ikke er inficerede. Figur 1C viser ekspressionen og fordelingen på proteinniveauet af de faktorer, der er indført. BAF60C<html> ekspression er vist som GFP-fluorescens, mens MyoD ekspression detekteres ved immunofluorescens med MyoD antistof. Vi anser Dag 0 den dag, vi starter differentieringen af ​​inficerede hESCs i EB-lignende aggregater. Efter 15 dage i medium DM, er en del af myospheres (normalt en hel godt) indlejret i OCT-forbindelse 12 og sektioneret at udføre immunfluorescens for myogene markører til at kontrollere myogenic konvertering effektivitet. Figur 1D viser repræsentativt farvning for myogenin og myosin tung kæde i en optimal myogene differentiering. Myospheres kan have forskellige eller usædvanlige former, måske som følge af fusion med mindre myospheres. Fra Dag 10, er det muligt at observere sporadisk sammentrækning i myospheres (se film 1 og 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1.. A) Skematisk af den anvendte protokol til generering af myospheres fra hESCs. B) mRNA niveauer af eksogene gener i hESCs inficeret med BAF60C og MyoD (H9-BM) overvåget af qRT-PCR og udtrykt som fold induktion, som sammenlignet med mock-inficerede hESCs (H9-ctr). C) Immunofluorescens billeder, der viser MyoD farvning (rød) og BAF60C fluorescens (grøn) som følge af IRES-GFP-element i vektoren. D) Immunofluorescens udført på myosphere sektioner farvet for myogenin (MYOG ), Myosin Heavy Chain (MyHC) og kontrastfarves for DAPI (se Immunfluorescens detaljer). Målestokken er 100 um. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figur 2.. Repræsentative billeder af celle udseende på forskellige stadier afprotokol fra infektion (del I) til differentiering (del II). Scale bar er 100 um. Betragtninger EB-lignende strukturer fra d1 til d5 er for det meste cirkulær i form (D), myospheres vokset over 15 dage i henhold til ordningen i figur 1A præsentere en uforudsigelig form og er heterogene i kultur; se to eksempler i E og F.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming (Video) | JoVE

Her beskriver vi en protokol baseret på epigenetiske omprogrammering af humane embryonale stamceller (hESCs) retning af at skabe en homogen population af skeletmuskulaturen stamfædre, at der under tolerante dyrkningsbetingelser danner tredimensionelle klynger af kontraktile myofibre (myospheres), som rekapitulere biologiske funktioner i menneskets skelet muskler.

Generering af Myospheres Fra hESCs ved Epigenetisk Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs (Video) | JoVE

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel (Video) | JoVE

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel (Video) | JoVE

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue (Video) | JoVE

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System (Video) | JoVE

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set (Video) | JoVE

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation (Video) | JoVE

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses (Video) | JoVE

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors (Video) | JoVE

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...