Name: in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Systems Biology van Signalering in Cancer (Helmholtz Alliance op Systems Biology) en het Duitse Centrum van het Kankeronderzoek (DKFZ).

Alle dierproeven werden uitgevoerd conform de institutionele richtlijnen van de DKFZ. Let op: Om RNAse besmetting van de monsters te voorkomen, nemen elementaire voorzorgsmaatregelen voor het vermijden van RNAse vervuiling en bereiden alle buffers met DEPC behandeld water. 1. Voorbereiding van sucrosegradiënten <ol><li> Bereid 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 en 50% sucrose oplossingen (zie tabel 1). Bereid gradiënten door langzaam toevoegen van 2 ml 50% sucrose oplossing naar de bodem van een polyallomer ultracentrifuge buis. Freeze de laag door het plaatsen van buizen voor 20 min bij -80 ° C. </li><li> Voeg de volgende lagen op het verminderen van sucrose percentages met bevriezing tussenliggende stappen, belanden tot 17,5% sucrose. Houd gradiënten op ijs tijdens toevoeging van sucrose oplossingen om het ontdooien van de onderliggende lagen te voorkomen. </li><li> Bereid sucrosegradiënten vers een dag voor gebruik en bewaar bij 4 ° C. Alternatively bereiden gradiënten vooraf opslag bij -80 ° C en ontdooien bij 4 ° C de nacht vóór het experiment. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding (ruggenmerg en / of de hersenen) <ol><li> Verdoven muis door een overdosis Xylazin en Ketamin NaCl en transcardiaal perfuseren met 20 ml Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) bevattende 200 ug / ml CHX die op ribosomen verbonden transcripten immobiliseert. Bevestig de juiste verdoving door niet-ontvankelijkheid tot teen wringt. </li><li> Extract weefsel snel. Open de schedel dorsaal en haal de hersenen. Voer laminectomie van de gehele thoracale en lumbale wervelkolom en pak het ruggenmerg. Gebruik hele brein (~ 400 mg) of een 4 cm stuk ruggenmerg (~ 90 mg), respectievelijk. </li><li> Transfer weefsel in ijskoude homogenisering buffer A (zie tabel 1) (ruggenmerg: 1 ml; hersenen: 4 ml) en dobbelstenen in kleine stukjes met een schone scalpel tot een verhoogde opname van cycloheximide toestaan. Perform alle verdere stappen op het ijs. </li><li> Incubeer gedurende 15 min en homogeniseren weefsel mechanisch met behulp van een Dounce homogenisator. Zorgvuldig gecontroleerde homogenisering is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de kernen intact blijven. Behandel alle monsters precies dezelfde manier de vergelijkbaarheid te waarborgen. Opmerking: voor hersenweefsel: Onderbreek weefsel door 5 slagen met een goed sluitend stamper. Voor ruggenmergweefsel: verstoren door 5 slagen met een los aanliggende stamper, gevolgd door 5 verdere slagen met een goed sluitend stamper. </li><li> Neem monsters (400 ul voor de hersenen en 200 ul van het ruggenmerg), flash bevriezen en bewaar bij -80 ° C voor totale RNA isolatie. </li><li> Verwijder kernen en ongestoorde cellen en weefsels fragmenten door centrifugatie bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Lage snelheid centrifugeren voorkomt verlies van ribosomen. </li><li> Lyse membraanfragmenten in de kernen supernatant gedurende 30 min door toevoeging van NP-40 en natriumdeoxycholaat detergentia (elk een eindconcentratie van 1%). </li></ol><ol><li> Deze stap verwijdert vettige componenten van het monster die anders het signaal maskeren in de polyribosome profiel. Eerste, pre-chill ultracentrifuge emmers en rotor bij 4 ° C en voor te bereiden 2 M, 1,1 M en 0,9 M sucrose oplossingen (zie tabel 1). </li><li> Meng lysaat met 1,22 volumina 2 M sucrose-oplossing en over in een polyethyleen buis ultracentrifuge. Vul alle buizen op gelijke volume van 10 ml met 1,1 M sucrose-oplossing, daarna overlay voorzichtig met 0,9 M sucrose-oplossing. </li><li> Plaats de ultracentrifuge buizen in de pre-gekoelde ultracentrifuge emmers. Centrifugeer gedurende 3 uur bij 100.000 xg bij 4 ° C. Daarbij ribosomen worden afgezet in de pellet terwijl vetcomponenten zweven en blijven in de supernatant. </li></ol> 4. Sucrosegradiënt Fractionering <ol><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en los pellet in homogenisering buffer B (zie tabel 1 </strong&gt;). Meet de absorptie bij 260 nm voor elk monster met een Nanodrop of gelijkwaardige apparaten en normaliseren bedraagt ​​laden volgens de absorptiewaarde. </li><li> Plaats sucrose gradiënten (bereiding beschreven in een vorige sectie) in het voorgekoeld ultracentrifuge emmers. Laag monsters voorzichtig bovenop de gradiënt. Voeg een lege sucrosegradiënt als technische controle. </li><li> Stel het gewicht van elke emmer met homogenisering buffer. Centrifugeer de monsters gedurende 1,5 uur bij 285.