Name: generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

PLP är en Associate Utredare av Sanford barns hälsa Research Center. Detta arbete har stötts av följande bidrag till PLP: R01AR056712, R01AR052779 och P30 AR061303 från National Institute of Health / National Institute of Arthritis och muskuloskeletala och hudsjukdomar (NIAMS), MDA och Sanford Children Health Research Award. Detta arbete har delvis gynnats av forskningsfinansiering från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram i projektet FP7-Hälsa - 2009 ENDOSTEM 241.440 (Aktivering av kärl tillhörande stamceller och muskelstamceller för reparation och underhåll av muskelvävnad) SA stöddes av. CIRM gemenskap.

1. Infektion av hESCs Detta protokoll kräver hög titer lentivirus kodning BAF60C och MyoD 13. Dessa konstruktioner kan fås på begäran. <ol><li> Rekommendationer före start <ol><li> För att säkerställa en hög effektivitet för infektion, platt hESCs för infektion på feeder-fria förhållanden (figur 2A) för att eliminera cellulära konkurrenter under virusupptag. Faktum MEF är notoriskt lättare att smitta jämfört med hESCs och är behöriga för MyoD-medierad omvandling. Således, vilket eliminerar MEF från hESC kulturer ökar infektionsfrekvensen. </li><li> Det rekommenderas att ha höga titer lentivirus för att säkerställa hög effektivitet för infektion. Alternativ för att förbättra effektiviteten av infektion diskuteras i avsnittet &quot;kontroll infektion&quot;. </li><li> Förbered Matrigel-belagda plattor genom tillsats av 1 ml av 1 mg / ml Matrigel i varje brunn och lämnar åtminstone en timme vid RT (eller O / N förseglad vid 4 ° COm förberett dagen innan). </li></ol></li><li> Infektion förfarande <ol><li> Dag före infektionen <ol><li> Lägg hES Cell Kloning och återställning Tillägg i mediet vid 1000 X utspädning (2 mM slutlig koncentration). </li></ol></li><li> Dag 0 - Infektion med BAF60C Observera: Utför infektion av hESCs med BAF60C först följt av infektion med MyoD. <ol><li> Dissociera en brunn i en 6-brunnsplatta av hESCs odlas som kolonier 14 i en enkelcellsuspension genom inkubering med 1 ml av TrypLE för 5 min vid 37 ° C. </li><li> Överför suspensionen till en 15-ml rör, tillsätt 9 ml hESC medium och centrifugera under 5 min vid 1200 rpm. </li><li> Under centrifugering, framställning av infektion mixen i ett rent rör genom att man till en ml mTeSR1 polybren (6 mg / ml) och hes Cell Cloning &amp; återställning Supplement (2 mM). </li><li> Återsuspendera cellpelleten (ungefär 5 x 10 5 -1 x 10 6 celler från en confluent brunn av hESCs) med 1 ml av infektion mixen och plattan på en 6-brunnars låg fastsättningsplatta, som förhindrar cellerna från att vidhäfta till plasten. </li><li> Lägg BAF60C-IRES-GFP-virus vid 10 8 MOI och inkubera 3 tim i inkubatorn </li><li> Samla cellsuspensionen som innehåller virus och dela lika på två Matrigel brunnarna. Tillsätt sedan 2 ml mTeSR1 + hES Cell Kloning &amp; Recovery Tillägg till varje brunn och låt O / N i inkubatorn. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Ta försiktigt bort det medium som innehåller viruset och ersätt med 2 ml mTeSR1and hES Cell Kloning och återställning Supplement. Celler kommer att börja hopklumpning såsom visas i figur 2B. </li></ol></li><li> Dag2 - Infektion med MyoD <ol><li> Innan vi går vidare kontrollera fluorescensen status cellerna under ett fluorescensmikroskop för att se till att ha en hög effektivitet för infektion. Om inte, se avsnittet &quot;kontroll infekterajon &quot;. </li><li> Om cellerna har nått minst 80% av