Name: assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes
Uploaded: 2014-05-27T13:00:00
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이 연구는 신경 장애의 국립 연구소에서 부여 R01NS062842과 건강 (VVD)의 스트로크, 국립 연구소에 의해 및 신경성 질환의 국립 연구소와 ARRA를 통해 건강의 치기, 국립 연구소 (VVD)과 R21에서 보조금 R21 NS064403에 의해 지원되었다 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 EB006301 국립 연구소, 건강의 국립 연구소 (VVD).

방법은 포름 알데히드 고정 된 파라핀 조직 절편에 적합하다. 이 기술은 쥐 실험 스트로크 여기의 응용 프로그램에서 보여줍니다. Tyramide 신호 증폭 (TSA) 시스템 1. 준비 구성 요소 TSA 기반 향상이 반응을 준비하고, 라벨의 마지막 단계에 사용되지만 이상의 시간이 걸릴 수 있습니다. 그 때문에, 표시를 시작하기 전에 TSA 시약을 만드는 것이 편리하다. <ol...

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	<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., M&#252;ller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li><li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke.">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li><li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke.">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li><li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase.">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK/Cdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo.">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809 (2012).</li><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks.">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li></ol>

이 비디오에서 우리는 초점 뇌 허혈에있는 투명 세포 죽음을 활성화 식세포 레이블을하는 방법, 조직 섹션 형식으로 보여줍니다. 제시된 기술은 구체적으로 침몰하고 적극적으로 세포 시체를 소화들만 폐기물 관리 셀 라벨 첫 번째 방법입니다. 이것은이 기능이 없습니다 식세포의 라벨에 대한 기존의 방법에 대한 유익합니다. 두 번 좌초 침몰 핵 소화하는 동안 폐기물 관리 ...

허혈성 뇌졸중은 영향을받는 뇌 조직에 큰 변화를 유도한다. 그것은 미세 아교 기원 주민 식세포의 급속한 활성화로 연결하는 대규모 세포 죽음을 시작합니다. 또한 호중구, 대 식세포, 수지상 및 비만 세포 1,2 등의 혈액에서 파생 된 전문 식세포의 여러 유형에 의해 허혈성 뇌의 침투를 설정합니다. 그것은 여전히​​ 허혈 손상이 반응이 긍정적 또는 부정적인 역할을할지 여부를 논의한다. 그것은 죽은 세포를 지우고 염증을 억제하기 때문에 뇌졸중 다음 식균 작용이 도움이 될 수 있지만, 그것은 또한 신경 세포의 생존에 영향을 미치는 조직의 손상 1-5 악화 유해 활성 산소 종을 생성합니다. 식세포의 여러 종류가 허혈성 뇌에 침투하는 동안, 그들 모두는 세포 시체를 덮어 회생 과정 1 ~ 3을위한 방법을 취소하여 폐기물 관리에 참여한다. 이 CR뇌졸중 세포 죽음의 식세포를 실행할 것을 폐기물 관리 세포의 선택적 식별​​을위한 요구 사항을 eates. 능동 폐기물 관리 셀을 묘화 할 때, 그들은 잠겼 셀 시체 저하 얼마나 효율적의 질문에 응답하는 것도 중요하다. 그것은 자기 면역 병리학 핵 물질 (6)의 방출을 방지하기 때문에 식균 작용에 죽어가는 세포의 DNA의 유효하고 완전 분해가 필수적이다. 여기에서 우리는 활성 식세포의 마커로 특정 DNA 나누기를 사용하여 새로운 프로브를 제시한다. 이 서명 나누기 독점적 기능 폐기물 관리 세포 내부에 가득 채우고 핵의 분해시 생성된다. 따라서 프로브는 선택적으로 침몰 만 식세포 레이블을 적극적으로 세포의 시체를 소화. 그들은 또한 말림 후 강도와 DNA 파괴의 완료를 관찰 허용합니다. 프로브는 강도와 effici의 평가에 도움이됩니다식세포 정리의 ency. 새로운 프로브는 비 단백질 기반의 마커에 의존하기 때문에 광범위한 허혈성 손상은 세포의 형태를 중단 시키거나, 특히 핵심 허혈성 영역 안에, 단백질 기반의 마커를 고갈시킬 뇌졸중의 연구에 특히 유용 할 수 있습니다. 기술의 원리는 그림 1에 제시되어있다. 그림은 효소 우두 토포 이소 머라 제 (VACC TOPO)로 결찰 머리핀 모양의 올리고 뉴클레오티드 프로브를 보여줍니다 5&#39;OH DNA에 DNA 소화 7시 리소좀 DNA 분해 효소 II에 의해 생성 끝납니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="696">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:312px;">Name of the reagent or material</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:129px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9490-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td colspan="2">Vivid Technologies</td>
			<td>5 pmol/&#956;L stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3&#8217; ; B &#8211; Biotin-dT; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Adapter Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TAG AAT CGT ATC-3&#8217;; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl, PH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSA, Fluorescein System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Rat Brain Sections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6&#956;m-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Video camera and software</td>
			<td>Micromax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes

우리는 초점 뇌 허혈에 식세포 정리의 시각화를위한 새로운 조직 화학적 방법을 설명합니다. 접근 방식은 모든 세포 계보의 폐기물 관리 식세포에 의한 뇌졸중의 죽은 세포의 제거에 대한 연구를 허용합니다. 식균 작용의 능력이 서로 다른 기원의 수많은 세포가 허혈성 뇌에 존재하지만, 그 중 일부는 적극적으로 침몰 세포 시체를 소화. 선택적 시각화, 정량화 및 능동 식세포 폐기물 관리의 분석은 허혈 뇌의 반응을 평가하는데 도움이됩니다. 그것은 이후의 재생 공정을위한 길을 열어 효율적인 세포 죽음의 간극은, 허혈성 뇌 손상에서 복구를 위해 중요합니다. 시체를 청소하는 고장이 아닌 성능이 저하 된 DNA와 단백질에 의한 유해 반응이 발생할 것입니다. 설명 된 절차는 선택적으로 말림 동안 모든 식세포에서 생산 특성 DNA 나누기에 바이러스 토포 이소 머라 제에 의해 결찰 형광 프로브를 사용세포의 소화 비가 역적 허혈 손상. 이 방법은 허혈 손상에 대한 뇌 반응의 조사를위한 새로운 도구입니다.

활성 폐기물 관리 식세포 레이블을 지정하는 기술의 원리는 그림 1에 제시되어있다. 회로도 보여줍니다 세 단계에서 검출 진행하는. 첫 번째 단계는 프로브 활성화 (도 1a)를 포함한다; 두 번째 단계에서 활성화 된 프로브는 조직 절편 (도 1C)에있는 특정한 DNA 나누기로 결찰된다; 세 번째 단계는 형광 신호 증폭 (도 1D)을 포함한다. 다음 상세한 설?...

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Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

우리는 활성화 된 대 식세포의 현장 라벨의 선택을위한 새로운 형광 기술을 제시하는 명확한 행정의 세포 시체 끕니다. 허혈성 뇌에 존재하는 식세포의 단지 작은 비율이 세포 죽음의 정리에 참여하기 때문에 방법은 국소 빈혈에 대한 뇌의 반응을 평가하는 것이 중요합니다.

Ligatable 형광 프로브에 의한 실험 스트로크에서 세포 죽음의 식세포 정리 평가

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Research

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Medicine

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