Name: assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes
Uploaded: 2014-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch Gewährung R01NS062842 aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (VVD) und durch Zuschüsse R21 NS064403 aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health durch ARRA (VVD) und R21 unterstützt EB006301 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

Das Verfahren ist geeignet für Formaldehyd-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Die Technik wird hier in ihrer Anwendung auf experimentellem Schlaganfall bei Ratten nachgewiesen. 1. Vorbereiten Komponenten für Tyramid Signalverstärkung (TSA) System Obwohl die TSA-basierte Verstärkung in der Endstufe der Markierung verwendet, die Vorbereitung für diese Reaktion kann mehr als 1 Stunde dauern. Daher ist es bequem, die TSA Reagenzien vor dem Start...

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	<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., M&#252;ller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li><li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke.">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li><li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke.">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li><li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase.">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK/Cdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo.">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809 (2012).</li><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks.">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li></ol>

In diesem Video zeigen wir, im Gewebeschnitt-Format, wie man aktive Phagozyten Label, das klar den Zelltod in der Brenn Gehirn Ischämie. Die vorgestellte Technik ist der erste Ansatz, die speziell markiert nur die Abfallmanagement-Zellen, die verschlungen haben und aktiv verdauen zellulären Leichen. Dies macht es vorteilhaft gegenüber anderen bestehenden Methoden zur Markierung von phagozytischen Zellen, die nicht über diese Fähigkeit. Das Verfahren verwendet eine allgemeine und selekti...

Der ischämische Schlaganfall induziert tiefgreifenden Veränderungen in der betroffenen Hirngewebe. Sie initiiert massiven Zelltod, was zu der schnellen Aktivierung von Fresszellen Wohnsitz von Mikroglia-Herkunft führt. Es legt auch abseits Infiltration von ischämischen Hirn durch verschiedene Arten von Blut abgeleitete professionellen Phagozyten einschließlich Neutrophile, Makrophagen, dendritischen und Mastzellen 1,2. Es wird noch diskutiert, ob diese Reaktion auf ischämische Verletzung spielt eine positive oder eine negative Rolle. Obwohl Phagozytose nach Schlaganfall kann von Vorteil sein, weil es tote Zellen löscht und unterdrückt Entzündungen, erzeugt es auch giftig reaktive Sauerstoffspezies beeinflussen neuronale Überleben und verschärft Gewebeschäden 5.1. Während mehrere Arten von Fresszellen infiltrieren ischämischen Gehirn, nicht alle von ihnen in Abfallwirtschaft teilnehmen werden durch Aufnahme Zelle Leichen und den Weg für regenerative Prozesse 3.1. Diese creates eine Voraussetzung für die selektive Identifizierung von Abfallmanagement-Zellen, durchführen phagocytic Clearance von Zelltod bei Schlaganfall. Bei der Abbildung solcher aktiven Abfallmanagement-Zellen, ist es auch wichtig, die Frage, wie effizient sie die Leichen versenkt Zelle abbauen zu beantworten. Die effektive und vollständige Abbau der DNA des sterbenden Zelle in Phagozytose ist wichtig, weil es Selbstimmunisierung und die Freisetzung von pathologischen Kernmaterial 6 verhindert. Hier präsentieren wir neue Sonden, die spezifische DNA-Brüche verwenden als Marker der aktiven Fresszellen. Diese Unterschrift Umbrüche werden ausschließlich während Aufschlüsselung verschlungen Kerne im Inneren Funktionsabfallmanagement-Zellen produziert. Daher selektiv die Sonden kennzeichnen nur die Phagozyten, die verschlingen und verdauen aktiv zelluläre Leichen. Sie ermöglichen auch die Beobachtung der Intensität und der Fertigstellung der DNA-Aufschlüsselung nach der Einwirkung. Die Sonden sind hilfreich bei der Bewertung der Intensität und effizienparenz phagozytischer Freiheit. Die neuen Sonden beruhen auf einem Nicht-Protein-basierten Marker und können daher in Studien von Schlaganfall, ischämische Schädigung, wo umfangreiche zelluläre Morphologie stören oder Abbau Marker auf Proteinbasis, insbesondere in der Kernzone ischämischen besonders vorteilhaft sein. Das Prinzip des Verfahrens ist in Fig. 1 dargestellt. Die Figur zeigt haarnadelförmigen Oligonukleotidsonden durch die Vaccinia-Topoisomerase-Enzym (VACC TOPO) ligiert 5&#39;-OH-Enden, um DNA durch lysosomale DNase II während der DNA-Verdauung 7 erzeugt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="696">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:312px;">Name of the reagent or material</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:129px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9490-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td colspan="2">Vivid Technologies</td>
			<td>5 pmol/&#956;L stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3&#8217; ; B &#8211; Biotin-dT; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Adapter Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TAG AAT CGT ATC-3&#8217;; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl, PH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSA, Fluorescein System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Rat Brain Sections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6&#956;m-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Video camera and software</td>
			<td>Micromax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes

Wir beschreiben eine neue histochemische Ansatz zur Visualisierung von phagocytic Spiel in Brenn Gehirn Ischämie. Der Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Beseitigung der toten Zellen in der Schlaganfall durch Entsorgungs Phagozyten von jedem Mobilfunk Linie. Obwohl zahlreiche Zellen unterschiedlicher Herkunft, die in der Lage sind Phagozytose in ischämischen Hirn vorhanden sind, nur ein Teil von ihnen aktiv zu verschlingen und verdauen Zelle Leichen. Die selektive Visualisierung, Quantifizierung und Analyse solcher aktiven phagocytic Abfallwirtschaft sind hilfreich bei der Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie. Effiziente Zelltod Freiheit ist wichtig für Gehirn-Erholung von ischämischen Schädigung, da es öffnet den Weg für die nachfolgenden Regenerationsprozesse. Das Versäumnis, die Leichen zu reinigen würde in einer toxischen Reaktion durch nicht abgebaute DNA und Proteinen verursacht werden. Das beschriebene Verfahren nutzt fluoreszierende Sonden selektiv durch eine Virus Topoisomerase zu charakteristischen DNA-Brüche in allen Fresszellen während Einwirkung hergestellt ligiertund Verdauung von Zellen irreversibel durch Ischämie beschädigt. Das Verfahren ist ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Gehirnreaktion ischämischer Verletzung.

Das Prinzip der Technik zur Markierung von aktiven Entsorgungsfresszellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die schematische zeigt, dass die Erkennung erfolgt in drei Schritten. Der erste Schritt umfasst die Aktivierung Sonde (Fig. 1A); im zweiten Schritt die Sonde aktiviert wird, um spezifische DNA-Brüche in Gewebeschnitten (Fig. 1C) ligiert; der dritte Schritt Fluoreszenzsignalverstärkung (Fig. 1D). In der näheren Erläuterung, geht wie folgt die Erk...

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Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Wir präsentieren ein neues Fluoreszenz-Technik für die selektive in situ-Markierung der aktiven Fresszellen, die klar aus Zell Leichen in der Schlaganfall. Der Ansatz ist wichtig für die Beurteilung Gehirn Reaktion auf Ischämie, da nur ein kleiner Teil der in ischämischen Gehirn vorhanden Phagozyten in der Clearance des Zelltodes beteiligt.

Die Beurteilung Phagozytische Clearance von Cell Death in Experimental Stroke ligierbaren von Fluoreszenzsonden

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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