Name: in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF), den systembiologi för Signalering i Cancer (Helmholtz Alliance på Systembiologi) och den tyska Cancer Research Center (DKFZ).

Samtliga djurförsök utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer från DKFZ. Varning: För att förhindra RNAse kontaminering av prover, ta grundläggande försiktighetsåtgärder för att undvika RNas föroreningar och förbereda alla buffertar med DEPC-behandlat vatten. 1. Framställning av sackarosgradienter <ol><li> Förbered 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 och 50% sackaros lösningar (se tabell 1). Börja förbereda gradienter genom långsam tillsats av 2 ml 50% sackaroslösning till botten av en polyallomer ultracentrifugrör. Freeze skiktet genom att placera rören i 20 min vid -80 ° C. </li><li> Lägg till de följande lagren vid minskande sackaros procentsatser med frysning steg i mellan, slutade upp till 17,5% sackaros. Håll övertoningar på is under tillsats av sackaros lösningar för att förhindra upptining av underliggande lager. </li><li> Förbered sackarosgradienter nyligen en dag före användning och förvara vid 4 ° C. Alternatively, förbereda gradienter i förväg, förvara vid -80 ° C och tining vid 4 ° C natten innan experimentet. </li></ol> 2. Vävnadsberedning (ryggmärg och / eller hjärnan) <ol><li> Bedöva musen genom en överdos av Xylazin och Ketamin i NaCl och transkardiellt BEGJUTA med 20 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande 200 | ig / ml CHX som immobiliserar ribosomer på associerade transkript. Bekräfta korrekt anesthetization av icke-mottaglighet till tå nypor. </li><li> Utdrag vävnad snabbt. Öppna kraniet dorsalt och extrahera hjärnan. Utför laminektomi av hela bröst-och ländryggen ryggrad och extrahera ryggmärgen. Använd hela hjärnan (~ 400 mg) eller en 4 cm bit av ryggmärgen (~ 90 mg), respektive. </li><li> Överför vävnaden i iskall homogenisering buffert A (se tabell 1) (ryggmärg: 1 ml; hjärna: 4 ml) och tärningar i små bitar med en ren skalpell för att möjliggöra ökat upptag av cykloheximid. Perform alla ytterligare steg på is. </li><li> Inkubera i 15 minuter och homogenisera vävnaden mekaniskt med användning av en Dounce-homogenisator. Noggrant kontrollerade homogenisering är nödvändig för att säkerställa att kärnorna förblir intakta. Behandla alla prover exakt samma sätt för att säkerställa jämförbarhet. Anmärkning: för hjärnvävnad: Störa vävnad med 5 slag med en tätslutande mortelstöt. För ryggmärgsvävnad: störa med 5 slag med en löst sittande mortelstöt, följt av ytterligare 5 slag med en tätslutande mortelstöt. </li><li> Ta alikvoter (400 ul för hjärna och 200 l för ryggmärgen), blixt frysa och förvara vid -80 ° C för total RNA isolering. </li><li> Ta bort kärnor och störningsfri cell och vävnadsfragment genom centrifugering vid 500 x g under 10 min vid 4 ° C. Låghastighetscentrifugering förhindrar förlust av ribosomer. </li><li> Lyse membranfragment i kärnorna fria supernatanten efter 30 min genom tillsats av NP-40 och natriumdeoxikolat detergenter (vardera till en slutlig koncentration av 1%). </li></ol><ol><li> Detta steg avlägsnar fettkomponenter från provet, som annars kommer att maskera signalen i polyribosome profilen. Först, pre-chill ultracentrifugen hinkar och rotor vid 4 ° C och förbereda 2 M, 1,1 M och 0,9 M sackaros lösningar (se tabell 1). </li><li> Blanda lysat med en 1.22 volymer av 2 M sackaros lösning och överför till en polyeten ultracentrifugrör. Fyll alla rör till lika stor volym av 10 ml med 1,1 M sackaros lösning, därefter överlagra det försiktigt med 0,9 M sackaroslösning. </li><li> Placera ultracentrifugrör i på förhand kylda ultracentrifugen hinkar. Centrifugera under 3 h vid 100.000 xg vid 4 ° C. Under denna process ribosomer bli deponeras i pelleten medan feta komponenter flyter upp och stanna kvar i supernatanten. </li></ol> 4. Sackarosgradient Fraktione <ol><li> Avlägsna supernatanten och lös upp pelleten i homogeniseringsbuffert B (se tabell 1 </stRong&gt;). Mät absorbansen vid 260 nm för varje prov med hjälp av