sammanflödet Gör så här; annars vänta ytterligare en dag innan du fortsätter. </li><li> Ta ut mediet och tillsätt 1 ml TrypLE reagens att skilja cellerna. Inkubera 5 minuter vid 37 ° C. </li><li> Upprepa som beskrivs from1.2.2.2 - 1.2.2.6 lägga MyoD virus vid 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Ta försiktigt bort det medium som innehåller viruset och ersätt med 2 ml mTeSR1and hES Cell Kloning och återställning Supplement. </li><li> Plåt MEF på matrigel belagda plattor på 2,5 x 10 5 / cm 2 för nästa dag för att möjliggöra spridning av de infekterade cellerna. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Ta ut mediet och tillsätt 1 ml TrypLE reagens att skilja cellerna. Inkubera 5 minuter vid 37 ° C. </li><li> Överför cellerna i en 15-ml Falcon-rör, tillsätt 9 ml hESC medium och centrifugera under 5 min vid 1200 rpm. </li><li> REFlytta supernatanten och återsuspendera i 6 ml hESC medium. </li><li> Ta ut mediet från MEF-innehållande 6-brunnar och platta hESCs på 1:02 delningsfaktorn, dispense 3 ml för varje MEF-innehållande bra. TIPS! När kolonierna nå konfluens kan vissa av brunnarna i MyoD/BAF60C-infected celler frysas i flytande kväve som reservlagret. Frysning mediet innehåller 90% av KOSR och 10% DMSO plus 2 mM hES Cell Kloning och återställning Supplement. De återstående brunnar kan sedan utsättas för differentiering protokoll - se nedan för beskrivning. Om det behövs fler celler att producera mer myospheres, kan smittade hESCs förökas vidare enligt följande: </li><li> Avlägsna medium och inkubera med 1 ml av 1 mg / ml kollagenas IV i 5 min vid 37 ° C. </li><li> Ta kollagenas IV och tillsätt 1 ml hESC medium. </li><li> Enligt en dissektion mikroskop skrapa kolonier med en 10 ml spets. </li><li> Samla bitar av Colonies i en 15-ml rör och låt sedimentera under 3 min. Avlägsna supernatanten, återsuspendera i hESC medium och platta på MEFs plattor med hjälp av ett förhållande 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Kontrollerat infektion <ol><li> Medan föröknings cellerna, rekommenderas till tallriken de infekterade cellerna i mindre skala för att skörda för RNA-analys och utför proteinuttrycksanalys av immunofluorescens för att kontrollera om biomarkörer som speglar den korrekta biologiska statusen i varje steg (se Representativa resultat). För hög titer lentivirus andelen förväntade infekterade celler bör vara åtminstone 80%. </li><li> För att säkerställa hög effektivitet, kan de lentivirala vektorerna modifieras, att införa en fluorescerande selektionsmarkör och / eller ett antibiotiskt motstånd. Vår lentiviral plasmid som uttrycker BAF60C bär också GFP fluorescens. </li><li> Sorterings hESCs för en fluorescent markör. I fallet med låg verkningsgrad för infektion rekommenderas att använda fluorescens enctivated celler sortering (FACS-sortering) för att berika för celler som uttrycker BAF60C virus och sedan infektera celler med hög titer MyoD virus. <ol><li> Lägg hES Cell Kloning och återställning Tillägg i mediet dagen före sortering. </li><li> Dagen för sortering, dissociera cellerna genom TrypLE (enligt beskrivningen på dag 0) och suspendera cellerna i KO ersättnings serum plus hES Cell Kloning &amp; Recovery Tillägg i FACS-rör. </li><li> I slutet av sortering, samla cellerna i KO ersättning serum och plåt på MEFs plattor lägga hES Cell Kloning och återställning Supplement. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-liknande induktion och differentiering <ol><li> Induktion och differentiering förfarande <ol><li> Dag 0 - EB induktion <ol><li> Se till, innan differentiering från BAF60C/Myod-infected hESCs, att ha höga antalet kolonier i brunnen (figur 2C). </li><li> För varje brunn rEFlytta mediet, tvätta med PBS och tillsätt 1 ml av 1 mg / ml kollagenas IV. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C. </li><li> Ta kollagenas och tillsätt 1 ml EB-medium. </li><li> Enligt en dissektion mikroskop snabbt mekaniskt dissociera kolonierna i 400-800 cellaggregat genom att skrapa med en 10-ml spets. </li><li> Samla bitar av kolonierna i ett 15-ml rör och låt sedimentera under 3 min. Avlägsna supernatanten, återsuspendera i 3 ml EB-medium och överför cellsuspensionen till en brunn i en 6-brunnars låg fastsättningsplatta. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Kontrollera storleken på kolonierna och dödscellen innan du fortsätter. Om stora bitar är närvarande, bryta dem genom att försiktigt pipettera upp och ner med en 5-ml pipett 3-4 gånger. Om celldöd är mycket hög (många flytande celler och skräp) ersätta mediet genom att samla aggregaten i en 15-ml tub av gravitationen och platta dem med 3 ml färskt EB medium, annars gör så här. </li><li> Lägg 1,5ml färskt EB mediet i brunnarna </li></ol></li><li> Dag 2 <ol><li> Ändra medium genom uppsamling av de aggregat från brunnarna i en 15-ml rör. Låt dem slå sig ner i 2 min. </li><li> Avlägsna supernatanten, ersätt med 3 ml färskt EB medium och omfördela på samma brunnar. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Lägg till 1,5 ml färskt EB mediet i brunnarna. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Fortsätt enligt beskrivningen i &quot;Dag 2&quot;. </li></ol></li><li> Dag 5 - Myogenic differentiering av EB-liknande kluster (Figur 2D). <ol><li> Samla de aggregat som beskrivs i 2.1.3.1 och tvätta en gång med 2 ml PBS; låta den aggregerade till sediment. </li><li> Ta bort PBS och tillsätt 3 ml DM medium; platta på samma brunnar. </li></ol></li><li> Dag 6 - Dag 20 <ol><li> Från d6 till d20 ersätta mediet med färskt medium var 3 dagar. Representativa myospheres visas i Figure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Kontrollerat myosphere differentiering <ol><li> Innan du går vidare, är det rekommenderat att kontrollera effektiviteten i myogenic differentiering inom de myospheres genom att göra delar av myospheres inbäddade i oktober förening, som beskrivs i en tidigare JUPITER-protokoll 12. Utför en immunofluorescensfärgning för myogena markörer som myognenin (klon F5D, DSHB) och myosin tung kedja (klon MF20, DSHB) (se Representativa resultat). TIPS! För att lyckas med färgning för myogenin på EB avsnitt är det viktigt att utföra antigenåtervinning genom behandling med natriumdodecylsulfat (SDS) 0,5% i 5 min. Dessutom är det möjligt att använda detta protokoll för dubbelfärgning med hjälp F5D och MF20 antikroppar. </li></ol></li></ol> 3. Media Recept <ol><li> ESC-medium DMEM-F12 1 mM L-glutamin 20% Knockout Serum ersätter medium (KOSR) 0,1 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA) 50 U / ml penicillin / streptomycin (pen / strep) 0,1 mM beta-merkaptoetanol 8 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) </li><li> EB-medium DMEM-F12 1 mM L-glutamin 15% FBS 5% hästserum </li><li> DM-medium DMEF F12 1X ITS Liquid Media Supplement 1X N-2 supplement </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Protokollet föreslås här beskriver hur man skapar tredimensionella kluster av kontraktila myofibers (myospheres) direkt från hESCs. Den strategi som föreslås har motstycke och extraordinära potential att producera mini muskler