Name: helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00
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Este trabalho é apoiado por uma concessão Nacional Scientist Desenvolvimento da American Heart Association: 10SDG3500034 e UTMB-BCN arranque fundos para SSM. Os autores reconhecem as instalações Cryo-EM e computação científica no Centro Sealy de Biologia Estrutural em UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), bem como os drs. Steve Ludtke e Ed Egelman para obter ajuda com os algoritmos de reconstrução helicoidais 2D e 3D.

1. Exemplo de Preparação <ol><li> Humana troca de tampão de FVIII-14 e do BDD-FVIII porcino BDD 15 contra tampão HBS-Ca (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, pH = 7,4) e concentrado para 1,2 mg / ml. Manter a solução proteica à temperatura de -80 ° C. </li><li> Preparar os nanotubos de lípidos (LNT), misturando galactosilceramida (GC) e fosfatidilserina (PS) a 1:04 w / w proporção em clorofórmio. Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de árgon e solubilizar os l...

<ol>
	<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy.">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li><li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes.">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li><li>Toole, J. 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T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII.">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li><li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li><li>Egelman, E. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li><li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. 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Neste trabalho é apresentada uma metodologia para diferenciar entre duas entidades ligadas à membrana das proteínas altamente homólogas: FVIII humano e porcino auto-montada em nanotubos lipídicas nas condições encontradas no corpo humano. No processo descrito, o FVIII humano e porcino são organizados com sucesso de modo helicoidal em nanotubos de lípidos, que é a etapa mais crítica. O próximo passo crítico é o de preservar a amostra em gelo amorfo fi...

A coagulação sanguínea do Factor VIII (FVIII) é um grande glicoproteína de 2332 aminoácidos organizados em seis domínios: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Após a activação da trombina de FVIII actua como co-factor para o Factor IXa no complexo de tenase ligada à membrana. A ligação de FVIII activado (FVIIIa) em FIXa de um modo conforme a membrana melhora a eficiência proteolítica FIXa mais do que 10 5 vezes, o que é crítico para a eficiência da coagulação sanguínea 4. Apesar do papel importante do FVIII desempenha na coagulação e a formação do complexo tenase, a estrutura de FVIII ligado à membrana funcional ainda não foi resolvido. Para resolver esta questão, nanotubos de bicamada lipídica (LNT) ricos em fosfatidilserina (PS), capazes de FVIII de ligação com elevada afinidade 8, 9, e assemelhando-se a superfície de plaquetas activadas têm sido desenvolvidos 10. Organização helicoidal consecutiva de FVIII obrigado a LNT foi provado ser efetividadeve para a determinação da estrutura do FVIII estado ligado à membrana por Cryo-EM 5. Funcionalizado LNT são um sistema ideal para o estudo de proteínas de proteínas e interacções proteína-membrana de proteínas associadas à membrana de forma helicoidal organizadas por Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM tem a vantagem em relação aos métodos tradicionais estruturais, tais como cristalografia de raios-X e RMN, que o espécime é preservado em mais próximo do ambiente fisiológico (tampão, membrana, pH), sem aditivos e isótopos. No caso de FVIII, estudar a estrutura ligada a membrana com esta técnica é ainda mais relevante fisiologicamente, como o LNT assemelham pelo tamanho, forma e composição da pseudopodia das plaquetas activadas, onde os complexos TENase montar in vivo. Defeitos e deficiência de FVIII causa hemofilia A, uma doença hemorrágica grave que afeta 1 em cada 5.000 homens da população humana 4, 6. O mais eterapia ffective para hemofilia A é a administração do FVIII humano recombinante (hFVIII) ao longo da vida. Uma complicação importante da terapia de FVIII recombinante A hemofilia A é o desenvolvimento de anticorpos inibitórios para a forma humana que afecta aproximadamente 30% dos doentes com hemofilia A 13. Neste caso, o FVIII porcino (pFVIII) concentrado é usado, como FVIII exibe suína baixa reactividade cruzada com os anticorpos inibidores contra FVIII humano e formas de complexos funcionais com FIXa humano 7. Estabelecer a organização ligada à membrana de ambos suína e formas de FVIII humanos é importante para compreender a base estrutural da função co-fator FVIII e implicações para a hemostasia sangue. Neste estudo, descrevemos uma combinação de nanotecnologia lipídico, Cryo-EM, e a análise da estrutura concebida para resolver a organização ligada à membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas. Os dados Cryo-EM apresentados e estruturas 3D para porci helicoidal organizadone FVIII humano e em carregado negativamente LNT mostram o potencial da nanotecnologia proposto como base para a determinação da estrutura do FVIII e factores e complexos em um ambiente de membrana fisiológica coagulação ligadas à membrana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">JEM2100 with LaB6&#160;</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">JEM-2100</td>
			<td style="width:447px;">operated at 200 kV</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">with TEMCON software</td>
			<td style="width:205px;">JEOL Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan626 Cryo-holder</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">626.DH</td>
			<td style="width:447px;">cooled to -175 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">with temperature controler unit</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gatan 4K x 4K CCD camera</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">US4000</td>
			<td style="width:447px;">4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Solarus Model 950 plasma cleaner</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:205px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Materials</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">01821</td>
			<td style="width:447px;">plasma cleaned for 10 s on high power</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">Quantifoil R2/2 300 mesh</td>
			<td style="width:205px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Q225-CR2</td>
			<td style="width:447px;">Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td style="width:205px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">19481</td>
			<td style="width:447px;">1% solution, filtered</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:239px;">Galactosyl ceramide</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">860546</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td>
			<td style="width:205px;">Avanti Polar Lipids Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">840035</td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;"></td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Software</td>
			<td style="width:205px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">EM software Digital Micrograph</td>
			<td style="width:205px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">EM software EMAN</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">EM software Spider</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">EM software IHRSR</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;">Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (IMOD)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">EM software (SerialEM)</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">UCSF-Chimera</td>
			<td style="width:205px;">free download</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

