Name: assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes
Uploaded: 2014-05-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом R01NS062842 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных Институтов Здоровья (ВСД) и грантами R21 NS064403 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных Институтов Здоровья через ARRA (ВСД) и R21 EB006301 Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии, Национальные институты здравоохранения (ВСД).

Метод подходит для формальдегида парафиновых срезах тканей. Методика демонстрируется здесь в своем применении экспериментального инсульта у крыс. 1. Подготовка Компоненты для Tyramide Усиление сигнала (TSA) Система Хотя повышение TSA основе используется в закл?...

<ol>
	<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., M&#252;ller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).</li><li>Faustino, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+contribute+to+endogenous+brain+defenses+after+acute+neonatal+focal+stroke.">Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke.</a> J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).</li><li>Thored, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+accumulation+of+microglia+with+proneurogenic+phenotype+concomitant+with+persistent+neurogenesis+in+adult+subventricular+zone+after+stroke.">Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke.</a> Glia. 57 (8), 835-849 (2009).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).</li><li>Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+classes+of+DNA+end-joining+reactions+catalyzed+by+vaccinia+topoisomerase.">Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase.</a> Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).</li><li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK/Cdc42-mediated+microglial+motility+and+gliapse+formation+lead+to+phagocytosis+of+degenerating+dopaminergic+neurons+in+vivo.">ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo.</a> Sci. Rep. . 2, 809 (2012).</li><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+irreparable+ischemic+damage+in+brain+by+selective+labeling+of+double-strand+blunt-ended+DNA+breaks.">Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks.</a> Mol. Med. 8, 818-823 (2002).</li></ol>

В этом видео мы покажем, в формате разделе ткани, как маркировать активные фагоциты, которые ясно гибель клеток в фокальной ишемии мозга. Представленная методика является первым подходом, который специально этикетки только те ячейки, регулирования отходов, которые охватили и активно п...

Ишемический инсульт вызывает глубокие изменения в пострадавших тканях головного мозга. Она также может инициировать массовую гибель клеток, что приводит к быстрому активации резидентов фагоцитирующих клеток микроглии происхождения. Он также выделяет инфильтрацию ишемической мозга с помощью различных типов крови, полученных профессиональных фагоцитов в том числе нейтрофилы, макрофаги, дендритные, и тучных клеток 1,2. Это по-прежнему обсуждается, играет ли это ответом на ишемического повреждения положительное или отрицательную роль. Хотя фагоцитоз следующие инсульта может быть выгодно, потому что она очищает омертвевшие клетки и подавляет воспаление, но и образуются токсичные активные формы кислорода влияет выживаемость нейронов и усугубляет повреждение тканей 1-5. В то время как несколько типов фагоцитов проникнуть ишемический мозг, не все из них участвуют в сточных управления на поглощение клеток трупы и расчистив путь для регенеративных процессов 1-3. Это крeates требование для селективного выявления клеток удаления отходов, которые осуществляют фагоцитарную клиренс гибели клеток при инсульте. При визуализации такие активные клетки регулирования отходов, важно также, чтобы ответить на вопрос, насколько эффективно они ухудшают охвативших сотовые трупы. Самый эффективный и полная деградация ДНК умирающего клетки в фагоцитоза важно, потому что это мешает чувство собственного иммунизации и высвобождение патологического ядерного материала 6. Здесь мы представляем новые зонды, которые используют конкретные разрывы ДНК в качестве маркеров активных фагоцитов. Эти подписи разрывы исключительно производится в течение пробоя охвативших ядер внутри функциональных клеток удаления отходов. Поэтому зонды избирательно маркировать только те фагоциты, что поглотит и активно переваривать клеточные трупы. Они также позволяют наблюдать интенсивность и завершение пробоя ДНК после охвате. Зонды являются полезными в оценках интенсивности и коэффициентами полезногоency фагоцитарной оформления. Новые зонды полагаться на маркер небелковой основе и, следовательно, может быть особенно выгодным в исследованиях инсульта, где обширные ишемические повреждения может нарушить клеточной морфологии или истощить маркеры на основе белков, особенно внутри основного ишемической зоне. Принцип метода представлена ​​на рисунке 1. На рисунке показано шпильки-образный олигонуклеотидных зондов сшивали с помощью фермента коровьей оспы топоизомеразы (VACC ТОРО) чтобы 5&#39;OH концов ДНК, порожденная лизосом аз II в процессе пищеварения ДНК 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="696">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:312px;">Name of the reagent or material</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:129px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9490-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vaccinia Topoisomerase I</td>
			<td colspan="2">Vivid Technologies</td>
			<td>5 pmol/&#956;L stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3&#8217; ; B &#8211; Biotin-dT; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Adapter Oligonucleotide</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TAG AAT CGT ATC-3&#8217;; 100 pmol/&#956;L stock in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl, PH 7.4</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSA, Fluorescein System&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>NEL701A001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">22x22mm or 22x40mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">Rat Brain Sections</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;">Rat brain taken 48 hours after reproduction of ischemic stroke as described in 11. 5-6&#956;m-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Video camera and software</td>
			<td>Micromax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td>Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing phagocytic clearance of cell death in experimental stroke by ligatable fluorescent probes