en Nanodrop eller likvärdig anordning och normalisera mängderna att lasta enligt absorptionsvärdet. </li><li> Placera sackarosgradienter (framställning beskrivs i ett tidigare avsnitt) i pre-kylda ultracentrifugen hinkar. Prover Layer försiktigt på toppen av gradienten. Lägg till en tom sukrosgradient som teknisk kontroll. </li><li> Justera vikten av varje hink med homogeniseringsbuffert. Centrifugera prover om 1,5 h vid 285.000 xg vid 4 ° C. </li><li> Börja förbereda Isco fraktionerings 30 minuter före slutet av centrifugering. Om en annan modell av fraktioneringsanordningen användes, följa tillverkarens protokoll. <ol><li> Ställ in lämplig känslighet (0.2 AUFS för hjärnan eller 0.05 AUFS för ryggmärgen) för UV-lampan och slå på den för att värma upp. Montera röret piercer, anslut den via rull pumpen till 60% sackaros lösning genom röret piercer. </li><li> Testa installationen genom att pumpa sackaros (flöde råttaE: 1 ml / min), särskilt se till att det inte finns några läckor i slangarna som kommer att införa bubblor i lutning. </li><li> Blank bakgrund absorption genom att manuellt pumpa gradient buffert i UV-detektor och korrigera baslinjen. </li></ol></li><li> Ta försiktigt bort ultracentrifugen hinkar som innehåller sackaros gradienter med sedimenterade prover från rotorn och placera dem på is. Undvik stötar av lutningar för att förhindra förlust av upplösning. </li><li> Kör gradienter på fraktionerings. Kör tomma gradienter först att bedöma bakgrunds absorption och säkerställa korrekt teknisk installation. <ol><li> Fäst gradient till UV-detektorn och tränga igenom botten av röret med röret piercer. Starta pumpning av 60% sackaros, vilket kommer att förskjuta gradienten med sedimenterade prover uppåt genom UV-detektor och in i dropp. </li><li> Absorbansen vid 260 nm är dokumenterat att generera absorptionsprofilen för provet, med toppar som anger sedimentetion av mRNA i samband med ribosomala subenheter, monosomes och därefter ökande antal ribosomer. </li></ol></li><li> Samla in prov i 20 fraktioner via dropp (600 pl vardera, i 2 ml rör). </li></ol> 5. RNA Isolering från enskilda Bråk <ol><li> Lägg 10% SDS till en slutlig koncentration av 1% till individuella fraktioner och blanda väl i syfte att veckla ut proteiner och dissociera ribosomer. Vid denna punkt prover kan frysas vid -80 ° C. Beroende på vilken fråga som skall behandlas, kan fraktioner slås samman enligt absorbansen profilen. </li><li> Isolera RNA med sur fenol / kloroform-extraktion, vilket även tar bort kontaminerande spår av DNA. <ol><li> Lägg till en volym av sur fenol / kloroform (förvärmd till RT) till varje prov, värme under 10 minuter vid 65 ° C och frigöringstrycket under dragskåp efteråt. </li><li> Centrifugera proverna i 20 min vid 17000 xg vid rumstemperatur. Försiktigt överföra vattenfasen till en ny 1,5 mlröret. Var medveten om fasvändning i tätare sackaros fraktioner, där vattenfasen kan vara i botten efter centrifugering. </li><li> Lägg till en volym isopropanol, 1/9 volym natriumacetat (pH 5,2) och 1 | il GlycoBlue till varje prov för att fälla ut RNA. Förvara proverna minst 1 timme vid -80 ° C. </li><li> Centrifugera under 30 min vid 17000 x g och 4 ° C. GlycoBlue erbjuder visualisering av pelleten. Avlägsna supernatanten, tvätta pelleten gång med iskall 80% etanol och lufttorka pellet. Lös pelleten i RNAse fritt vatten. </li></ol></li><li> Kvantifiera mängden RNA genom Nanodrop och analysera RNA-integritet genom en Bioanalyzer chip. RNA som erhålls genom den presenterade protokollet är lämplig för alla toppmoderna high throughput analyser inklusive microarray och djupa sekvensering. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Även polyribosome fraktionering är inte en ny teknik, är det fortfarande ett särskilt utmanande. Baserat på insatsmaterial, kan betydande optimering vara nödvändig. Detta gäller särskilt för in vivo CNS-prov, där mängden material är ofta en begränsning och fet vävnadskomponenter hindra isolering av översätta mRNA. Mest publicerade fraktioneringsprotokoll behandlar jäst eller däggdjurscellinjer, och det finns etablerade protokoll för hjärnan 12,13,14. Däremot finns det knappt några publikationer som beskriver fraktionering av ryggmärg, och tidigare protokoll kräver ryggmärgen från ett stort antal djur som skall sammanslagna 15. Av dessa skäl har flera väsentliga modifieringar göras för att anpassa den fraktione protokoll för CNS-vävnad, inklusive enda mus ryggmärg. Ribosomen immobilisering med cykloheximid utförs under djur perfusion för att undvika dissociation av ribosomer During den långa processen av vävnad extraktion. Därefter polysomal RNA utvinns på ett specifikt sätt för att maximera polyribosome avkastning. Först kontrolleras homogenisering av vävnaden genom douncing, håller kärnan intakt och förhindrar DNA-kontaminering. Kärnan avlägsnas därefter tillförlitligt genom centrifugering. Kombinationen av de detergenter NP-40 och natriumdeoxicholat säkerställer lys av det endoplasmatiska retiklet och frisättning av dess membranassocierade ribosomer. Dessutom, UV-absorberande komponenter inom lipid rika myelin skymma polyribosome profilerna. Myelin flotation är därför nödvändigt, där täta föreningar såsom polyribosomer pelleteras och lättare föreningar såsom myelin float och tas bort 16. Polyribosomer sedan sediment över en 17,5% till 50% sackaros lutning. Istället för att manuellt skiktning och frysa varje sackaros lager, kan övertoningar också framställas med en lutning mixer. Extraktion av RNA från fraktioner med användning av sur fenol / kloroform tillåter DNA tas bort med minimal RNA förlust. Dock kan fas inversion uppstå vid täta sackaros fraktioner (ovan fraktion 16). Detta protokoll ger fördelar jämfört med andra konventionella metoder som behandlar nivån på översättning. Till exempel, både mätning av fosforyleras S6 (en framstående översättnings markör) samt märkning av begynnande kedjor med radioisotoper ger information om globala översättningsnivåer men avslöjar lite om vad som specifikt översätts. Polyribosome fraktionering, å andra sidan, gör det inte bara bedömning av global översättning, utan även identiteten på översätta mRNA och de relaterade regulatoriska proteiner. Kvantitativ realtids-PCR kan utföras på isolerade RNA för en snabb läsning av utvalda mRNA, och microarrays och nästa generation RNA-sekvensering kan utföras för genomet breda studier. De optimeringar som presenteras här tillåta den teknik som ska användas med minimala mängder av CNS-vävnad, därför minskaning av antalet djur som behövs och förbättra den totala experiment kvalitet genom att minska vävnads handläggningstiden. Å andra sidan kan denna teknik inte skilja avstannat ribosomer från översätta sådana. Avskrifter bär strandade ribosomer sedimenterar i de tunga fraktionerna, och detta bör hållas i minnet vid tolkningen av data. Det finns senare rapporterade tekniker, nämligen RiboTaq och TRAP, där ribosomer är märkta med epitopmärkningar eller reportrar respektive i en celltyp specifika sätt och tillhörande mRNA isoleras genom immunoutfällning 17,18. Denna teknik kan vara kopplad till polyribosome fraktionering för att erbjuda hög upplösning utläses för specifika cellpopulationer. Ribosomen fot-utskrifter är en annan ny teknik som innebär nukleasklyvning att generera små fragment, eller &quot;fotspår&quot;, av mRNA som skyddas av ribosomer. Biblioteken är sedan genereras från dessa fotspår och sekvenseras. Denna metod PROVIdes ett kodon specifik hel genomanalys på översättning och kan identifiera strandade ribosomer, icke-augusti startar kodon och små uppströms öppna läsramar, som inte kan uppnås genom polyribosome fraktione 19. Emellertid kan polyribosome fraktione kopplas till ribosomen profilering för isolering av spjälkade fragmenten innehållande ensamma ribosomer och därigenom anrika för de molekylära arter som krävs för biblioteket beredning i vilken hög prov renhet krävs ofta. Sammantaget är polyribosome fraktione en flexibel metod med varaktig betydelse och kan kopplas till olika efterföljande tillämpningar, inklusive genomet breda analyser som nästa generations sekvensering.