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Beginnen met de voorbereiding van de Isco fractioneerinrichting 30 min voor het einde van centrifugeren. Als een ander model fractioneerinrichting wordt gebruikt, volgt het protocol van de fabrikant. <ol><li> Stel de juiste gevoeligheid (0,2 AUFS voor hersenen of 0,05 AUFS voor ruggenmerg) voor de UV-lamp en zet hem aan om op te warmen. Monteer de buis piercer, sluit deze via de rollende pomp tot 60% sucrose-oplossing door de buis piercer. </li><li> Test de instellingen door het pompen van sucrose (stroom rate: 1 ml / min), met name ervoor zorgen dat er geen lekken in de leidingen die belletjes in het verloop zal introduceren. </li><li> Lege achtergrond absorptie door handmatig pompen gradiëntbuffer in de UV-detector en het corrigeren van de basislijn. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig de ultracentrifuge emmers met daarin de sucrosegradiënten met gesedimenteerde monsters van de rotor en leg ze op ijs. Vermijd stoten van hellingen tot verlies van de resolutie voorkomen. </li><li> Run gradiënten op de fractioneerinrichting. Start eerst naar de achtergrond absorptie evalueren en zorgen voor een goede technische opzet leeg gradiënten. <ol><li> Bevestig verloop op de UV-detector en doorboren de bodem van de buis met de buis piercer. Start de pompen van 60% sucrose, wat het verloop zal verdringen met gesedimenteerd monsters naar boven door de UV-detector en in de druppel dispenser. </li><li> De absorptie bij 260 nm wordt vastgelegd op de absorptieprofiel van het monster te genereren, met pieken vermelding van de sedimentatie van mRNA&#39;s geassocieerd met ribosomale subeenheden, monosomes, en vervolgens toenemend aantal ribosomen. </li></ol></li><li> Verzamel monsters in 20 fracties via de druppel dispenser (600 pl elk, in 2 ml buizen). </li></ol> 5. RNA isolatie van Individual Breuken <ol><li> Voeg 10% SDS tot een eindconcentratie van 1% tot individuele fracties en meng goed om eiwitten ontvouwen en dissociëren ribosomen. Op dit moment monsters bij -80 ° C worden ingevroren Afhankelijk van de vraag te behandelen, kunnen fracties worden samengevoegd volgens het absorptieprofiel. </li><li> Isoleer RNA met zure fenol / chloroform extractie, die ook verwijdert verontreinigende sporen van DNA. <ol><li> Voeg een volume zure fenol / chloroform (voorverwarmd tot KT) aan elk monster gedurende 10 minuten bij 65 ° C en drukloos onder de zuurkast daarna. </li><li> Centrifuge monsters gedurende 20 min bij 17.000 xg bij kamertemperatuur. Overdragen waterfase voorzichtig naar een nieuwe 1,5 mlbuis. Let op faseomkering in dichtere sucrose fracties, waarbij de waterige fase kan daarbij beneden na centrifugeren. </li><li> Voeg een volume isopropanol, 1/9 volume natriumacetaat (pH 5,2) en 1 pi GlycoBlue aan elk monster om RNA te precipiteren. Houd monsters minimaal 1 uur bij -80 ° C. </li><li> Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 17.000 xg en 4 ° C. GlycoBlue levert visualisatie van de pellet. Verwijder supernatant, wassen pellet een keer met ijskoude 80% ethanol en drogen aan de lucht pellet. Los de pellet in RNAse vrij water. </li></ol></li><li> Kwantificeren hoeveelheid RNA door Nanodrop en te analyseren RNA integriteit door een Bioanalyzer chip. RNA dat wordt verkregen door de gepresenteerde protocol is geschikt voor alle geavanceerde high throughput assays zoals microarray en diepe sequencing. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Geen belangenconflict verklaard.