Мы описываем новую гистохимическое подход к визуализации фагоцитарной оформления в фокальной ишемии мозга. Подход позволяет изучать ликвидации отмерших клеток при инсульте по фагоцитов удаления отходов любого сотового линии. Несмотря на многочисленные клетки различного происхождения, которые способны к фагоцитозу присутствуют в ишемическом мозге, только часть из них активно поглощать и переваривать клеток трупов. Избирательное визуализация, количественная и анализ такого активного фагоцитарной сточных управления являются полезными в оценке реакции мозга к ишемии. Эффективное расстояние гибель клеток имеет важное значение для восстановления мозга от ишемического повреждения, как это открывает путь для последующих восстановительных процессов. Неспособность очистить трупы приведет к токсической реакции, вызванной Неискаженный ДНК и белков. Описанная процедура использует флуоресцентных зондов выборочно сшивали вирусной топоизомеразы к характерным разрывов ДНК, полученных во всех фагоцитов во охватеи переваривание клетки необратимо поврежденных ишемией. Метод представляет собой новый инструмент для исследования реакции мозга на ишемического повреждения.

Принцип метода для маркировки активные фагоциты регулирования отходов представлена ​​на рисунке 1. Схематическое показывает, что доходы обнаружения в три этапа. Первый шаг включает в себя активацию датчика (рис. 1А); на второй стадии активированный зонд лигируют с ко...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes at JoVE.com

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Мы представляем новую технику флуоресценции для селективного на месте маркировки активных фагоцитов, которые ясно от клеточных трупов в ход. Подход важен для оценки реакции мозга к ишемии, поскольку лишь небольшая часть фагоцитов, присутствующих в ишемической мозга участвуют в оформлении гибели клеток.

Оценка фагоцитарной оформление гибель клеток в экспериментальной инсульта на Ligatable флуоресцентных зондов

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Моделирование инсульта у мышей - окклюзии средней мозговой артерии с накаливания Модель

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Трансплантация стволовых клеток в В пробирке Имитация ишемии / реперфузии модели

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Оценка Тератогенные Изменения в модели данио рерио внутриутробного развития плода алкоголь

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

В пробирке мезотелиальной Анализ просвет, что модели ранних стадиях рака яичников Метастазы

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Экспериментальные человека перевозке пневмококковой

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Сотовые смерти, связанной с аномальными митоза Наблюдаемые конфокальной микроскопии в живых клетках рака

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neural трансплантации стволовых клеток в экспериментальной Contusive модели с повреждением спинного мозга

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Экспериментальная Глаукома индуцированная глазной инъекций магнитных микросфер

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Желчного протока Лигирование у мышей Индукция воспалительного печени травматизма и фиброза обструктивной холестаза

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Роза Бенгалия фототромбоза конфокальной оптической томографии<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель одно судно инсульта

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...