Name: isolation of mrnas associated with yeast mitochondria to study mechanisms of localized translation
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation at JoVE.com

אנו מודים בני הזוג. ארז אליהו, דניאל מלמד, Ophry פינס ודורון רפפורט לעזרה והערות במהלך הקמתה של פרוטוקול זה. עבודה זו ממומנת על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מספר 1193-1109).

1. מיטוכונדריה טיהור לשקול את גלולה של תאים. בערך 0.6 גרם מתקבלים מ100 תאים למ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 100-150 מיליליטר של תאי שמרים לOD 600 = 1-1.5 ב30 ° C במדיום גידול nonfermentable, כגון מצע גידול מב?...

<ol>
	<li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters.">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li><li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis.">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li><li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ.">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li><li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state.">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li><li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes.">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li><li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo.">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li><li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo.">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li><li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner.">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li><li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes.">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li><li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria.">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Saccharomyces+cerevisiae,+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function.">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li><li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+biogenesis:+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization.">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li><li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PUF+proteins:+repression,+activation+and+mRNA+localization.">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li><li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA.">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins:+a+cotranslational+perspective.">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays.">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li><li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria:+a+role+in+protein+complex+assembly.">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li><li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III.">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li><li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast.">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li><li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+mRNA+tracking+in+live+cells.">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li><li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells.">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li><li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondrial+transcriptomics.">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li><li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+yeast+mitochondria.">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li><li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li><li>Rieder, S. E., Emr, S. D., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. 8, (2001).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li></ol>

התקדמות טכנולוגית בתחום ההדמיה הניבה כלים ברזולוציה גבוהה ללמוד לוקליזציה mRNA. כיום, ניתן למדוד את התנועה של אפילו מולקולת mRNA אחד בזמן בקנה מידה msec 23-26. עם זאת, גישות ביוכימיות מסורתיות, כפי שתואר לעיל, גם אינפורמטיבי ועדיפים במקרים מסוימים. בידוד ביוכימיים מאפש?...