Hoewel polyribosome fractionering is geen nieuwe techniek, het blijft een bijzonder uitdagend. Gebaseerd op het uitgangsmateriaal, kan aanzienlijk optimalisatie nodig zijn. Dit is vooral het geval voor in vivo CNS monsters, waarbij de hoeveelheid materiaal is vaak een beperking en vetweefsel componenten isolatie van het vertalen van mRNA&#39;s belemmeren. De meeste gepubliceerde protocollen fractionering behandelen gist of zoogdierlijke cellijnen, en er zijn vastgestelde protocollen voor de hersenen 12,13,14. In tegenstelling, zijn er nauwelijks publicaties waarin fractionering van het ruggenmerg, en eerdere protocollen vereisen ruggenmerg van een groot aantal dieren dat mag worden samengevoegd 15. Daarom werden een aantal essentiële aanpassingen aan de fractionering protocol aanpassen voor CNS weefsels, waaronder enkele muis ruggenmerg. Ribosoom immobilisatie met cycloheximide wordt uitgevoerd tijdens dier perfusie om dissociatie van ribosomen Durin voorkomeng het lange proces van weefsel-extractie. Vervolgens worden polysomal RNA geëxtraheerd in een bepaald wijze polyribosome maximaal rendement. Ten eerste gecontroleerde homogenisering van het weefsel door douncing, houdt de kern intact en voorkomt DNA verontreiniging. De kern wordt vervolgens volledig verwijderd door centrifugeren. De combinatie van detergentia NP-40 en natriumdeoxycholaat zorgt lysis van het endoplasmatisch reticulum en het vrijgeven van de membraan geassocieerde ribosomen. Bovendien, UV-absorberende componenten binnen de vetrijke myeline verdoezelen polyribosome profielen. Myeline beursgang is daarom noodzakelijk, waar dichte verbindingen zoals polyribosomen worden afgedraaid en lichtere verbindingen zoals myeline float en worden verwijderd 16. Polyribosomen worden vervolgens gesedimenteerd dan 17,5% tot 50% sucrose gradiënt. In plaats van het handmatig gelaagdheid en het bevriezen van elke sucrose laag, kan gradiënten ook worden bereid met behulp van een gradiënt mixer. Extractie van RNA uit fracties met zure fenol / chloroform maakt DNA worden verwijderd met minimale RNA verlies. Kunnen echter faseomkering plaatsvinden op dichte sucrose fracties (bovengenoemde component 16). Dit protocol verschaft voordelen ten opzichte van andere conventionele werkwijzen die het niveau van translatie pakken. Bijvoorbeeld, zowel het meten van gefosforyleerde S6 (een prominente vertaling merker) en de etikettering van ontluikende ketens met radioisotopen geven informatie over wereldwijde vertaaldiensten niveau maar weinig zeggen wat specifiek wordt vertaald. Polyribosome fractionering, anderzijds, kan niet alleen de beoordeling van globale vertaling, maar ook de identiteit vertalen mRNA en bijbehorende regulerende eiwitten. Kwantitatieve real time PCR kan worden uitgevoerd op geïsoleerde RNA&#39;s voor een snelle uitlezing van geselecteerde mRNA, en microarrays en de volgende generatie RNA sequencing kan voor genoomwijde studies worden uitgevoerd. De hier gepresenteerde optimalisaties kan de techniek worden gebruikt met minimale hoeveelheden CNS weefsels derhalve verminderening het aantal dieren dat nodig is en het verbeteren van de algehele experimentele kwaliteit door het verminderen van weefsel verwerkingstijd. Aan de andere kant, kan deze techniek niet Outlook is geïnstalleerd ribosomen onderscheiden van het vertalen van degenen. Afschriften dragen vastgelopen ribosomen zal neerslaan in de zware fracties, en dit moet in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van de gegevens. Er zijn recent gerapporteerd technieken, namelijk RiboTaq en TRAP, waarbij ribosomen zijn gelabeld met epitoop tags of reporters respectievelijk een celtype-specifieke wijze en bijbehorende mRNA geïsoleerd door immunoprecipitatie 17,18. Deze techniek kan worden gekoppeld aan fractionering polyribosome hoge resolutie lezen voor specifieke celpopulaties bieden. Ribosoom mond-printen is een andere nieuwe techniek die nucleasedigestie gaat om kleine fragmenten te genereren, of &quot;voetafdrukken&quot;, van mRNA&#39;s die worden beschermd door ribosomen. Bibliotheken worden vervolgens gegenereerd uit deze voetafdrukken en gesequenced. Deze methode provIDE een codon-specifieke Volledige genoomanalyse vertaling en kan vastgelopen ribosomen identificeren, niet-AUG start codon en kleine upstream open reading frames, die niet kan worden bereikt door fractionering polyribosome 19. Toch kan polyribosome fractionering worden gekoppeld aan ribosoom profilering voor isolatie van verteerd fragmenten die enkel ribosomen, dus verrijkend voor de moleculaire species die nodig is voor de bibliotheek preparaat waarin hoge zuiverheid van het monster is vaak nodig. Tezamen polyribosome fractionering is een flexibele methode blijvende betekenis en kan gekoppeld worden aan verschillende stroomafwaartse toepassingen, waaronder genomische assays zoals next-generation sequencing.

