Name: in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale Utdannings-og forskningsdepartementet (BMBF), Systems Biology of Signa i Cancer (Helmholtz Alliance på systembiologi) og den tyske Cancer Research Center (DKFZ).

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer i DKFZ. Forsiktig: For å hindre RNAse forurensning av prøvene, ta enkle forholdsregler for å unngå RNAse forurensning og forberede alle buffere med DEPC-behandlet vann. En. Utarbeidelse av sakkarosegradienter <ol><li> Forbered 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 og 50% sukrose løsninger (se tabell 1). Begynn fremstilling av gradienter ved sakte tilsetning av 2 ml 50% sukrose-løsning til bunnen av en polyallomer ultrasentrifugerør. Fryse laget ved å plassere rørene i 20 min ved -80 ° C. </li><li> Legg de påfølgende lagene ved mink sukrose prosenter med frysing trinnene i mellom, og endte opp til 17,5% sukrose. Hold gradienter på is i løpet av tilsetningen av sukrose-løsninger for å hindre opptining av de underliggende lag. </li><li> Forbered sakkarosegradienter fersk en dag før bruk og oppbevar ved 4 ° C. Alternatively, forberede gradienter i forveien, oppbevar ved -80 ° C og tine ved 4 ° C natten før forsøket. </li></ol> 2. Vevpreparerina (ryggmarg og / eller Brain) <ol><li> Anesthetize mus ved en overdose av Xylazin og Ketamin i NaCl og transcardially perfuse med 20 ml Hanks balanserte salt-oppløsning (HBSS) inneholdende 200 ug / ml CHX som immobiliserer ribosomer på tilknyttede transkripter. Bekreft riktig anesthetization av ikke-respons til tå klyper. </li><li> Pakk vev raskt. Åpne kraniet dorsally og pakke hjernen. Utfør laminektomi av hele thorax og lumbale ryggsøylen og pakke ryggmargen. Bruk hele hjernen (~ 400 mg), eller en 4 cm stykke av ryggmargen (~ 90 mg), respektivt. </li><li> Overfør vevet inn i iskald homogenisering buffer A (se tabell 1) (ryggmarg: 1 ml; hjerne: 4 ml) og terningene i små stykker med en ren skalpell for å tillate økt opptak av cykloheksimid. Perform alle ytterligere skritt på isen. </li><li> Inkuber i 15 min, og homogenisere vevet mekanisk med en Douce-homogenisator. Nøye kontrollert homogenisering er nødvendig for å sikre at kjernen forblir intakt. Behandle alle prøvene på akkurat samme måte for å sikre sammenlignbarhet. Merk: for hjernevev: Forstyrre vev av fem slag med en tettsittende stampe. For ryggmargen vev: forstyrre av fem slag med en løstsittende stampe, etterfulgt av fem flere slag med en tettsittende stampe. </li><li> Ta alikvoter (400 pl for hjernen og 200 pl for ryggmarg), flash-frysing og oppbevar ved -80 ° C i totalt RNA isolert. </li><li> Fjerne kjerner og uforstyrret celle og vevs-fragmenter ved sentrifugering ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C. Lav hastighet sentrifugering forhindrer tap av ribosomer. </li><li> Lyse membranfragmenter i nuclei fri supernatant i 30 min ved å tilsette NP-40 og natriumdeoksycholat vaskemidler (hver til en sluttkonsentrasjon på 1%). </li></ol><ol><li> Dette trinnet fjerner fettkomponenter fra prøven som ellers vil maskere signalet i polyribosome profilen. Først pre-Chill ultrasentrifugerør bøtter og rotoren på 4 ° C og forberede to M, 1,1 M og 0,9 M sukrose løsninger (se tabell 1). </li><li> Bland-lysat med en 1,22 volumer av 2 M sukrose-løsning og overfør til et polyetylen ultrasentrifugerør. Fyll opp alle rør til tilsvarende volum med 10 ml med 1,1 M sukrose løsning, deretter kle det nøye med 0,9 M sukrose løsning. </li><li> Plasser ultrasentrifugerør rør i pre-kjølt ultrasentrifugerør bøtter. Sentrifuger i 3 timer ved 100.000 x g ved 4 ° C. Under denne prosessen ribosomer blitt deponert i pellet, mens fettkomponenter flyte opp og forblir i supernatanten. </li></ol> 4. Sukrosegradient Fraksjone <ol><li> Fjern supernatant