Name: generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

PLP er førsteamanuensis Investigator av Sanford Barnas Health Research Center. Dette arbeidet har vært støttet av følgende tilskudd til PLP: R01AR056712, R01AR052779 og P30 AR061303 fra National Institute of Health / National Institute of leddgikt og muskel-og hudsykdommer (NIAMS), MDA og Sanford Barn Health Research Award. Dette arbeidet har blant annet dratt nytte av forskningsmidler fra Det europeiske fellesskaps sjuende rammeprogram i prosjektet FP7-Helse - 2009 ENDOSTEM 241440 (Aktivering av blodkar forbundet stamceller og muskel stamceller for reparasjon og vedlikehold av muskelvev) SA ble støttet av. CIRM fellesskap.

En. Infeksjon av hESCs Denne protokollen krever høy titer lentiviruses koding BAF60C og MyoD 13. Disse konstruksjonene er tilgjengelig på forespørsel. <ol><li> Anbefalinger før start <ol><li> For å sikre en høy virkningsgrad for infeksjon, plate hESCs for infeksjon på mater-frie betingelser (fig. 2A) for å fjerne cellulære konkurrenter i løpet av viral binding. Faktisk MEFs er notorisk enklere å infisere i forhold til hESCs og er kompetent for MyoD-mediert konvertering. Dermed eliminerer MEFs fra hESC kulturer øker infeksjonsraten. </li><li> Det anbefales å ha høye titer lentiviruses å sikre høy effektivitet for infeksjon. Alternativer for å forbedre effektiviteten av infeksjon er omtalt i avsnittet &quot;sjekke infeksjon&quot;. </li><li> Forbered Matrigel-belagte plater ved å tilsette 1 ml av 1 mg / ml Matrigel i hver brønn og la i det minste en time ved RT (eller O / N forseglet ved 4 ° CHvis fremstilt dagen før). </li></ol></li><li> Infeksjon prosedyre <ol><li> Dag før infeksjonen <ol><li> Legg hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement i mediet på 1000 X fortynning (2 mM endelig konsentrasjon). </li></ol></li><li> Dag 0 - Infeksjon med BAF60C Merk: Utfør infeksjon av hESCs med BAF60C første etterfulgt av infeksjon med MyoD. <ol><li> Dissosiere en brønn i en 6-brønns plate av hESCs dyrkes som kolonier 14 i en enkeltcelle-suspensjon ved inkubering med 1 ml av TrypLE i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Transfer suspensjon til en 15-ml tube, tilsett 9 ml hESC medium og sentrifuger i 5 min ved 1200 rpm. </li><li> Under sentrifugering, klar infeksjonen blanding i et rent rør ved tilsetning til 1 ml av mTeSR1, polybren (6 mg / ml) og hes Cell Cloning og gjenfinning av tillegg (2 mM). </li><li> Re-suspendere cellen pellet (ca 5 x 10 5 -1 x 10 6 celler fra en confluent godt av hESCs) med en ml av infeksjon mix og plate på en seks-brønns lav festeplate, som hindrer cellene fra å følge plast. </li><li> Legg BAF60C-Ires-GFP viruset på 10 8 MOI og inkuber 3 hr i inkubatoren </li><li> Samle cellesuspensjonen som inneholder virus og dele likt i to matrigel brønnene som er dekket. Deretter legger 2 ml mTeSR1 + hes Cell Kloning &amp; Recovery-tillegget til hver brønn og la O / N i kuvøse. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Fjern forsiktig medium som inneholder virus og erstatte med 2 ml mTeSR1and hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. Celler vil starte klumper som vist i figur 2B. </li></ol></li><li> Dag2 - Infeksjon med MyoD <ol><li> Før du fortsetter sjekke fluorescens status for cellene under en fluorescens mikroskop for å sørge for å ha en høy virkningsgrad på infeksjon. Hvis ikke, se avsnittet &quot;sjekker infisereion &quot;. </li><li> Hvis cellene har nådd minst 80% av samløpet, gjør som følger; ellers vente en