Gene expression bestäms av den kombinerade effekten av transkription, translation och stabilitet av mRNA och proteiner, med översättning bär den mest dominerande effekten 1. Det är nu uppenbart att var och en av dessa steg är starkt reglerad. Mikro-RNA, bildning av RNA-granulat, alternativ och cytoplasmatisk polyadenylation är några exempel på posttranskriptionell reglering av genuttryck 2,3. Var och en av dessa mekanismer kopplas transkription från översättning och påverkar proteomen i det biologiska systemet av intresse. Således, föga förvånande, mRNA-nivåer enbart är en ofullkomlig avläsning av proteinnivåer 4. Kvantitativ proteomik ger den mest direkta bedömningen av genuttryck, men trots nya framsteg, finns det fortfarande betydande begränsningar för känslighet och proteinsekvens upplösning. Därför itu med translatome, repertoar översätta mRNA, erbjuder en utmärkt kompromiss mellan att studeratranskriptom-och proteom. Det är mer exakt än transkriptomik att bedöma slut genuttryck, och ger både högre täckning och sekvens upplösning än proteomik. I däggdjurssystem, majoriteten av händelser översättnings börja via cap-beroende inledande. En grupp av eukaryota initieringsfaktorer tillsammans med 40S lilla subenheten montera vid 5&#39;-cap av ett mRNA. Komplexet skannar sedan mRNA och på att nå startkodonet augusti, rekryterar den 60S ribosomens stora subenhet för att bilda en komplett 80S ribosomen. Förlängningen scen fortsätter med ribosomen rör sig längs mRNA, med elongeringsfaktorer bistå inkorporeringen av aminosyror från laddade tRNA till den begynnande peptidkedjan. Flera ribosomer kan fortsätta längs en ​​enda mRNA samtidigt och antalet associerade ribosomer har visats korrelera med graden av proteinsyntes 5,6. Detta gör ribosomala lastning en pålitlig indikation för translation och möjliggör separation av aktivt översätta mRNA baserade på sänkan. Förutom kvantifiering av översätta mRNA, kan sekvensinformation fås att identifiera motiv som är involverade i översättning reglering. RNA också bindande proteiner och andra faktorer översättnings kan isoleras från olika fraktioner, underlätta studier och upptäckten av besläktade reglerande proteiner. I nervsystemet, har translationell kontroll varit kopplade till processer såsom mRNA lagring, transport och lokal proteinsyntesen. Tillväxt kottar har visat sig hysa en viss lokal pool av mRNA skilda från resten av axonet 7. Dessutom axoner besitter förmågan att lokalt syntetisera proteiner 8,9. Som ett resultat har lokal kontroll av översättning blivit en viktig fråga för studier i neurobiologi. Potentialen hos polyribosome fraktione att åtgärda detta har visats i ett flertal studier, vid vilken teknik användes för attundersöka axon vägledning i ryggmärgen utveckling, och visade den aktivitetsberoende översättning av BDNF i hjärnan 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Flera processer är involverade i genexpression, inklusive transkription, translation och stabilitet av mRNA och proteiner. Vart och ett av dessa steg är hårt reglerad, som påverkar de slutliga dynamiken i protein överflöd. Olika regleringsmekanismer finns på översättningssteget, vilket gör mRNA-nivåer enbart en otillförlitlig indikator på genuttryck. Dessutom har lokal reglering av mRNA-translation varit särskilt inblandad i neuronala funktioner, flytta &quot;translatomics&quot; till fokus i neurobiologi. Denna metod kan användas för att överbrygga transkriptomik och proteomik. Här beskriver vi viktiga ändringar i tekniken med polyribosome fraktionering, som förhör den translatome bygger på föreningen av aktivt översatta mRNA till flera ribosomer och deras differentiell sedimentation i sackarosgradienter. Traditionellt arbetar med in vivo-prov, i synnerhet av central nervsystemet (CNS), har visat sig vara en utmaning på grund av de begränsade mängder material och förekomsten av fettkomponenter vävnad. För att åtgärda detta är beskrivna protokollet specifikt optimerad för användning med minimal mängd av CNS-material, vilket framgår av användningen av enda mus ryggmärg och hjärna. I korthet är CNS-vävnad utvinns och översätta ribosomer är immobiliserade på mRNA med cykloheximid. Myelin flotation utförs sedan för att avlägsna de fettrika komponenter. Fraktionering utförs på en sackarosgradient där mRNA separeras enligt deras ribosomala lastning. Isolerade fraktioner är lämpliga för en rad efterföljande analyser, bland annat nya genomet bred analystekniker.