og pellet oppløses i homogenisering buffer B (se tabell 1 </strong&gt;). Mål absorbansen ved 260 nm for hver prøve ved å bruke et Nanodrop eller tilsvarende apparat og normalmengder for å laste i henhold til absorbansverdi. </li><li> Plasser sakkarosegradienter (preparatet er beskrevet i et tidligere avsnitt) inn i pre-kjølt ultrasentrifugerør bøtter. Layer prøver forsiktig på toppen av stigningen. Legg til en tom sukrosegradient som teknisk kontroll. </li><li> Juster vekten av hver bøtte med homogenisering buffer. Sentrifugere prøven 1,5 time ved 285 000 xg ved 4 ° C. </li><li> Begynn å forberede Isco fraksjoneringskolonnen 30 min før slutten av sentrifugering. Dersom en annen type av fraksjoneringskolonnen er brukt, følge produsentens protokoll. <ol><li> Angi passende følsomhet (0,2 aufs for hjernen eller 0,05 aufs for ryggmargen) for UV-lampen og slå den på for å varme opp. Monter røret piercer, kobler den til via den rullende pumpe til 60% sukroseløsning gjennom røret piercer. </li><li> Test oppsettet ved å pumpe sukrose (flow rottee: 1 ml / min), særlig sørge for at det er noen lekkasjer i slangene som vil introdusere boblene i graderingen. </li><li> Blank bakgrunn absorpsjon ved manuelt å pumpe gradient buffer inn i UV-detektor og korrigere grunnlinjen. </li></ol></li><li> Fjern forsiktig ultrasentrifugerør bøtter inneholder sakkarosegradienter med sedimentert prøver fra rotoren og plassere dem på is. Unngå bumping over graderinger for å hindre tap av oppløsning. </li><li> Kjør gradienter på fraksjone. Kjør tomme gradienter første til å vurdere bakgrunnen absorpsjon og sikre forsvarlig teknisk oppsett. <ol><li> Fest gradient til UV-detektor og stikke hull i bunnen av røret med røret piercerne. Starte pumping av 60% sukrose, noe som vil forskyve gradient med sedimentert prøvene oppover gjennom UV-detektoren og inn i dråpeanordningen. </li><li> Absorbansen ved 260 nm er dokumentert å generere absorpsjonsprofil for prøven, med topper som angir fellingssjon av mRNA forbundet med ribosomale subenheter, monosomes, og deretter øke antallet ribosomer. </li></ol></li><li> Samle inn prøver i 20 fraksjoner via dråpeanordningen (600 mL hver, i to ml rør). </li></ol> 5. RNA Isolasjon fra enkelte fraksjoner <ol><li> Tilsett 10% SDS til en sluttkonsentrasjon på 1% for de enkelte fraksjoner, og blandes godt for å folde proteiner og dissosierer ribosomer. På dette tidspunkt prøvene kan fryses ved -80 ° C. Avhengig av spørsmål som skal behandles, kan fraksjoner slås sammen i henhold til absorbans-profilen. </li><li> Isoler RNA med sure fenol / kloroform ekstraksjon, som også fjerner forurensende spor av DNA. <ol><li> Til en volum av sure fenol / kloroform (forvarmet til RT) til hver prøve, varme i 10 minutter ved 65 ° C og frigjøring trykket under avtrekkshette etterpå. </li><li> Sentrifugere prøven 20 min ved 17 000 xg ved RT. Overføre nøye vandige fasen til en ny 1,5 mltube. Vær oppmerksom på faseinversjon i tettere sukrose fraksjoner, hvor den vandige fasen kan være på bunnen etter sentrifugering. </li><li> Til en volumdel isopropanol, 1/9 volum natriumacetat (pH 5,2) og 1 pl GlycoBlue til hver prøve for å utfelle RNA. Hold prøvene minst 1 time ved -80 ° C. </li><li> Sentrifuger i 30 minutter ved 17000 xg og 4 ° C. GlycoBlue gir visualisering av pellets. Fjern supernatanten, vask pellet en gang med iskald 80% etanol og lufttørkes pellet. Løs opp pellet i RNAse fritt vann. </li></ol></li><li> Kvantifisere mengden av RNA av Nanodrop og analysere RNA integritet av en Bioanalyzer chip. RNA som er fremstilt ved den fremlagte protokoll er egnet for alle state of the art høy gjennomstrømning assays inkludert microarray og dyp-sekvensering. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Ingen interessekonflikt erklært.