i suspension som kan vara lämpligt som en &quot;sjukdom i en skål&quot; modell för både screeninganalyser och utvecklingsstudier. Dessutom är metoden att generera myospheres från hESCs enkel och kräver inte någon FACS-sortering steg under differentiering, som normalt har en negativ inverkan på avkastningen av celler som återvunnits. Dessutom skulle en sorteringsförfarande under differentiering störa aggregering eftersom det innebär en dissociation av EB i enskilda celler. Den föreslagna metoden bygger på den epigenetiska reprograming av hESCs med specifika faktorer, MyoD och BaAF60C som inte uttrycks i pluripotenta embryonala stamceller. MyoD och BAF60C tillhandahålla den &quot;kärna&quot; proteinkomplex thvid markerar iska loci från vilken transkription fortsätter att aktivera skelett myogena programmet. De två faktorer som levereras till cellerna med hjälp av lentivirala infektioner och det är därför viktigt att uppnå en hög effektivitet för infektion av båda faktorerna i alla celler. Detta kan uppnås genom att använda hög titer virus eller virus utrustade med selektionsmarkörer. Odlingsbetingelser spelar också en viktig roll för att optimera omfattningen av myogena differentiering. Vi föreslår ett serumbaserat differentiering protokoll för differentiering av MyoD/BAF60C uttrycka hESCs i kluster av myogena prekursorer följt av inkubation i serumfritt definierat medium (innehållande insulin transferrin - ITS) för att uppnå omvandling av myogenic prekursorer in i skelett myotuber. Det är emellertid möjligt att andra definierade medier kan uppnå en lika stor eller bättre myogenic differentiering. En strömbegränsning av protokollet är att det bygger på användning av fetalt bovint serum, som, förutom att innehållaning många animaliska proteiner och ämnen, visar mycket-till-många variationer. Detta kan leda till lägre effektivitet eller heterogenitet myogena omställning inom myospheres. Att notera, inte alla EB-liknande strukturer som härrör från BAF60/MyoD-expressing hESCs är myospheres; nämligen vissa är EB-liknande aggregat helt består av myofibers. Antalet myospheres normalt härrör från hESCs uttrycker BAF60C och MyoD kan variera från 30 till 60% som uppskattas genom immunfärgning på EB avsnitt utförs i slutet av protokollet (se resultat). En potentiell metod för att berika en odlingsskål för endast myospheres skulle vara att använda en myogena reporter. Detta skulle underlätta kasta bort de delvis eller inte differentierade EB-liknande kluster och välja bara de myospheres. Slutligen skulle en bättre förståelse för mekanismerna bakom de tidsmässiga kraven i de faktorer som införs vara användbart för att förbättra leveranssätt. Till exempel, om BAF60C och MyoD krävs endast för shOrt tid att &quot;sparka&quot; cellerna i rätt riktning, kan metoder baserade på modifierade mRNA leverans tillämpas. Däremot, om de faktorer som krävs för en längre tid innan cellerna utnyttja deras endogena proteiner, en episomal strategi kan rekommenderas för att eliminera variationer och okontrollerade effekter på grund av integrationen i genomet. Slutligen kan vi konstatera att det är obligatoriskt att uttrycka BAF60C före eller samtidigt som MyoD (aldrig efter) för att uppnå hESC omvandling till skelettmuskulaturen. Kravet på förhands uttryck av BAF60C bygger förmodligen på sin roll i förväg sätta den epigenetiska landskapet för korrekt MyoD kromatin distribution genom genomet 6,15. Som sådan, kan framtida protokoll förbättras genom föreningar eller andra manipulationer som främjar BAF60C uttryck i hESCs.