ekstra dag før du fortsetter. </li><li> Fjern medium og tilsett 1 ml TrypLE reagens å distansere cellene. Inkuber i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Gjenta som beskrevet from1.2.2.2 - 1.2.2.6 legge MyoD virus på 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Fjern forsiktig medium som inneholder virus og erstatte med 2 ml mTeSR1and hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. </li><li> Plate MEFs på matrigel belagte plater på 2,5 x 10 5 / cm 2 for den neste dag for å tillate forplantning av de infiserte celler. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Fjern medium og tilsett 1 ml TrypLE reagens å distansere cellene. Inkuber i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Overfør cellene i en 15-ml falk rør, tilsett 9 ml hESC medium og sentrifuger i 5 min ved 1200 rpm. </li><li> REDra supernatanten og re-suspendere i 6 ml hESC medium. </li><li> Fjern mediet fra MEFs-inneholdende 6-brønns plate og plate hESCs på 01:02 deleforhold, dispensering av 3 ml for hver MEFs holdig godt. TIPS! Når koloniene nå samløpet, kan noen av brønnene i MyoD/BAF60C-infected celler fryses i flytende nitrogen som en reserve lager. Frysing medium omfatter 90% av KOSR og 10% DMSO pluss 2 mM hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. De gjenværende brønner kan deretter utsettes for differensiering protokoll - se nedenfor etter beskrivelsen. Dersom flere celler som er nødvendig for å produsere flere myospheres kan infiserte hESCs spres videre som følger: </li><li> Fjern medium og inkuberes med 1 ml av 1 mg / ml collagenase IV i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Fjern collage IV og tilsett 1 ml hESC medium. </li><li> Under en disseksjon mikroskop skrape koloniene med en 10 ml tips. </li><li> Samle biter av kolones i en 15-ml tube og tillater å sedimentere i 3 min. Så fjern supernatanten, resuspender i hESC medium og plate på MEFs plater i forholdet 01:04. </li></ol></li></ol></li><li> Kontroll infeksjon <ol><li> Mens som forplanter seg i cellene, er det anbefalt å plate de infiserte celler i en mindre skala for å høste for RNA-analyse og protein ekspresjon analyse utføre ved immunofluorescens for å se etter biomarkører som reflekterer den korrekte biologisk status i hvert trinn (se Representative resultater). For høy titer lentiviruses prosentandelen av forventede infiserte celler bør være minst 80%. </li><li> For å sikre høy effektivitet, kan de lentiviral vektorer bli modifisert med innføring av et fluoriserende seleksjonsmarkør og / eller en antibiotisk resistens. Vår lentiviral plasmid uttrykker BAF60C bærer også GFP fluorescens. </li><li> Sortering hESCs for en fluoriserende fargestoff. I tilfelle av lav effektivitet for infeksjon er det anbefalt å bruke en fluorescensctivated celler sortering (FACS-sortering) for å berike for celler som uttrykker BAF60C virus og deretter infisere celler med høy titer MyoD virus. <ol><li> Legg hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement på mellom dagen før sortering. </li><li> Dagen for sortering, distansere cellene ved TrypLE (som beskrevet på dag 0) og resuspender cellene i KO erstatning serum pluss hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement i FACS-rør. </li><li> På slutten av sorteringen, samle cellene i KO erstatning serum og plate på MEFs plater legge hes Cell Kloning &amp; Recovery Supplement. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-lignende Induksjon og Differensiering <ol><li> Induksjon og differensiering prosedyre <ol><li> Dag 0 - EB induksjon <ol><li> Sørg for, før du starter differensiering fra BAF60C/Myod-infected hESCs, å ha høyt antall kolonier i brønnen (figur 2C). </li><li> For hver brønn rEDra medium, vaskes med PBS og tilsett 1 ml av 1 mg / ml collagenase IV. Inkuber i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Fjern collagenase og tilsett 1 ml EB medium. </li><li> Under en disseksjon mikroskop raskt mekanisk distansere koloniene i 400-800 celleansamlinger ved å skrape med en 10-ml tips. </li><li> Samle biter av koloniene i en 15-ml tube og la til sediment i 3 min. Fjern supernatanten, resuspendere i 3 ml av EB medium og overføre cellesuspensjonen til en brønn i en 6-brønns lavt festeplate. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Sjekk størrelsen på kolonier og celledød før du fortsetter. Hvis store biter er til stede, bryte dem ved forsiktig pipettering opp og ned med en 5-ml pipette, 3-4 ganger. Dersom celledød er meget stor (flere flytelegemer og rusk) erstatte mediet ved å samle aggregatene i et 15 ml rør ved hjelp av tyngdekraften og plate dem med 3 ml frisk EB medium, også gå frem på følgende måte. </li><li> Legg 1.5ml med friskt medium EB i brønnene </li></ol></li><li> Dag 2 <ol><li> Endre medium ved å samle aggregatene fra brønnene i en 15-ml tube. La dem slå seg ned i 2 min. </li><li> Fjern supernatanten, erstatt med 3 ml frisk EB medium og redistribuere de samme brønner. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Tilsett 1,5 ml av frisk EB medium i brønnene. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Fortsett som beskrevet i &quot;Dag 2&quot;. </li></ol></li><li> Dag 5 - Myogenic differensiering av EB-som klynger (figur 2D). <ol><li> Samle aggregatene som beskrevet i 2.1.3.1 og vaskes en gang med 2 ml PBS; tillate den aggregerte å sedimentere. </li><li> Fjern PBS og tilsett 3 ml av DM medium; plate på de samme brønnene. </li></ol></li><li> Dag 6 - Dag 20 <ol><li> Fra d6 til d20 erstatte mediet med friskt medium hver 3. dag. Representative myospheres er vist i Figure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Kontroll myosphere differensiering <ol><li> Før du fortsetter videre, anbefales det å kontrollere effektiviteten av myogenic differensiering innenfor myospheres ved å gjøre deler av myospheres innebygd i oktober sammensatte, som beskrevet i en tidligere Jove protokoll 12. Utfør en immunfluorescens farging for myogeniske markører som myognenin (klone F5D, DSHB) og myosin tung kjede (klone MF20, DSHB) (se Representative resultater). TIPS! For å lykkes med farging for myogenin på EB seksjoner det er avgjørende å utføre antigen gjenfinning ved behandling med natriumdodecylsulfat (SDS) 0,5% for 5 min. I tillegg er det mulig å bruke denne protokollen for dobbeltfarging ved hjelp F5D og MF20 antistoffer. </li></ol></li></ol> Tre. Media Oppskrifter <ol><li> ESC medium DMEM-F12 1 mM L-glutamin 20% Knockout Serum Replacement medium (KOSR) 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) 50 U / ml penicillin / streptomycin (Pen / Strep) 0,1 mM beta-mercaptoethanol 8 ng / ml basic fibroblast vekstfaktor (bFGF) </li><li> EB medium DMEM F12 1 mM L-glutamin 15% FBS 5% Horse Serum </li><li> DM medium DMEF F12 1X ITS Flytende Media Supplement 1X N-2 Supplement </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Protokollen foreslått her beskriver hvordan å generere tredimensjonale klynger av kontraktile myofibers (myospheres) direkte fra hESCs. Den foreslåtte strategi har de enestående og usedvanlig potensial