helical organization of blood coagulation factor viii on lipid nanotubes

<html> A microscopia crio-electrão (Cryo-EM) é uma abordagem poderosa para investigar a estrutura funcional de proteínas e complexos em um ambiente de estado e da membrana hidratada 2. Factor de coagulação VIII (FVIII) 3 é um sistema multi-domínio de glicoproteína do plasma sanguíneo. Defeito ou deficiência de FVIII é a causa para o tipo de hemofilia A - um distúrbio de sangramento grave. Após a activação proteolítica, FVIII liga à serina-protease do Factor IX na membrana das plaquetas carregadas negativamente, que é crítica para a coagulação do sangue normal de 4. Apesar de o papel central de FVIII desempenha na coagulação, a informação estrutural para o seu estado ligado à membrana é incompleta 5. Concentrado de FVIII recombinante é o medicamento mais eficaz contra o tipo A hemofilia A e comercialmente disponível de FVIII pode ser expressa como o ser humano, ou de porcino, ambos os complexos funcionais que formam com o Factor IXa humano 6,7. &quot;&gt; Neste estudo apresentamos uma combinação de microscopia Cryo-elétron (Cryo-EM), a nanotecnologia ea estrutura lipídica análise aplicada para resolver a estrutura ligada à membrana das duas formas de FVIII altamente homólogas:. Humana e suína A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal das duas formas de FVIII recombinante funcional em nanotubos de lípidos carregados negativamente (LNT) é descrita. Os resultados representativos demonstram que a nossa abordagem é suficientemente sensível para determinar as diferenças na organização helicoidal entre os dois altamente homóloga em sequência (86% de identidade de sequência ) proteínas. protocolos detalhados para a organização helicoidal, Cryo-EM e tomografia eletrônica (ET) de aquisição de dados são dadas. The bidimensional (2D) e tridimensionais (3D) análise da estrutura aplicada para obter as reconstruções 3D de humanos e suínos FVIII-LNT é discutido. As estruturas de FVIII-LNT humana e porcina apresentados demonstram o potencial da metodologia proposta para Calculate a organização funcional, ligada à membrana de coagulação sanguínea do Factor VIII em alta resolução.

FVIII suína recombinante humana e foram organizadas com sucesso de modo helicoidal em carregada negativamente simples LNT bicamada, assemelhando-se à superfície das plaquetas activadas. Helicoidal A organização do humano e de porcino FVIII-LNT foi consistente ao longo das micrografias digitais recolhidas (Figura 2). A LNT controle eo humano e FVIII-LNT tubos helicoidais suínos foram selecionados e segmentado, com o GUI e2helixboxer.py e conjuntos de dados iniciais criados com a GU...

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Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos

Nós apresentamos uma combinação de microscopia de Cryo-electron, nanotecnologia lipídica, e a análise da estrutura aplicada para resolver a estrutura ligada a membrana de duas formas de FVIII altamente homólogas: humana e porcina. A metodologia desenvolvida em nosso laboratório para organizar de forma helicoidal as duas formas FVIII recombinante funcionais em nanotubos de lipídios negativamente carregados (LNT) é descrito.

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

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Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...