Selv polyribosome fraksjonering er ikke en ny metode, er det fortsatt en særlig utfordrende. Basert på innspill materiale, kan betydelig optimalisering være nødvendig. Dette er spesielt tilfellet for in vivo CNS-prøver, der mengden av materialet er ofte en begrensning og fettvev komponenter hindre isolasjon av sette mRNA. De publiserte fraksjoneringsprotokoller håndtere gjær-eller pattedyrcellelinjer, og det finnes etablerte protokoller for hjernen 12,13,14. I motsetning til dette er det knapt noen publikasjoner som beskriver fraksjonering av ryggmargen, og tidligere protokollene krever ryggmarg fra et stort antall dyr som skal sammenslåtte 15. Av disse grunner ble det gjort flere viktige modifikasjoner for å tilpasse den fraksjoneringsprotokoll for CNS-vev, inkludert enkelt mus ryggmarg. Ribosom immobilisering med cycloheximide er utført i løpet av dyr perfusjon å unngå dissosiasjon av ribosomer During den lange prosessen med vev utvinning. Deretter blir polysomal RNA ekstraheres på en bestemt måte for å maksimere polyribosome utbytte. Først kontrolleres homogenisering av vevet ved douncing, holder kjernen intakt og forhindrer DNA-kontaminering. Kjernen fjernes deretter på en pålitelig måte ved sentrifugering. Kombinasjonen av de vaskemidler NP-40 og natriumdeoksycholat sikrer lyse av det endoplasmatiske retikulum, og frigjøring av dens membran assosiert ribosomer. I tillegg, UV-absorberende komponenter i lipid rik myelin tilsløre polyribosome profiler. Myelin flotasjon er derfor nødvendig, hvor tette forbindelser såsom polyribosomes blir pelletert og lettere forbindelser slik som myelin flyte og blir fjernet 16.. Polyribosomes blir deretter sedimenteres i løpet av en 17.5% til 50% sakkarose-gradient. I stedet for manuelt lagdeling og frysing hver sukrose laget, kan gradienter også fremstilles under anvendelse av en gradient-blander. Utvinning av RNA fra fraksjoner som bruker surt fenol / kloroform tillater DNA fjernes med minimalt tap av RNA. Imidlertid kan faseinversjon inntreffe ved tette sukrose fraksjoner (nevnte fraksjon 16). Denne protokollen gir fordeler i forhold til andre konvensjonelle fremgangsmåter som er rettet på nivået av translasjon. For eksempel, både måling av fosforylert S6 (en fremtredende oversettelse markør), samt merking av begynnende kjeder med radioisotoper gi informasjon om global oversettelse nivåer, men avslører litt om hva som konkret blir oversatt. Polyribosome fraksjonering, på den annen side, gjør det mulig ikke bare vurdering global oversettelse av, men også av identiteten til mRNA sette og de relaterte regulatoriske proteiner. Kvantitativ real-time PCR kan utføres på isolerte RNA for en rask lese ut av utvalgte mRNA, og mikromatriser og neste generasjon RNA sekvensering kan utføres for genom brede studier. Den optimaliseringer som presenteres her, tillater teknikken som skal benyttes med minimale mengder av CNS-vev, og derfor avtaring antall dyr er nødvendig og forbedre generelle eksperimentelle kvaliteten ved å redusere vev behandlingstiden. På den annen side, kan denne teknikken ikke skille stoppet ribosomer fra sette seg. Transkripsjoner frakter fastlåste ribosomer vil sedimentere i de tunge fraksjoner, og dette bør tas i betraktning ved tolkning av data. Det er siste rapporterte teknikker, nemlig RiboTaq og felle, der ribosomer er merket med epitop tags eller journalister henholdsvis i en celletype bestemt måte og tilhørende mRNA isolert ved immunoprecipitation 17,18. Denne teknikken kan kobles til polyribosome fraksjone å tilby høy oppløsning lest opp for spesifikke cellepopulasjoner. Ribosom fot-utskrift er en annen roman teknikk som innebærer nuclease fordøyelsen å generere små fragmenter, eller &quot;fotavtrykk&quot;, av mRNA som er beskyttet av ribosomer. Bibliotekene blir deretter generert fra disse fotsporene og sekvensert. Denne metoden provIdes et kodon spesifikke hele genomanalyse på oversettelse og er i stand til å identifisere fastlåste ribosomer, ikke-august starter kodon og små oppstrøms åpne leserammer, noe som ikke kan oppnås ved polyribosome fraksjone 19. Imidlertid kan polyribosome fraksjone kobles til ribosom profilering for isolering av fordøyde fragmenter inneholdende enkle ribosomer, således anrike for de molekylære arter som trengs for bibliotek-preparat hvor høy renhet prøven er ofte nødvendig. Til sammen er polyribosome fraksjone en fleksibel metode med varig betydning, og kan kobles til ulike nedstrøms applikasjoner, inkludert genom brede analyser som neste generasjons sekvensering.

