Name: in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det tyske Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF), den Systembiologi til signalering i Cancer (Helmholtz Alliance om Systembiologi) og den tyske Cancer Research Center (DKFZ).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for DKFZ. Forsigtig: For at undgå RNAse kontaminering af prøverne, tage grundlæggende forholdsregler for at undgå RNAse kontaminering og forberede alle buffere med DEPC-behandlet vand. 1.. Udarbejdelse af saccharosegradienter <ol><li> Forbered 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 og 50% sucrose løsninger (se tabel 1). Begynde at forberede gradienter ved langsomt at tilsætte 2 ml 50% saccharose-opløsning i bunden af ​​et polyallomer ultracentrifugerør. Frys lag ved at placere rørene i 20 minutter ved -80 ° C. </li><li> Tilsæt de efterfølgende lag på faldende saccharose procenter til nedfrysning trin i mellem, ender på 17,5% saccharose. Hold farveforløb på is under tilsætning af saccharose løsninger for at forhindre optøning af underliggende lag. </li><li> Forbered sucrosegradienter frisk en dag før brug og opbevar ved 4 ° C. Alternatively, forberede gradienter i forvejen, opbevares ved -80 ° C og optøning ved 4 ° C natten før forsøget. </li></ol> 2.. Vævspræparat (rygmarv og / eller hjerne) <ol><li> Bedøver musen ved en overdosis af xylazin og Ketamin i NaCl og transcardialt perfuse med 20 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) indeholdende 200 ug / ml CHX som immobiliserer ribosomer på tilknyttede transkripter. Bekræft korrekt bedøvelse af ikke-lydhørhed over tå trykker. </li><li> Uddrag væv hurtigt. Åbn baghovedet dorsalt og udtrække hjernen. Udfør laminektomi af hele torakal og lumbal rygsøjle og udtrække rygmarven. Brug hele hjernen (~ 400 mg) eller en 4 cm stykke af rygmarv (~ 90 mg). </li><li> Overfør væv i iskold homogeniseringspuffer A (se tabel 1) (rygmarv: 1 ml hjerne: 4 ml) og terninger i små stykker med en ren skalpel for at tillade øget optagelse af cycloheximid. Perforeretrm alle yderligere skridt på is. </li><li> Inkuber i 15 minutter og homogeniseres væv mekanisk ved hjælp af en Dounce-homogenisator. Nøje kontrolleret homogenisering er nødvendigt at sikre, at kerner forbliver intakt. Behandl alle prøver nøjagtig samme måde for at sikre sammenlignelighed. Bemærk: For hjernevæv: Disrupt væv med 5 slag med en tætsluttende pistil. For rygmarven væv: forstyrre med 5 slag med en løstsiddende pistil, efterfulgt af yderligere 5 slag med en tætsluttende pistil. </li><li> Tag portioner (400 pi for hjerne og 200 pi for rygmarven), flash fryse og opbevares ved -80 ° C for total RNA isolation. </li><li> Fjern kerner og uafbrudt celle og vævsfragmenter ved centrifugering ved 500 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Lavhastighedscentrifugering forhindrer tab af ribosomer. </li><li> Lyse membranfragmenter nuclei supernatant i 30 minutter ved tilsætning af NP-40 og natriumdeoxycholat vaskemidler (hver til en slutkoncentration på 1%). </li></ol><ol><li> Dette trin fjerner fede komponenter fra stikprøven, som ellers vil maskere signalet i polyribosome profil. Først præ-chill ultracentrifuge spande og rotor ved 4 ° C og forberede 2 M, 1,1 M og 0,9 M saccharose løsninger (se tabel 1). </li><li> Bland lysat med en 1,22 volumener af 2 M saccharoseopløsning og overføres til en polyethylen ultracentrifugerør. Fyld op alle rør til lige volumen på 10 ml med 1,1 M saccharoseopløsning, derefter overlejrer den omhyggeligt med 0,9 M rørsukkeropløsning. </li><li> Placer ultracentrifugerør i nedkølede ultracentrifuge spande. Centrifuger i 3 timer ved 100.000 x g ved 4 ° C. Under denne proces ribosomer blevet deponeret i pillen mens fede komponenter flyde op og forblive i supernatanten. </li></ol> 4.. Saccharosegradientfraktionering <ol><li> Fjern supernatanten og opløse pellet i homogeniseringspuffer B (se tabel 1 </strong&gt;). Absorbansen ved 260 nm for hver prøve ved anvendelse af en NanoDrop eller tilsvarende apparater og normalisere beløb at indlæse ifølge absorbansværdien. </li><li> Placer sucrosegradienter (fremstilling er beskrevet i et tidligere afsnit) i de præ-kølet ultracentrifuge spande. Layer prøver forsigtigt på toppen af ​​gradienten. Indsæt et blankt saccharosegradient som teknisk kontrol. </li><li> Juster vægten af ​​hver spand med homogeniseringsbuffer. Centrifugér prøver til 1,5 timer ved 285.000 x g ved 4 ° C. </li><li> Begynde at forberede den Isco fraktionator 30 min før udgangen af ​​centrifugering. Hvis der anvendes en anden model af fraktionator Følg producentens protokol. <ol><li> Indstil den passende følsomhed (0,2 AUFS til hjernen eller 0,05 AUFS for rygmarv) for UV-lampen og tænd den for at varme op. Saml rør piercer, skal den tilsluttes via det rullende pumpe til 60% rørsukkeropløsning gennem røret piercer. </li><li> Test opsætningen ved at pumpe saccharose (flow rottee: 1 ml / min), og navnlig sikre, at der ikke er nogen utætheder i slangerne, som vil indføre bobler i gradueringen. </li><li> Blank baggrund absorption ved manuelt at pumpe gradient buffer ind i UV-detektor og korrigere grundlinjen. </li></ol></li><li> Fjern forsigtigt ultracentrifuge spande indeholdende saccharosegradienter med sedimenterede prøver fra rotoren og læg dem på is. Undgå enhver bumpe af farveforløb for at forhindre tab af opløsning. </li><li> Kør farveforløb på fraktioneringsapparatet. Kør tomme stigninger først at vurdere baggrunden absorption og sikre korrekt teknisk setup. <ol><li> Fastgør gradient til UV-detektor og gennembore bunden af ​​røret med røret piercer. Start pumpning af 60% sucrose, som vil fortrænge gradienten med aflejrede prøver opad gennem UV-detektor og ind dråbeanordning. </li><li> Absorbansen ved 260 nm er dokumenteret at generere absorptionsprofilen for prøven, med toppe, der angiver aflejringertion af mRNAer forbundet med ribosomale subunits, monosomer og efterfølgende stigende antal ribosomer. </li></ol></li><li> Indsamle prøver i 20 fraktioner via dråbeanordning (600 pi hver, i 2 ml rør). </li></ol> 5.. RNA Isolation fra enkelte fraktioner <ol><li> Tilsæt 10% SDS til en slutkoncentration på 1% for de enkelte fraktioner og blandes godt for at udfolde proteiner og dissociere ribosomer. På dette tidspunkt prøver kan fryses ved -80 ° C. Afhængig af spørgsmål, der skal behandles, kan fraktioner pooles efter absorbansen profil. </li><li> Isoler RNA med sur phenol / chloroform-ekstraktion, som også fjerner forurenende spor af DNA. <ol><li> Tilsæt en volumen sur phenol / chloroform (forvarmet til RT) til hver prøve, varme i 10 minutter ved 65 ° C og frigivelse tryk under stinkskabet bagefter. </li><li> Centrifugér prøver i 20 minutter ved 17.000 x g ved stuetemperatur. Overføre forsigtigt vandige fase til en ny 1,5 mlrør. Vær opmærksom på fase inversion i tættere sucrose fraktioner, hvor den vandige fase kan være på bunden efter centrifugering. </li><li> Tilsæt en volumen isopropanol, 1/9 volumen natriumacetat (pH 5,2) og 1 pi GlycoBlue til hver prøve for at udfælde RNA. Opbevare prøver mindst 1 time ved -80 ° C. </li><li> Centrifuger i 30 minutter ved 17.000 xg og 4 ° C. GlycoBlue giver visualisering af bundfaldet. Fjern supernatanten, vask pellet én gang med iskold 80% ethanol og luft tør pille. Opløs pellet i RNAse frit vand. </li></ol></li><li> Kvantificere mængden af ​​RNA ved NanoDrop og analysere RNA integritet ved en Bioanalyzer chip. RNA, som opnås ved den præsenterede protokol er velegnet til alle topmoderne analyser med høj kapacitet, herunder microarray og dyb sekventering. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Ingen interessekonflikt deklareret.

