Name: assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes
Uploaded: 2014-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes at JoVE.com

इस शोध मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान R01NS062842 और स्वास्थ्य (VVD) के स्ट्रोक, राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा और मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और ARRA के माध्यम से स्वास्थ्य के स्ट्रोक, राष्ट्रीय संस्थान (VVD) और R21 से अनुदान R21 NS064403 द्वारा समर्थित किया गया बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग EB006301 राष्ट्रीय संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (VVD).

विधि formaldehyde-तय, आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों के लिए उपयुक्त है. तकनीक चूहे में प्रयोगात्मक स्ट्रोक को यहाँ अपने आवेदन में प्रदर्शन किया है. Tyramide संकेत प्रवर्धन (टीएसए) प्रणाली के लिए 1. तैयारी अवयव <p clas...

<ol>
	<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., M&#252;ller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li><li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke.">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li><li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke.">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li><li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase.">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK/Cdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo.">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809 (2012).</li><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks.">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li></ol>

इस वीडियो में हम फोकल मस्तिष्क ischemia में जो स्पष्ट कोशिका मृत्यु सक्रिय फ़ैगोसाइट लेबल करने के लिए कैसे, ऊतक अनुभाग प्रारूप में, प्रदर्शित करता है. प्रस्तुत तकनीक विशेष रूप से घिरा हुआ है और सक्रिय सेलुल?...

इस्कीमिक स्ट्रोक प्रभावित मस्तिष्क के ऊतकों में गहरा परिवर्तन लाती है. यह microglial मूल के निवासी phagocytic कोशिकाओं का तेजी से सक्रियण की ओर जाता है, जो बड़े पैमाने पर सेल मृत्यु शुरू. यह भी neutrophils, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान है, और मस्तूल कोशिकाओं 1,2 सहित रक्त प्राप्त पेशेवर फ़ैगोसाइट के विभिन्न प्रकार से इस्कीमिक मस्तिष्क की घुसपैठ बंद सेट. यह अभी भी इस्कीमिक चोट करने के लिए इस प्रतिक्रिया एक सकारात्मक या नकारात्मक भूमिका निभाता है बहस हो रही है. यह मृत कोशिकाओं को साफ करता है और सूजन को दबा क्योंकि स्ट्रोक के बाद phagocytosis फायदेमंद हो सकता है, यह भी neuronal अस्तित्व को प्रभावित करने और ऊतकों को नुकसान 1-5 exacerbating विषाक्त प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करता है. Phagocytic कोशिकाओं के कई प्रकार के इस्कीमिक मस्तिष्क में घुसपैठ करते हैं, उन सभी को नहीं सेल लाशों छा और पुनर्योजी प्रक्रियाओं 1-3 के लिए रास्ता साफ़ करके अपशिष्ट प्रबंधन में भाग लेते हैं. यह करोड़स्ट्रोक में कोशिका मृत्यु का phagocytic निकासी के लिए बाहर ले कि अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के चुनिंदा पहचान के लिए एक आवश्यकता eates. ऐसे सक्रिय अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं जब इमेजिंग, यह वे घिरा सेल लाशों नीचा कैसे कुशलतापूर्वक के सवाल का जवाब देना भी जरूरी है. यह आत्म - प्रतिरक्षण और रोग परमाणु सामग्री 6 की रिहाई से बचाता है क्योंकि phagocytosis में मरने कोशिका के डीएनए की प्रभावी और पूरा गिरावट आवश्यक है. यहाँ हम सक्रिय phagocytic कोशिकाओं के मार्कर के रूप में विशिष्ट डीएनए टूट का उपयोग करने वाले नए जांच उपस्थित थे. ये हस्ताक्षर टूट जाता है विशेष रूप से कार्यात्मक अपशिष्ट प्रबंधन कोशिकाओं के अंदर घिरा नाभिक के टूटने के दौरान उत्पादन किया जाता है. इसलिए जांच चुनिंदा चपेट में ले कि केवल उन फ़ैगोसाइट लेबल और सक्रिय सेलुलर लाशों को पचाने. उन्होंने यह भी घिराव के बाद तीव्रता और डीएनए टूटने के पूरा होने के अवलोकन की अनुमति. जांच तीव्रता और effici के मूल्यांकन में सहायक होते हैंphagocytic निकासी की ency. नई जांच एक गैर प्रोटीन आधारित मार्कर पर भरोसा करते हैं और इसलिए व्यापक इस्कीमिक क्षति सेलुलर आकारिकी बाधित या विशेष रूप से कोर इस्कीमिक क्षेत्र के अंदर, प्रोटीन आधारित मार्करों खलाना कर सकते हैं जहां स्ट्रोक, के अध्ययन में विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है. तकनीक के सिद्धांत चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. चित्रा एंजाइम चेचक topoisomerase (Vacc TOPO) द्वारा ligated बाल के लिये कांटा के आकार oligonucleotide जांच से पता चलता है 5&#39;OH डीएनए को पाचन के दौरान 7 lysosomal DNase द्वितीय द्वारा उत्पन्न होता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="696">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:312px;">Name of the reagent or material</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:129px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9490-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td colspan="2">Vivid Technologies</td>
			<td>5 pmol/&#956;L stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3&#8217; ; B &#8211; Biotin-dT; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Adapter Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TAG AAT CGT ATC-3&#8217;; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl, PH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSA, Fluorescein System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Rat Brain Sections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6&#956;m-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Video camera and software</td>
			<td>Micromax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes

हम फोकल मस्तिष्क ischemia में phagocytic निकासी के दृश्य के लिए एक नया histochemical दृष्टिकोण का वर्णन. दृष्टिकोण किसी भी सेलुलर वंश का अपशिष्ट प्रबंधन फ़ैगोसाइट द्वारा स्ट्रोक में मृत कोशिकाओं के उन्मूलन का अध्ययन परमिट. Phagocytosis में सक्षम हैं कि अलग मूल के कई कक्षों इस्कीमिक मस्तिष्क में मौजूद हैं, उनमें से केवल हिस्सा सक्रिय रूप से अपनी चपेट में ले और सेल लाशों को पचाने. चुनिंदा दृश्य, मात्रा का ठहराव और इस तरह सक्रिय phagocytic अपशिष्ट प्रबंधन के विश्लेषण ischemia के मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का आकलन करने में सहायक होते हैं. यह बाद में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के लिए रास्ता खुल जाता है के रूप में कुशल कोशिका मृत्यु निकासी, इस्कीमिक चोट से मस्तिष्क वसूली के लिए महत्वपूर्ण है. लाशों को साफ करने के लिए विफलता गैर अपमानित डीएनए और प्रोटीन की वजह से एक जहरीले प्रतिक्रिया नतीजा होगा. वर्णित प्रक्रिया चुनिंदा घिराव के दौरान सभी फ़ैगोसाइट में उत्पादित विशेषता डीएनए टूट के लिए एक वायरल topoisomerase द्वारा ligated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता हैऔर कोशिकाओं की पाचन अचल ischemia से क्षतिग्रस्त. विधि इस्कीमिक चोट करने के लिए मस्तिष्क की प्रतिक्रिया की जांच के लिए एक नया उपकरण है.

सक्रिय अपशिष्ट प्रबंधन फ़ैगोसाइट लेबलिंग के लिए तकनीक का सिद्धांत चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. योजनाबद्ध दर्शाता तीन चरणों में पता लगाने आगम कि. पहले कदम के जांच सक्रियण (चित्रा 1 ए) शामिल ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes at JoVE.com

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

हम सक्रिय phagocytic कोशिकाओं की सीटू लेबलिंग में चयनात्मक के लिए एक नया प्रतिदीप्ति तकनीक मौजूद है, जो स्पष्ट स्ट्रोक में सेल लाशों बंद. इस्कीमिक मस्तिष्क में मौजूद फ़ैगोसाइट के केवल एक छोटे से अनुपात कोशिका मृत्यु की निकासी में भाग लेने क्योंकि दृष्टिकोण ischemia के मस्तिष्क की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

Ligatable फ्लोरोसेंट जांच से प्रायोगिक स्ट्रोक में कोशिका मृत्यु का phagocytic क्लीयरेंस का आकलन

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

चूहे में मॉडलिंग स्ट्रोक - रेशा मॉडल के साथ मध्य प्रमस्तिष्क धमनी आड़

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

एक में स्टेम सेल प्रत्यारोपण इन विट्रो में नकली मॉडल / Ischemia reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

भ्रूण शराब एक्सपोजर Zebrafish मॉडल में teratogenic परिवर्तन का आकलन

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

इन विट्रो mesothelial क्लीयरेंस परख कि डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरण मॉडल

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

प्रायोगिक मानव न्यूमोकोकल कैरिज

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

असामान्य सूत्रीविभाजन साथ एसोसिएटेड सेल डेथ लाइव कैंसर कोशिकाओं में confocal इमेजिंग द्वारा मनाया

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

स्पाइनल कॉर्ड चोट की प्रायोगिक Contusive मॉडल में तंत्रिका स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

प्रायोगिक ग्लूकोमा चुंबकीय microspheres की नेत्र इंजेक्शन द्वारा प्रेरित

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

चूहे में पित्त नली Ligation: ऑब्सट्रक्टिव पित्तस्थिरता द्वारा भड़काऊ जिगर चोट और फाइब्रोसिस की प्रेरण

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Confocal ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा गुलाब बंगाल Photothrombosis<em&gt; Vivo</em&gt;: एक पोत स्ट्रोक का एक मॉडल

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...