Gene expression er bestemt av den kombinerte virkning av transkripsjon, translasjon, og stabiliteten til mRNA og proteiner, med oversettelse bærer den mest dominerende virkning 1. Det er nå klart at hvert av disse trinnene er svært regulert. Micro-RNA, dannelsen av RNA granulater, alternativ og cytoplasmatisk polyadenylering er noen eksempler på post-transcriptional regulering av genuttrykk 2,3. Hver av disse mekanismer som kobler seg transkripsjon fra oversettelse og påvirker proteomet i det biologiske system av interesse. Dermed overraskende, mRNA nivåer alene er en ufullkommen avlesning av protein nivåer 4. Kvantitativ proteomikk gir den mest direkte vurdering av genekspresjon, men til tross for nylige fremskritt, er det fortsatt betydelige begrensninger på følsomhet og protein sekvens oppløsning. Derfor adressering translatome, repertoar sette mRNA, og tilbyr en utmerket kompromiss mellom å studeretranscriptome og proteom. Det er mer nøyaktig enn transcriptomics i vurderingen endelige genuttrykk, og gir både høyere dekning og sekvens oppløsning enn proteomikk. I pattedyr systemer, begynner de fleste av oversettings hendelser via cap-avhengige innvielse. En gruppe av eukaryote initiering faktorer sammen med 40S lille ribosomale subenhet montere på 5 &#39;cap av et mRNA. Komplekset skanner deretter mRNA og ved oppnådd startkodonet august, rekrutterer 60S store ribosomal subenhet å danne en komplett 80S ribosom. Forlengelses trinns-ding med ribosomet beveger seg langs mRNA, med forlengelsesfaktorer hjelpe inkorporeringen av aminosyrer fra belastede tRNAs til den begynnende peptid-kjeden. Flere ribosomer kan foregå langs en ​​enkelt mRNA samtidig, og antallet tilknyttede ribosomer har vist seg å korrelere med graden av proteinsyntese 5,6. Dette gjør ribosomal lasting en pålitelig indikasjon for tranningen og tillater separasjon av aktivt sette mRNA basert på senkningsreaksjon. I tillegg til kvantifisering av sette mRNAs, kan sekvensinformasjon fås til å identifisere motiver som er involvert i oversettelse regulering. RNA Også bindingsproteiner og andre oversettelsesfaktorer kan isoleres fra forskjellige fraksjoner, å lette studiet og oppdagelse av relaterte regulatoriske proteiner. I nervesystemet, og translasjonelle kontroll vært knyttet til prosesser som mRNA lagring, transport og lokal proteinsyntese. Vekst kjegler har vist seg å besitte en spesifikk lokal pool av mRNA distinkte fra resten av axon 7.. I tillegg aksoner har evnen til lokalt å syntetisere proteinene 8,9. Som et resultat, har lokal styring av oversettelses blitt et viktig tema for studien i nevrobiologi. Potensialet i polyribosome fraksjone for å løse dette er illustrert i flere studier, hvor teknikken ble anvendt for åundersøke axon veiledning i ryggmargen utvikling, og demonstrerte aktivitet avhengige oversettelse av BDNF i hjernen 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Flere prosesser er involvert i genekspresjon, inkludert transkripsjon, translasjon og stabilitet av mRNA og proteiner. Hvert av disse trinnene er strengt regulert, påvirker de endelige dynamikken i protein overflod. Ulike reguleringsmekanismer eksisterer på oversettelses trinn, rende mRNA nivåer alene en upålitelig indikator på genuttrykk. I tillegg har lokal regulering av mRNA oversettelse vært spesielt innblandet i nervefunksjoner, skiftende &#39;translatomics&#39; til fokus for oppmerksomhet i nevrobiologi. Den presenterte metoden kan brukes til bridge transcriptomics og proteomikk. Her beskriver vi viktige endringer i teknikken av polyribosome fraksjonering, som leser av translatome basert på foreningen av aktivt oversatte mRNA til flere ribosomer og deres differensial sedimentering i sakkarosegradienter. Tradisjonelt arbeider med in vivo prøver, særlig av Central nervesystemet (CNS), har vist seg vanskelig på grunn av de begrensede mengder av materiale og tilstedeværelsen av fettvev komponenter. For å løse dette, blir den beskrevne protokoll er spesielt tilpasset bruk med minimal mengde av CNS-materiale, som vist ved bruk av enkelt mus ryggmarg og hjerne. Kort fortalt er CNS vev hentet og sette ribosomer er immobilisert på mRNA med cycloheximide. Myelin flotasjon utføres deretter for å fjerne fettrike komponenter. Fraksjonering utføres på en sucrose-gradient, hvor mRNA er separert i henhold til deres ribosomal lasting. Isolerte fraksjoner er egnet for en rekke nedstrøms analyser, herunder nye genom bred analyseteknologi.