Selv polyribosome fraktionering er ikke en ny teknik, er det stadig en særdeles udfordrende. Baseret på input-materiale, kan væsentlig optimering være nødvendig. Dette er især tilfældet for in vivo CNS prøver, når mængden af materiale er ofte en begrænsning og fede vævskomponenter hindre isolering af oversætte mRNA&#39;er. Mest offentliggjorte fraktioneringstrin protokoller behandle gær eller mammale cellelinjer, og der er etablerede protokoller for hjernen 12,13,14. I modsætning hertil er der næppe nogen publikationer, der beskriver fraktionering af rygmarv, og tidligere protokoller kræver rygmarv fra et stort antal dyr, der skal pooled 15.. Af disse grunde blev der flere væsentlige ændringer foretages for at tilpasse fraktionering protokol for CNS-væv, herunder enkelt mus rygmarven. Ribosom immobilisering med cycloheximid udføres under dyretransporter perfusion at undgå dissociation af ribosomer During den lange proces af væv ekstraktion. Efterfølgende polysomalt RNA udvindes på en bestemt måde for at maksimere polyribosome udbytte. Først kontrolleres homogenisering af væv ved douncing holder kernen intakt og forhindrer DNA-kontaminering. Kernen fjernes derpå pålideligt ved centrifugering. Kombinationen af ​​de detergenter NP-40 og natriumdeoxycholat sikrer lysis af det endoplasmatiske reticulum og frigivelse af dets membranassocierede ribosomer. Desuden UV-absorberende komponenter i lipidrig myelin tilsløre polyribosome profiler. Myelin flotation er derfor nødvendigt, hvis tætte forbindelser, såsom polyribosomer pelleteres og lettere forbindelser, såsom myelin flyde og fjernes 16. Polyribosomer derefter sedimenteret i en 17,5% til 50% saccharosegradient. Stedet for manuelt lagdeling og frysning hver saccharose lag kan gradienter også fremstilles under anvendelse af en gradient mixer. Ekstraktion af RNA fra fraktioner under anvendelse af sure phenol / chloroform giver DNA fjernes med minimal RNA tab. Dog kan faseinversion forekomme ved tætte sucrose fraktioner (ovennævnte fraktion 16). Denne protokol giver fordele i forhold til andre konventionelle metoder, der fokuseres på omfanget af oversættelsen. For eksempel har både målingen af ​​fosforyleret S6 (en fremtrædende oversættelse markør) samt mærkning af spirende kæder med radioisotoper giver oplysninger om globale oversættelse niveauer, men afslører lidt om, hvad der specifikt er ved at blive oversat. Polyribosome fraktionering, på den anden side, ikke kun tillader vurdering af den globale oversættelse, men også af identitet oversætte mRNAs og de dermed forbundne regulatoriske proteiner. Kvantitativ real time PCR kan udføres på isolerede RNA til en hurtig læsning af udvalgte mRNAs, og microarrays og næste generation RNA sekventering kan udføres for genom studier. De optimeringer præsenteres her tillader teknikken skal bruges med minimale mængder af CNS-væv, derfor aftagening af antallet af dyr, der er nødvendigt, og forbedring af den samlede eksperimentel kvalitet ved at reducere væv behandlingstid. På den anden side kan denne teknik ikke skelne Stalled ribosomer fra oversætte dem. Udskrifter transporterer fastkørte ribosomer vil sedimentere i de tunge fraktioner, og det bør holdes for øje i tolkningen af ​​data. Der er de seneste rapporteret teknikker, nemlig RiboTaq og TRAP, hvor ribosomer er mærket med epitopmærker eller journalister i henholdsvis en celletype specifik måde og tilhørende mRNAs isoleret ved immunoudfældning 17,18. Denne teknik kan kobles til polyribosome fraktionering at tilbyde høj opløsning udlæses til specifikke cellepopulationer. Ribosom mund-udskrivning er en anden ny teknik, der involverer nuklease fordøjelse til at generere små fragmenter, eller &quot;fodspor&quot;, af mRNAs, der er beskyttet af ribosomer. Biblioteker dannes derefter ud fra disse fodspor og sekventeret. Denne metode PROVIdes en codon-specifikke hele genomet analyse på oversættelse og er i stand til at identificere fastkørte ribosomer, ikke-Aug startkodoner og små opstrøms åbne læserammer, som ikke kan opnås ved polyribosome fraktionering 19. Dog kan polyribosome fraktionering kobles til ribosomet profilering til isolering af nedbrudte fragmenter, der indeholder en enkelt ribosomer, og dermed berigende for de molekylære arter, der er nødvendige for bibliotek forberedelse i hvor høj prøve renhed er ofte påkrævet. Tilsammen polyribosome fraktionering er en fleksibel metode med varig betydning og kan kobles til forskellige efterfølgende anvendelser, herunder genom assays som næste generation sekventering.