På grund av sin unika förmåga att själv förnya bibehållen pluripotens är mänskliga embryonala stamceller (hESCs) anses vara en ovärderlig resurs i regenerativ medicin. Stamcells medierad återplantering av sjuka muskler och hESC-eller inducerade pluripotenta stamceller (IPSC)-härledda generation muskler för in vitro-modellering sjukdom är viktiga mål för studier som syftar till att identifiera behandlingar och belysa patogenesen av många neuromuskulära sjukdomar. Emellertid har dessa studier ifrågasatts av motståndet av hESCs att konvertera in i skelettmuskelceller och av bristen på information om den molekylära regleringen av hESC-engagemang för skelett myogenes. I själva verket, tidigare försök att generera muskelgångare från hESCs avslöjade att endast embryoid kropp (EB)-härledda avkommor eller mesenkymala celler är kompetent att aktivera skelett myogenes efter ektopisk uttryck för transkriptionsaktivatorer (t.ex.PAX3 eller Myf5) 1-3 eller genom exponering för specifika odlingsbetingelser 4-5. Vi har tidigare visat att SWI / SNF-komponent, BAF60C (kodas av SMARCD3), är en viktig del av den transkription maskiner som gör MyoD-medierad aktivering av muskel-specifika loci 6. Vi har nyligen upptäckt att den selektiva avsaknaden av BAF60C ger på hESCs motståndet mot MyoD-medierad aktivering av skelett myogenes 7 som annars observeras i BAF60C uttrycker somatiska celler 8-10, en process som vanligtvis benämns myogena konvertering. Tvångs uttryck för BAF60C möjliggör MyoD att direkt aktivera skelett myogenes i hESCs, på särskilda odlingsbetingelser, med BAF60C och MyoD om en epigenetisk signatur som begår hESCs mot myogenic härstamning 7. Notera avslöjade tidigare proteomik analys selektiv saknas BAF60C, bland SWI / SNF-komponenter, i ekonomiska och sociala råd 11. Vi använde denna kunskap för att införa en epigenetisk engagemang hESCs på myogenic härstamning, vilket leder till uppkomsten av en homogen population av skelett myoblasts som kan aggregeras för att bilda tredimensionella sammandragande strukturer (myospheres) som funktionellt härma miniatyriserade muskler 7. Faktum är vår metod för att generera muskelgångare från hESCs förlitar sig på den epigenetiska engagemang hESCs till myogenic härstamning, som är fenotypiskt latent tills cellerna utsätts för differentieringssignaler, till exempel cell aggregering och kultur i differentieringsmedium (se specifikt protokoll). Denna strategi möjliggör utbyggnaden av en homogen population av hESCs som epigenetiskt är engagerade i skelettmuskulaturen härstamning och lämplig för bildande av tredimensionella kontraktila myospheres som rekapitulera histologiska och funktionella egenskaper hos skelettmuskler. De myospheres ger det första beviset på miniatyriserade muskler exploaterbara för en &quot;sjukdom i en skål&quot; modell av muskelsjukdomar. Då genereras från patientens härrör iPSCs, dessa myospheres har potential att belysa långvariga utvecklings frågor och patogenesen av sällsynta sjukdomar, förutom att erbjuda den enorma potential som ett verktyg för hög throughput screening av terapeutiska föreningar. Vi noterar också att en omedelbar avläsning av myosphere analys skulle kunna tillhandahållas av immunohistokemi på sektioner, som beskrivs i en JUPITER protokoll från Gomes et al. 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Generation av en homogen och riklig population av skelettmuskelceller från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) är ett krav för cellbaserade terapier och för en &quot;sjukdom i en skål&quot; modell för mänskliga neuromuskulära sjukdomar. Stora hinder, såsom låg överflöd och heterogena populationen av intresse, samt en brist på protokoll för bildandet av tredimensionella kontraktila strukturer, har begränsat de tillämpningar av stamceller för neuromuskulära sjukdomar. Vi har utformat ett protokoll som övervinner dessa begränsningar genom ektopisk införa definierade faktorer i hESCs - muskeln bestämningsfaktorn MyoD och SWI / SNF kromatin remodeling komplex komponent BAF60C - som har möjlighet att programmera hESCs i skelettmuskelceller. Här beskriver vi det protokoll som upprättades för att generera hESC-derived myoblasts och främja deras klustring i tredimensionella miniatyriserade strukturer (myospheres) som funktionellt härma miniatyriserade muskler 7 </sup&gt;.