til å produsere mini muskler i suspensjonen som kan være egnet som en &quot;sykdom i en tallerken&quot;-modellen for både screening-analyser og utviklingsstudier. Dessuten er metoden for å generere myospheres fra hESCs enkel og krever ingen FACS-sortering trinn i løpet av differensiering, som typisk har en negativ innvirkning på utbyttet av celler gjenvunnet. Dessuten ville en sorteringsprosedyren under differensiering forstyrre aggregering siden det innebærer en dissosiasjon av EB til enkeltceller. Den foreslåtte metoden er basert på epigenetisk reprograming av hESCs med spesifikke faktorer, MyoD og BaAF60C, som ikke er uttrykt i pluripotent embryonale stamceller. MyoD og BAF60C gi &quot;kjernen&quot; protein kompleks thved merkene det genomiske loci for transkripsjon fortsetter å aktivere skjelett myogenic program. De to faktorene blir levert til cellene ved hjelp av lentiviral infeksjoner, og det er derfor kritisk for å oppnå en høy effektivitet for infeksjon av begge faktorer i alle celler. Dette kan oppnås ved hjelp av høye titer virus eller virus utrustet med seleksjonsmarkører. Dyrkningsbetingelser spiller også en viktig rolle i å optimalisere graden av myogenic differensiering. Vi foreslår en serum-baserte differensiering protokoll for differensiering av MyoD/BAF60C uttrykke hESCs i klynger av myogeniske forløpere, etterfulgt av inkubasjon i serum-free definert medium (som inneholder insulin transferrin - ITS) for å oppnå konvertering av myogeniske forløpere til skjelett myotubes. Det er imidlertid mulig at andre definerte medier kan oppnå en likeverdig eller bedre myogenisk differensiering. En strømbegrensning av protokollen er at den er avhengig av bruk av fetalt bovint serum, som, foruten å inneholdeing mange animalske proteiner og stoffer, viser mye-til-mange variasjoner. Dette kan føre til lavere effektivitet eller heterogenitet av myogenic konvertering innen myospheres. Av notatet, ikke alle EB-lignende strukturer som stammer fra BAF60/MyoD-expressing hESCs er myospheres; nemlig noen er EB-lignende tilslag fullt sammensatt av myofibers. Antallet myospheres normalt avledet fra hESCs uttrykker BAF60C og MyoD kan variere fra 30 til 60% som anslått av farging på EB seksjoner utført på slutten av protokollen (se resultater). En potensiell tilnærming til å berike en kultur parabolen for bare myospheres ville være å bruke en myogenic reporter. Dette vil legge til rette for å forkaste de delvis eller ikke differensiert EB-lignende klynger og velge bare myospheres. Til slutt vil en bedre forståelse av mekanismene bak tidsmessige krav til faktorer innført være nyttig å forbedre metoden for levering. For eksempel er hvis BAF60C og MyoD kreves bare for short tid til å &quot;kick&quot; cellene i riktig retning, kan metoder som er basert på modifisert mRNA levering anvendes. Derimot, hvis forhold er nødvendig for en lengre tid før cellene utnytte deres endogene proteiner, en episomal tilnærming ville være anbefalt å eliminere variabilitet og ukontrollerte virkninger på grunn av integrasjon inn i genomet. Til slutt konstaterer vi at det er obligatorisk å uttrykke BAF60C før eller samtidig som MyoD (aldri etter) for å oppnå hESC konvertering til musklene. Kravet om forutgående uttrykk for BAF60C antagelig avhengig av sin rolle i pre-sette epigenetisk landskapet for riktig MyoD kromatin distribusjon gjennom genomet 6,15. Som sådan, kan fremtidige protokoller forbedres ved å anvende forbindelsene eller andre manipulasjoner som fremmer BAF60C ekspresjon i hESCs.