Genekspression er bestemt af den kombinerede virkning af transkription, translation og stabilitet af mRNA og proteiner med oversættelse bærer mest fremherskende effekt 1. Det er nu klart, at hvert af disse trin, er stærkt reguleret. Micro-RNA, dannelse af RNA-granulat, alternative og cytoplasmatisk polyadenylering er nogle eksempler på post-transkriptionel regulering af genekspression 2,3. Hver af disse mekanismer afkobler transskription fra oversættelse og påvirker proteom i det biologiske system af interesse. Således overraskende, mRNA niveauer alene er en ufuldkommen udlæsning af protein niveau 4. Kvantitativ proteomics giver den mest direkte vurdering af genekspression, men på trods af de seneste fremskridt, er der stadig betydelige begrænsninger på følsomhed og protein sekvens opløsning. Derfor løse translatome, repertoire oversætte mRNAs, tilbyder en fremragende kompromis mellem at studeretranskriptom og proteomanalyse. Det er mere præcis end transcriptomics i vurderingen af ​​den endelige genekspression, og giver både højere dækning og sekvens opløsning end proteomics. I pattedyr systemer, de fleste af oversættelse begivenheder begynder via cap-afhængige indvielse. En gruppe af eukaryote initiation faktorer sammen med 40S lille ribosomale underenhed samle på 5&#39;-cap-af et mRNA. Komplekset scanner derefter mRNA og efter at have nået startkodonen AUG rekrutterer den 60S store ribosomale underenhed at danne en komplet 80S ribosom. Forlængelsen fase forløber med ribosomet bevæger sig langs mRNA med forlængelsesegenskaber faktorer bistå inkorporering af aminosyrer fra belastede tRNAs til den spirende peptidkæde. Flere ribosomer kan fortsætte langs en ​​enkelt mRNA samtidigt og har vist sig at antallet af tilknyttede ribosomer at korrelere med hastigheden af proteinsyntese 5,6. Dette gør ribosomale lastning en pålidelig indikation for translation og tillader adskillelse af aktivt oversætte mRNA&#39;er baseret på sedimentationshastighed. Ud over at kvantificering af oversætte mRNAs kan sekvens information opnås at identificere motiver involveret i oversættelse regulering. RNA Også bindende proteiner og andre oversættelse faktorer kan isoleres fra forskellige fraktioner, lette undersøgelsen og opdagelsen af ​​beslægtede regulatoriske proteiner. I nervesystemet er translationel kontrol er bundet til processer, såsom mRNA oplagring, transport og lokalt proteinsyntese. Vækstkegler har vist sig at være bærere af en specifik lokaliseret pool af mRNA&#39;er er adskilt fra resten af Axon 7. Desuden axoner besidder evnen til lokalt at syntetisere proteiner 8,9. Som et resultat heraf, har lokal styring af oversættelse blevet en afgørende emne for undersøgelse i neurobiologi. Potentiale polyribosome fraktionering at løse dette er illustreret i flere undersøgelser, hvor teknikken blev anvendt til atundersøge Axon vejledning i rygmarv udvikling, og demonstrerede aktiviteten-afhængige oversættelse af BDNF i hjernen 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Flere processer er involveret i genekspression, herunder transkription, translation og stabiliteten af ​​mRNA&#39;er og proteiner. Hvert af disse trin er stramt reguleret, hvilket påvirker den endelige dynamik af protein overflod. Forskellige reguleringsmekanismer findes ved omregning trin, rendering mRNA niveauer alene en upålidelig indikator for genekspression. Desuden har den lokale regulering af mRNA translation været særligt involveret i neuronale funktioner, skiftende &#39;translatomics&#39; til fokus i neurobiologi. Den præsenterede metode kan bruges til at bygge bro transcriptomics og proteomics. Her beskriver vi væsentlige ændringer af teknikken med polyribosome fraktionering, der afhører translatome baseret på foreningen af ​​oversatte aktivt mRNAs til flere ribosomer og deres differentieret sedimentation i saccharosegradienter. Traditionelt arbejder med in vivo prøver, især i central nervesystem (CNS), har vist sig udfordrende på grund af de begrænsede mængder materiale og tilstedeværelsen af ​​fedtvæv komponenter. For at afhjælpe dette, er den beskrevne protokol specifikt optimeret til brug med minimal mængde af CNS-materiale, som påvist ved anvendelse af enkelt mus rygmarv og hjerne. Kort fortalt, er CNS-væv udvundet og oversætte ribosomer er immobiliserede på mRNA&#39;er med cycloheximid. Myelin flotation udføres derefter for at fjerne lipidrige komponenter. Fraktionering udføres på en saccharosegradient hvor mRNA&#39;er adskilles efter deres ribosomale belastning. Isolerede fraktioner er egnet til en række af downstream analyser, herunder nye genom bred assay teknologier.