Genexpressie wordt bepaald door de gecombineerde werking van transcriptie, translatie en stabiliteit van mRNA en eiwitten, de vertaling met het meest overheersende effect 1. Het is nu duidelijk dat elk van deze stappen is sterk gereguleerd. Micro-RNA, vorming van RNA korrels, alternatieve en cytoplasmatische polyadenylatie zijn enkele voorbeelden van post-transcriptionele regulatie van genexpressie 2,3. Elk van deze mechanismen ontkoppelt transcriptie uit de omrekening en beïnvloedt het proteoom in het biologische systeem van belang. Dus, niet verwonderlijk, mRNA niveaus alleen zijn een imperfecte uitlezing van eiwit niveaus 4. Kwantitatieve proteomics biedt de meest directe bepaling van genexpressie, maar ondanks de recente ontwikkelingen, er nog steeds aanzienlijke beperkingen gevoeligheid en eiwitsequentie resolutie. Daarom is het aanpakken van de translatome, het repertoire van het vertalen van mRNA&#39;s, biedt een uitstekend compromis tussen het bestuderen van detranscriptoom en proteoom. Het is nauwkeuriger dan transcriptomics bij de beoordeling van de definitieve genexpressie, en biedt zowel hogere dekking en volgorde resolutie dan proteomics. In zoogdiersystemen, de meeste vertaling gebeurtenissen beginnen via cap-afhankelijke initiatie. Een groep van eukaryote initiatie factoren samen met de 40S kleine ribosomale subunit verzamelen op kap van een mRNA de 5 &#39;. Het complex scant vervolgens het mRNA en bij het bereiken van de startcodon augustus, werft de 60S grote ribosomale subeenheid vormen een complete 80S ribosoom. De rek fase verloopt het ribosoom bewegen langs het mRNA met verlengingsfactoren helpen de opname van aminozuren van geladen tRNA naar de ontluikende peptideketen. Meerdere ribosomen kan gaan langs een mRNA gelijktijdig en het aantal ribosomen verbonden is getoond te correleren met de mate van eiwitsynthese 5,6. Dit maakt ribosomal laden een betrouwbare indicatie voor translation en maakt scheiding van actief vertalen van mRNA&#39;s op basis van bezinking. Naast de kwantificering van het vertalen van mRNA&#39;s, kunnen sequentie-informatie worden verkregen motieven betrokken bij de vertaling regelgeving te identificeren. RNA ook bindende eiwitten en andere vertaling factoren kunnen worden geïsoleerd uit verschillende fracties, de studie en de ontdekking van verwante regulerende eiwitten vergemakkelijken. In het zenuwstelsel is translationele controlesignalen gekoppeld aan processen zoals mRNA opslag, transport en plaatselijke eiwitsynthese. Groeikegels is aangetoond dat een bepaalde gelokaliseerde pool van mRNA onderscheiden van de rest van het axon 7 haven. Bovendien axonen bekwaam lokaal synthetiseren eiwitten 8,9. Als gevolg hiervan heeft de lokale controle van de vertaling uitgegroeid tot een cruciaal onderwerp van studie in de neurobiologie. Het potentieel van polyribosome fractionering deze pakken is geïllustreerd in verschillende studies, waarbij de techniek gebruikt omonderzoeken axon begeleiding in het ruggenmerg ontwikkeling, en toonde de activiteit-afhankelijke vertaling van BDNF in de hersenen 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Meerdere processen zijn betrokken bij genexpressie waaronder transcriptie, translatie en de stabiliteit van mRNA en eiwitten. Elk van deze stappen wordt strak gereguleerd, waardoor de uiteindelijke dynamiek van eiwitgehalte. Verschillende regulerende mechanismen bestaan ​​op het vertalen stap, waardoor mRNA niveaus alleen een onbetrouwbare indicator van genexpressie. Daarnaast heeft de lokale regulatie van mRNA translatie is vooral betrokken bij neuronale functies verschuiven &#39;translatomics&#39; om de focus van de aandacht in de neurobiologie. De gepresenteerde methode kan gebruikt worden om de brug transcriptomics en proteomics. Hier beschrijven we essentiële aanpassingen aan de techniek van polyribosome fractionering, die de translatome ondervraagt ​​op basis van de vereniging van actief vertaald mRNA&#39;s om meerdere ribosomen en hun onderscheidend bezinken in sucrosegradiënten. Traditioneel werken met in vivo monsters, met name de central zenuwstelsel (CZS), is een uitdaging