Figur 2 viser representative polyribosome profiler etter fraksjonering. Profilene av hjernen og ryggmargen viser karakteristiske absorpsjons-kurvene som beskrevet før for cellelinjer. mRNA bundet til små ribosomal subenheter (40S) sediment på lettere fraksjoner og vises først som en topp på profilen, etterfulgt av den store ribosomal subenheten (60S) og monosome (80S) bundet mRNA. mRNA bundet til flere ribosomer sedimentere på tyngre fraksjoner, med de senere topper som indikerer økende antall innbundne ribosomer. Globalt oversettelse kan vurderes fra profilen. Som et eksempel, har hjernevev en høyere polyribosome å monosome-forhold enn ryggmargsvevet, noe som indikerer mer aktiv oversettelse. RNA ekstrahert fra de enkelte fraksjonene ble vurdert ved Bioanalyzer, som viser fordelingen av 18S og 28S rRNA. 18S rRNA vises tidligere i profil, i samsvar med den lille ribosomale subenheter sedimenterende i lysere sucr<html> OSE fraksjoner. Typiske utbytter av total RNA er 10 til 20 mikrogram til hjernen og 2-4 mikrogram til ryggmargen. RNA utbytter fra de enkelte fraksjoner er opptil 4 ug og 0,8 ug til hjernen og ryggmargen henholdsvis, avhengig av fraksjonen. En tom sukrosegradient allerede viser noen bakgrunns absorpsjon ved 260 nm, på grunn av tilstedeværelsen av DTT. Denne bakgrunnen kan trekkes under dataanalyse for å normalisere eksempelverdier. EDTA behandling kollapset de polyribosome topper, demonstrere sedimente profilen er grunn til oversettelse. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Arbeidsflyt og potensielle anvendelser av in vivo polyribosome fraksjonering.&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Figur 2. (A) Typiske polyribosome profiler av hjernen og ryggmargen, med vurdering av ekstrahert RNA ved Bioanalyzer. (B) Fordeling av GAPDH mRNA i løpet av brøkdeler QRT-PCR. (C) Polyribosome profiler av tomme gradient og hjernen med og uten EDTA behandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x gradient buffer </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl 2, 600 mM NaCl, 200 mg / ml cycloheximide (CHX), 2mm dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sukrose-løsning 17,5% </td><td> 8,67 g sukrose, 25 ml 2x gradient buffer, opp til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sukroseløsning 25,6% </td><td> 12,8 g sukrose, 25 ml 2x gradient buffer, opp til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sukrose-løsning 33,8% </td><td> 16,9 g sukrose, 25 ml 2x gradient buffer, opp til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sukroseløsning 41,9% </td><td> 20,95 g sukrose, 25 ml 2x gradient buffer, opptil 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sukroseløsning 50% </td><td> 25 g sukrose, 25 ml 2x gradient buffer, opp til 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeniseringbuffer A </td><td> 0,25 M sukrose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche komplett protease-inhibitor, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M sukroseløsning </td><td> 68.4% sukrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 100 mikrogram / ml CHX, 1x Roche komplett proteasehemmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M sukroseløsning </td><td> 38.5% sukrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 100 mikrogram / ml CHX, 1x Roche komplett proteasehemmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 M sukroseløsning </td><td> 30,8% sukrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl </td><td> 100 mikrogram / ml CHX, 1x Roche komplett proteasehemmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization buffer B </td><td> 0,25 M sukrose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl 2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% natrium-deoksycholat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche komplett protease-inhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Liste over buffere og løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Denne protokollen illustrerer vesentlige modifikasjoner av polyribosome fraksjonering for å studere translatome av in vivo CNS-prøver. Den lar global vurdering av oversettelse og transkripsjon regulering gjennom isolasjon og sammenligning av total RNA til ribosom bundet RNA fraksjoner.

In vivo Avhør av Central Nervous System Translatome av Polyribosome Fraksjone

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging of Stem Cell implantasjon i sentralnervesystemet av Mus

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Merking av enkeltceller i Central Nervous System av<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skade Paradigm for å etterforske Central Nervous System Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkte Intraventrikulær Levering av legemidler til gnager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funksjonell Evaluering av biologisk nervegifter i Nettbaserte Kulturer av Stem Cell-avledet sentralnervesystemet nevroner

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...