Figur 2 viser repræsentative polyribosome profiler efter fraktionering. Profilerne af hjernen og rygmarven viser karakteristiske absorptionskurver som beskrevet ovenfor til cellelinier. mRNAer bundet til små ribosomale subunits (40S) sediment ved lettere fraktioner og vises først som et højdepunkt på profilen, efterfulgt af den store ribosomale subunit (60S) og monosome (80S) bundet mRNA&#39;er. mRNAer bundet til flere ribosomer sediment ved tungere fraktioner, med den senere toppe indikerer stigende antal bundne ribosomer. Global oversættelse kan vurderes ud fra profilen. Som et eksempel hjernevæv har en højere polyribosome at monosome forhold end rygmarvsvæv, der mere aktiv oversættelse. RNA ekstraheret fra enkelte fraktioner blev vurderet ved Bioanalyzer, viser fordelingen af ​​18S og 28S rRNA. 18S rRNA forekommer tidligere i profilen i overensstemmelse med de små ribosomale subunits sedimenterer i lettere Sucr<html> OSE fraktioner. Typiske udbytter af total RNA er 10-20 mg for hjerne og 2-4 ug til rygmarven. RNA-udbyttet fra de enkelte fraktioner er op til 4 ug og 0,8 ug til hjernen og rygmarven, afhængig af fraktionen. En tom saccharosegradient allerede viser nogle baggrund absorption ved 260 nm, på grund af tilstedeværelsen af ​​DTT. Denne baggrund kan fratrækkes i dataanalyse med henblik på at normalisere prøve værdier. EDTA-behandling kollapsede de polyribosome toppe, hvilket demonstrerer sedimentation profil skyldes oversættelse. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Arbejdsgang og potentielle anvendelser af in vivo polyribosome fraktionering.&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Figur 2. (A) Typiske polyribosome profiler af hjernen og rygmarven, og vurdering af ekstraheret RNA ved Bioanalyzer. (B) Fordeling af GAPDH-mRNA i fraktioner ved QRT-PCR. (C) Polyribosome profiler af tomme gradient og hjerne med og uden EDTA-behandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x gradient buffer </td><td> 30 mM Tris-HCI pH 7,4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml cycloheximid (CHX), 2 mM dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucroseopløsning 17,5% </td><td> 8,67 g sucrose, 25 ml 2x gradient puffer op til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucroseopløsning 25,6% </td><td> 12,8 g saccharose, 25 ml 2x gradient puffer op til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucroseopløsning 33,8% </td><td> 16,9 g saccharose, 25 ml 2x gradient puffer op til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucroseopløsning 41,9% </td><td> 20,95 g sucrose, 25 ml 2x gradient puffer op til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucroseopløsning 50% </td><td> 25 g saccharose, 25 ml 2x gradient puffer op til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeniseringpuffer A </td><td> 0,25 M saccharose, 50 mM Tris / HCI, pH 7,4), 5 mM MgCl2, 25 mM KCI </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche komplet proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M sucroseopløsning </td><td> 68,4% sucrose, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche komplet proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1,1 M sucroseopløsning </td><td> 38,5% sucrose, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche komplet proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 mio sucroseopløsning </td><td> 30,8% sucrose, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche komplet proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization puffer B </td><td> 0,25 M saccharose, 50 mM Tris / HCI, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCI, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche komplet proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabel 1.. Liste af buffere og løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Denne protokol illustrerer væsentlige modifikationer af polyribosome fraktionering med henblik på at studere translatome in vivo CNS prøver. Det giver mulighed for en samlet vurdering af oversættelse og transkription regulering gennem isolation og sammenligning af total RNA til ribosom bundne RNA fraktioner.

In vivo Afhøring af centralnervesystemet Translatome af Polyribosome Fraktionering

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging af stamcelle implantation i det centrale nervesystem mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produktion af lentivirusvektorer til transduktion af celler fra det centrale nervesystem

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Mærkning af enkeltceller i centralnervesystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm at undersøge centrale nervesystem reparation i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Delivery of Drugs til Rodent centrale nervesystem

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering af Rodent centralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funktionel Evaluering af biologisk Neurotoksiner i Networked Kulturer af stamceller afledt centralnervesystemet neuroner

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidige<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functional Test af to nethinder af<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...