door de beperkte hoeveelheden materiaal en de aanwezigheid van vetweefsel componenten bewezen. Om dit aan te pakken, wordt de beschreven protocol specifiek geoptimaliseerd voor minimale hoeveelheid CZS-materiaal, zoals blijkt uit het gebruik van enkele muis ruggenmerg en de hersenen. In het kort worden CNS weefsels geëxtraheerd en vertalen ribosomen geïmmobiliseerd op mRNA met cycloheximide. Myeline beursgang wordt vervolgens uitgevoerd om vetrijke componenten te verwijderen. Fractionering wordt uitgevoerd op een sucrosegradiënt waar mRNA worden gescheiden volgens hun ribosomale laden. Geïsoleerde fracties zijn geschikt voor een scala aan downstream testen, met inbegrip van nieuwe genoom brede assay technologieën.

Figuur 2 toont representatieve polyribosome profielen na fractionering. De profielen van de hersenen en het ruggenmerg tonen kenmerkende absorptiekrommen als hiervoor beschreven cellijnen. mRNA gebonden aan kleine ribosomale subeenheden (40S) sediment in lichtere fracties en lijken eerst als een piek op het profiel, gevolgd door de grote ribosomale subeenheid (60S) en monosome (80S) gebonden mRNA. mRNA&#39;s gebonden aan meerdere ribosomen sediment bij zwaardere fracties, met de latere toppen aangeeft toenemend aantal gebonden ribosomen. Global vertaling kan worden beoordeeld uit het profiel. Als voorbeeld, hersenweefsel een hogere polyribosome verhouding monosome dan ruggenmerg weefsel aangeeft actiever vertaling. RNA geëxtraheerd uit individuele fracties werden beoordeeld door Bioanalyzer, tonen de verdeling van 18S en 28S rRNA. 18S rRNA eerder in het profiel weergegeven, overeenkomstig de kleine ribosomale subeenheden sedimenteren in lichtere sucr<html> ose fracties. Typische opbrengsten van totaal RNA 10-20 ug voor de hersenen en 2-4 ug van het ruggenmerg. RNA opbrengst van afzonderlijke fracties tot 4 ug en 0,8 ug voor de hersenen en het ruggenmerg respectievelijk afhankelijk van de fractie. Een blanco sucrosegradiënt al toont achtergrondinformatie absorptie bij 260 nm, door de aanwezigheid van DTT. Deze achtergrond kan tijdens de data-analyse worden afgetrokken om monster waarden normaliseren. EDTA behandeling stortte de polyribosome pieken, waaruit de sedimentatie wordt bepaald door de vertaling. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Workflow en mogelijke toepassingen van in vivo polyribosome fractionering.&gt; Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Figuur 2. (A) Typische polyribosome profielen van de hersenen en het ruggenmerg, met beoordeling van de geëxtraheerde RNA door Bioanalyzer. (B) Distributie van GAPDH mRNA dan fracties door qRT-PCR. (C) Polyribosome profielen van lege gradiënt en de hersenen met en zonder EDTA behandeling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x gradiëntbuffer </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml cycloheximide (CHX), 2 mM dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 17,5% </td><td> 8,67 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 25,6% </td><td> 12,8 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 33,8% </td><td> 16,9 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 41,9% </td><td> 20,95 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 50% </td><td> 25 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeniseringbuffer A </td><td> 0,25 M sucrose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 E / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M sucrose-oplossing </td><td> 68,4% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M sucrose-oplossing </td><td> 38,5% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M sucrose-oplossing </td><td> 30,8% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization buffer B </td><td> 0,25 M sucrose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 E / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Lijst van buffers en oplossingen.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Systemische en lokale Drug Delivery voor de behandeling van ziekten van het centrale zenuwstelsel in knaagdiermodellen

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...