Figur 2 visar representativa polyribosome profiler efter fraktionering. Profilerna för hjärna och ryggmärg visar karakteristiska absorptions kurvor såsom beskrivits tidigare för cellinjer. mRNA bundna till små ribosomala subenheter (40S) sediment på lättare fraktioner och visas först som en topp på profilen, följt av ribosomens stora subenhet (60S) och monosome (80S) bundna mRNA. mRNA bundna till flera ribosomer sedimenterar vid tyngre fraktioner, med de senare toppar som indikerar ökande antalet bundna ribosomer. Den globala översättning kan bedömas från profilen. Som ett exempel har hjärnvävnad en högre polyribosome att monosome förhållande än ryggmärgsvävnad, vilket indikerar en mer aktiv översättning. RNA extraherat från individuella fraktioner bedömdes av Bioanalyzer, som visar fördelningen av 18S och 28S rRNA. 18S rRNA visas tidigare i profil, i enlighet med de små ribosomala subenheter sedimente i ljusare Sucr<html> ose fraktioner. Typiska utbyten av total-RNA är 10-20 mikrogram för hjärna och 2-4 mikrogram för ryggmärgen. RNA-utbyten från individuella fraktioner är upp till 4 ^ g och 0,8 ^ g för hjärnan och ryggmärgen respektive, beroende på vilken fraktion. En tom sackarosgradient visar redan en viss bakgrund absorption vid 260 nm på grund av närvaron av DTT. Denna bakgrund kan subtraheras under dataanalys för att normalisera sampelvärden. EDTA-behandling kollapsade de polyribosome topparna, visar sedimenteringsprofilen beror på översättning. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Workflow och potentiella tillämpningar av in vivo polyribosome fraktionering.&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Figur 2. (A) Typiska polyribosome profiler av hjärnan och ryggmärgen, med bedömning av extraherat RNA genom Bioanalyzer. (B) Fördelning av GAPDH mRNA över fraktioner av QRT-PCR. (C) Polyribosome profiler av tomma lutning och hjärna med och utan EDTA-behandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1,1 </td><td> 2x gradientbuffert </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ^ g / ml cykloheximid (CHX), 2 mM ditiotreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1,1 </td><td> sackaroslösning 17,5% </td><td> 8,67 g sackaros, 25 ml 2x lutning buffert, upp till 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1,1 </td><td> sackaroslösning 25,6% </td><td> 12,8 g sackaros, 25 ml 2x gradient buffert, upp till 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1,1 </td><td> sackaroslösning 33,8% </td><td> 16,9 g sackaros, 25 ml 2x gradient buffert, upp till 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1,1 </td><td> sackaroslösning 41,9% </td><td> 20,95 g sackaros, 25 ml 2x lutning buffert, upp till 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1,1 </td><td> sackaroslösning 50% </td><td> 25 g sackaros, 25 ml 2x gradient buffert, upp till 50 ml DEPC-H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3 </td><td> homogeniseringbuffert A </td><td> 0,25 M sackaros, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 | ig / ml CHX, 1x Roche fullständig proteasinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3,1 </td><td> 2M sackaros lösning </td><td> 68,4% sackaros, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 | ig / ml CHX, 1x Roche fullständig proteasinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3,1 </td><td> 1,1 M sackaros lösning </td><td> 38,5% sackaros, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 | ig / ml CHX, 1x Roche fullständig proteasinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3,1 </td><td> 0,9 sukroslösning </td><td> 30,8% sackaros, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 | ig / ml CHX, 1x Roche fullständig proteasinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4,1 </td><td> homogenization buffert B </td><td> 0,25 M sackaros, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat </td><td> 200 | ig / ml CHX, 1x Roche fullständig proteasinhibitor, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Lista av buffertar och lösningar.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Detta protokoll illustrerar väsentliga modifieringar av polyribosome fraktionering i syfte att studera den translatome av in vivo CNS-prover. Det gör att helhetsbedömning av översättning och transkriptionsreglering genom isolering och jämförelse av total RNA till ribosomen bundna RNA-fraktioner.

In vivo Förhör av centrala nervsystemet Translatome av Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Systemisk och lokal Drug Delivery för behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet i gnagarmodeller

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Synnerven transection: En modell av Vuxen Neuron apoptos i det centrala nervsystemet

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Produktion av Lentiviral vektorer för att omvandla Celler från det centrala nervsystemet

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

En skada Paradigm att undersöka centrala nervsystemet Repair i<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikulär tillförsel av läkemedel till Gnagare Centrala nervsystemet

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Funktionell utvärdering av biologisk Nervgifter i nätverkande Kulturer av stamceller som härrör centrala nervsystemet nervceller

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...