På grunn av sin unike evne til å selv fornye og samtidig beholde pluripotency, er humane embryonale stamceller (hESCs) ansett som en uvurderlig ressurs i regenerativ medisin. Stamcelle mediert repopulation av syke muskler og hESC-eller indusert pluripotent stamceller (iPSC)-avledet generasjon av skjelettmuskulaturen for in vitro sykdom modellering er sentrale mål for studier med sikte på å identifisere behandlinger og belyse patogenesen av mange nevromuskulære sykdommer. Imidlertid har disse studiene blitt utfordret av motstanden av hESCs å konvertere til skjelettmuskelceller og av det sparsommelige opplysninger om den molekylære reguleringen av hESC-satsing mot skjelett myogenese. Faktisk, tidligere forsøk på å generere skjelettmuskelstamfedre fra hESCs viste at bare embryoid kroppen (EB)-avledet progenies eller mesenchymalceller er kompetente til å aktivere skjelett myogenese følgende ektopisk uttrykk for transkripsjonsaktivatorer (f.eksPax3 eller Myf5) 1-3 eller ved eksponering for spesifikke kultur vilkår 4-5. Vi har tidligere vist at SWI / SNF komponent, BAF60C (kodet av SMARCD3), er en avgjørende del av transkripsjons maskiner som gjør at MyoD-mediert aktivering av muskelspesifikke loci seks. Vi har nylig oppdaget at selektiv fravær av BAF60C confers på hESCs motstanden mot MyoD-mediert aktivering av skjelett myogenese 7 som ellers er observert i BAF60C uttrykker somatiske celler 8-10, en prosess som vanligvis kalles myogenic konvertering. Tvunget uttrykk for BAF60C gjør MyoD å direkte aktivere skjelett myogenese i hESCs, på spesifikke kultur vilkår, med BAF60C og MyoD innføre en epigenetisk signatur som begår hESCs mot myogenisk avstamning 7. Av notatet, forrige proteomikk analyser avslørte selektiv fravær av BAF60C, blant SWI / SNF komponenter, i ESCs 11. Vi brukte denne kunnskapen til å pålegge en epigenetisk engasjement hESCs på myogenisk avstamning, som fører til generering av en homogen populasjon av skjelett myoblasts som kunne samles for å danne tredimensjonale kontraktile strukturer (myospheres) som funksjonelt ligner miniatyriserte skjelettmuskulaturen 7. Faktisk, vår metode for å generere skjelettmuskelstamfedre fra hESCs avhengig av epigenetisk engasjement hESCs til myogenisk avstamning, som er fenotypisk latent inntil cellene blir utsatt for differensiering signaler, for eksempel celle aggregering og kultur i differensiering medium (se spesifikk protokoll). Denne strategien tillater utvidelse av en homogen populasjon av hESCs som epigenetically forpliktet til skjelettmuskulatur avstamning og egnet til dannelse av tredimensjonale kontraktile myospheres som rekapitulere histologiske og funksjonelle egenskaper av skjelettmuskler. De myospheres gi den første bevis for miniatyriserte muskler utnyttbare for en &quot;sykdom i en skål&quot; modell av muskelsykdommer. Når generert fra pasient avledet iPSCs, disse myospheres har potensial til å belyse langvarige utviklingsspørsmål og patogenesen av sjeldne sykdommer, i tillegg til å tilby et stort potensial som et verktøy for high throughput screening av terapeutiske forbindelser. Vi ser også at en umiddelbar avlesning av myosphere analyse kunne bli gitt av immunhistokjemi på seksjoner, som beskrevet i en Jove protokollen ved Gomes et al. 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Generering av en homogen og rikelig populasjon av skjelettmuskel-celler fra humane embryoniske stamceller (hESCs) er en forutsetning for celle-basert terapi og for en &quot;sykdom i et fat&quot; modell for human neuromuskulære sykdommer. Store hindringer, slik som lav mengde og heterogenitet av populasjonen av interesse, så vel som en manglende protokoller for dannelse av tredimensjonale kontraktile strukturer, har begrensede anvendelser av stamceller for neuromuskulære lidelser. Vi har laget en protokoll som overvinner disse grensene ved ektopisk innføring av definerte faktorer i hESCs - muskelen besluttsomhet faktor MyoD og SWI / SNF kromatin remodeling kompleks komponent BAF60C - som er i stand til å omprogrammere hESCs i skjelettmuskelceller. Her beskriver vi protokollen etablert for å generere hESC-avledet myoblasts og fremme deres clustering inn tridimensional miniatyriserte strukturer (myospheres) som funksjonelt ligne miniatyriserte skjelettmuskulaturen 7 </sup&gt;.