Figur 1A visar en schematisk bild av det protokoll som föreslagits för att generera myospheres från hESCs. De kritiska steg för att kontrollera (indikeras med pilar) är effektiviteten av infektionen i hESCs och myogena omställning inom de myospheres. I våra experiment tar vi fördel av en lentivirusvektor kodning BAF60C som bär GFP fluorescens. Vi infektera brukar cellerna med BAF60C och FACS-sorterings 72 timmar efter infektionen att anrika populationen uttrycker BAF60C. När cellerna når cirka 70-80% av sammanflöde, infektera vi med MyoD lentivirus. Efter den första infektionen tar det normalt två eller tre dagar för cellerna att nå denna sammanflödet. Figur 1B visar uttrycksnivåer av de exogena gener som veckningsinduktion relativt hESCs som inte är infekterade. Figur 1C visar expressionen och distribution på proteinnivå av de faktorer som införs. BAF60C<html> uttrycket visas som GFP-fluorescens, medan MyoD uttryck detekteras genom immunofluorescens med en MyoD antikropp. Vi anser Dag 0 den dagen vi börjar differentieringen av infekterade hESCs i EB-liknande aggregat. Efter 15 dagar i DM-medium är en del av de myospheres (vanligtvis en hel brunn) inbäddad i OCT-förening 12 och snittades för att utföra immunofluorescens för myogena markörer för att kontrollera effektiviteten myogenic omvandling. Figur 1D visar representativ färgning för myogenin och myosin tung kedja i en optimal myogena differentiering. Myospheres kan ha olika eller ovanliga former, kanske som ett resultat av fusion med mindre myospheres. Från och med dag 10, är det möjligt att observera sporadisk kontraktion i myospheres (se film 1 och 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. A) Schematisk bild av det protokoll som används för generering av myospheres från hESCs. B) mRNA-nivåer av de exogena gener i hESCs infekterade med BAF60C och MyoD (H9-BM) övervakas av QRT-PCR och uttryckt som faldig induktion, som jämfört med mock-infekterade hESCs (H9-CTR). C) Immunofluorescens-bilder som visar MyoD färgning (röd) och BAF60C fluorescens (grön) på grund av IRES-GFP-elementet i vektorn. D) Immunofluorescens utfördes på myosphere sektioner färgade för myogenin (MYOG ), myosin tung kedja (MyHC) och counterstained för DAPI (se Immun detaljer). Skala bar är 100 nm. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figur 2. Representativa bilder av cell utseende i olika skeden av denprotokoll från infektionen (del I) till differentieringen (del II). Skala bar är 100 nm. Av följande skäl: EB-liknande strukturer från d1 till d5 är oftast rund i formen (D), myospheres odlas under 15 dagar enligt schemat i Figur 1A presentera en oförutsägbar form och är heterogena i kultur; se två exempel i E och F.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Här beskriver vi ett protokoll som bygger på epigenetisk omprogrammering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) mot att generera en homogen population av skelettmuskelgångare som enligt tillåtodlingsbetingelser bildar tredimensionella kluster av kontraktila myofibers (myospheres), som rekapitulera biologiska funktioner i människo skelettmuskulaturen.

Generering av Myospheres Från hESCs genom epigenetiska omprogrammeringen

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Research

JoVE Journal

Biology

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Från MEFs till Matrigel I: Passaging hESCs i närvaro av MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Från MEFs till Matrigel 2: Dela hESCs från MEFs på Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Från MEFs till Matrigel 3: Passaging hESCs från Matrigel på Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generering av encelliga Suspensioner från mus nervvävnad

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera om musen Embryonala fibroblasts med en fyra transkriptionsfaktor, Doxycyklin inducerbara Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...