Figur 1A viser et skjematisk av protokollen foreslått å generere myospheres fra hESCs. De kritiske skritt for å kontrollere (angitt med piler) er effektiviteten av infeksjonen i hESCs og myogenisk konvertering innenfor myospheres. I våre forsøk vi dra nytte av en lentiviral vektor koding BAF60C som bærer GFP fluorescens. Vi pleier å infisere celler med BAF60C og FACS-sort 72 timer etter infeksjonen å berike for befolkningen uttrykker BAF60C. Når cellene nå rundt 70-80% av samløpet, vi infisere med MyoD lentivirus. Etter den første infeksjonen det normalt tar to eller tre dager for cellene å nå det samløpet. Figur 1B viser ekspresjonsnivåene av de eksogene gener som fold induksjon i forhold til hESCs ikke er infisert. Figur 1C viser ekspresjon og distribusjon på proteinnivå av faktorene innføres. BAF60C<html> uttrykk vises som GFP fluorescens, mens MyoD uttrykk oppdages ved immunfluorescens med en MyoD antistoff. Vi anser Dag 0 dagen vi starter differensieringen av infiserte hESCs inn EB-lignende tilslag. Etter 15 dager i DM medium, blir en del av myospheres (vanligvis en hel brønn) innebygd i oktober forbindelsen 12 og seksjonert for å utføre immunofluorescens for myogeniske markører for å kontrollere myogenic omdannelseseffektiviteten. Figur 1D viser representative farging for myogenin og myosin tung kjede in en optimal myogenisk differensiering. Myospheres kan ha forskjellige eller uvanlige former, kanskje som et resultat av fusjon med mindre myospheres. Start fra dag 10, er det mulig å observere sporadisk sammentrekning i myospheres (se filmen 1 og 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. A) Skjematisk av protokollen som brukes for generering av myospheres fra hESCs. B) mRNA nivåer av eksogene gener i hESCs smittet med BAF60C og MyoD (H9-BM) overvåkes av QRT-PCR og uttrykt som fold induksjon, som sammenlignet med spotte infiserte hESCs (H9-CTR). C) immunofluorescence bilder som viser MyoD farging (rød) og BAF60C fluorescens (grønn) på grunn av IRES-GFP element i vektoren. D) Immunfluorescens utført på myosphere seksjoner farget for Myogenin (MYOG ), Myosin Heavy Chain (MyHC) og kontra for DAPI (se immunofluorescence detaljer). Scale bar er 100 mikrometer. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figur 2. Representative bilder av celle utseende på ulike stadier avprotokoll fra infeksjon (del I) til differensiering (del II). Scale bar er 100 mikrometer. Mens EB-lignende strukturer fra d1 til d5 er for det meste rund i formen (D), myospheres vokst over 15 dager i henhold til ordningen i figur 1A presentere en uforutsigbar form og er heterogene i kultur; se to eksempler i E og F.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Her beskriver vi en protokoll basert på epigenetisk reprogrammering av humane embryonale stamceller (hESCs) mot å generere en homogen befolkning av skjelettmuskel progenitors at under ettergivende kultur forhold danner tre-dimensjonale klynger av kontraktile myofibers (myospheres), som rekapitulere biologiske trekk ved menneskelig skjelettmuskulatur.

Generering av Myospheres Fra hESCs av Epigenetic Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Research

JoVE Journal

Biology

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Omprogrammering av Adult somatiske celler til pluripotency ved Overuttrykte av Yamanaka Faktorer

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...