תאי אוקריוטים מאורגנים בתאים נפרדים, בעלי פונקציות ספציפיות. כדי להשיג את תפקידה, כל תא מכיל מערך ייחודי של חלבונים שחיוניים לפעילותו. מנגנון אפשרי שבאמצעותו חלבונים אלה מתקרבים התא שלהם הוא על ידי 1,2 תרגום לשפה מקומי. בתהליך זה, החלבון מסונתז ביעד שלה על ידי הריבוזומים וmRNAs שנמצאים שם. בין היתרונות האפשריים של תרגום מקומי גדלו יעילות של מיקוד חלבון, ירידה בצורך במלווי חלבון, ומאפשר למנגנוני רגולציה ספציפי לאתר. כמו כן, mRNAs והריבוזומים מקומיים יכולים להיות מאגר מבודד של מכונות תרגום במקרים של מתח הסלולר, כאשר תרגום כללי הוא עצור. מיטוכונדריה הפכה בשנים האחרונות מודל מרכזי ללמוד תרגום מקומי. רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין, המתורגם בcytosol,ומיובא לאברון. קווים שונים של ראיות מצביעים על כך שרבים מחלבונים אלו מיוצרים בתהליך תרגום מקומי. בתחילה, לימודים במיקרוסקופ אלקטרונים וחלוקה ביוכימיים זוהו הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה 3-5. מחקרים אלה שבו ולאחר מכן אומתו in vivo על ידי עבודה על mRNAs הספציפי, שנמצאו להיות מיובאים רק ב6,7 אופן cotranslational. מחקרי הגנום של mRNAs שיתוף עם המיטוכונדריה חשפו כי חלק משמעותי של mRNAs הם מקומיים לסביבת מיטוכונדריה 8-10. חלקם של mRNAs אלה התאפיינו נוספים על ידי in vivo הקרינה שיטות, כגון דגים או mTAG 9,11. פרשנות ישר קדימה של עמותה זו היא שmRNAs אלה משמש כתבניות לתרגום לשפה מקומית. המנגנונים שבאמצעותם mRNAs אלה מתקרבים למיטוכונדריה אינם ידועים. תחומים noncoding (רוב significantl3 UTRs &#39;y) הוצג להיות מעורב בmRNA העמותה למיטוכונדריה 12. תחומים אלה עשויים לשמש כאתר קישור לחלבוני קושרי RNA אשר מתווכים התחבורה שלהם. מחקרים בשמרים גילו כי חבר של משפחת PUM של חלבונים (Puf3) תומך בעמותת mRNA עם מיטוכונדריה 8,13. תפקיד מתקבל על הדעת לPuf3, המבוסס על פונקציות של בני משפחה אחרים, הוא לעכב תרגום ואילו את ה-mRNA הוא הדרך 14. לפיכך, mRNAs עשוי להיות מועבר במעמד nontranslated, על ידי חלבוני RNA מחייבים כי אינטראקציה עם אזורי noncoding. לחלופין, גוף עבודות גדול מצביע על כך שהתחבורה מתרחשת בזמן שהחלבון הוא להיות מסונתזת. בפרט, מעכבי תרגום הוצגו להשפיע mRNAs עמותה 8,13. יתר על כן, תכונות תורגמו כגון אוגוסט, רצף של המיטוכונדריה מיקוד (MTS) או אזורי ORF הוצגו כדי לסייע בלוקליזציה 8,11,15. ch חלבון HSP70 משפחתיaperone וקולטן חלבונים על הקרום החיצוני מיטוכונדריה הוצגו גם כדי לתמוך בעמותת ה-mRNA, רומזים עוד כי תכונות מקודדות חלבונים חשובות ללוקליזציה mRNA 16. זה עולה בקנה אחד עם מודל שבו החלבון המתעוררים-הריבוזום משמש כאלמנט הכרה למיקוד מורכב mRNA-הריבוזום חלבונים למיטוכונדריה 17. תרגום מקומי ליד המיטוכונדריה נחקר על ידי שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים (כדי להמחיש הריבוזומים) 3, דגים 9, RNA הירוק (כדי לזהות mRNAs הספציפי) 11, וחלוקה ביוכימי (כדי לזהות שני RNA וריבוזומים) 10,18. בעוד השיטות לשעבר לזהות לוקליזציה in vivo ועשויות לאפשר הדמיה של דינמיקת תחבורה, האחרון מאפשר זיהוי של mRNAs שונים בניסוי יחיד. יתר על כן, לתחומים קידוד חלוקה ביוכימי או noncoding לא צריך להיות אלחזרתי אחורנית, ולכן ניתן להעריך התפקידים הספציפיים שלהם. חלוקה ביוכימיים שמשה בהצלחה במשך שנים רבות, לבידוד תרמי של תאים סלולריים שונים. מנהלים ומגבלותיו מבוססים היטב, ואפשר בקלות לשנות את הפרוטוקולים קיימים למטרות שונות. המכשור הדרוש הוא סטנדרטי במעבדות רבות, ולכן הוא בדרך כלל השיטה הראשונה לבחירה ללימוד לוקליזציה תאית. אנו מתארים פרוטוקול שהיה מותאם לבידוד של mRNAs בעוד הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה. פרוטוקול זה הוא אפוא אופטימלי לחקר גורמים המעורבים בתרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="969">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BactoPeptone</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Do not autoclave Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Growth medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 M TrisHCl pH9.4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mM TrisHCl pH7.6</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 mM DTT Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.2 M Sorbitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">4 mM KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">16 mM K2HPO4</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.2&#956;m filter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Zymolyase Buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this&#160; buffer (0.2&#956;m) and keep at room temperature for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Zymolyase 20T&#160;</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">20,000 U/gr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recovery medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.6 M Mannitol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM MgAc</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM KCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5 mg/mL Heparin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Mannitol Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8M Guanidinium-HCl</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;100% and 70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;3 M Sodium Acetate pH5.2</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;10 M LiCl stock solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 mM Tris HCl pH 6.8</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Glycerol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenolblue</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;4xLSB</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;">250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% &#946;-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:563px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mrnas associated with yeast mitochondria to study mechanisms of localized translation

רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין וצריך להיות מיובא לתוך אברון. יבוא עלול להתרחש בזמן שהחלבון מסונתז ליד המיטוכונדריה. תמיכה באפשרות זו נגזר ממחקרים שנעשה לאחרונה, שבו mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה הוצגו להיות מקומי כדי קרבת מיטוכונדריה. יחד עם הפגנות קודמות של העמותה &#39;הריבוזומים עם הקרום החיצוני, תוצאות אלו מצביעות על תהליך תרגום מקומי. תרגום מקומי כזו עשויה לשפר את יעילות יבוא, לספק אתרי רגולציה ייחודיים ולמזער מקרים של ביטוי מחוץ לרחם. מגוון שיטות שימשו כדי לאפיין את הגורמים ומרכיבים אשר מתווכים תרגום מקומי. תקן בין אלה הוא חלוקה subcellular על ידי צנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה יש את היתרון של בידוד של mRNAs, ריבוזומים וחלבונים בהליך אחד. אלה אז יכולים להיות מאופיינים על ידי מולקולריים ודו שוניםשיטות ochemical. יתר על כן, ניתן ליישם שיטות transcriptomics ופרוטאומיקה לחומר וכתוצאה מכך, ובכך לאפשר לתובנה הגנום כולו. הניצול של שמרי כאורגניזם מודל למחקרים מסוג זה יש את היתרונות של מהירות, עלויות ופשטות. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים וזני מחיקה זמינים להקל על אימות של גורמי מועמד.

פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של חלק המכיל את המיטוכונדריה מרכיבי cytosolic. הדרך הטובה ביותר לבחון את הצלחתה היא לבצע ניתוח צפוני וניתוח מערבי (איור 1) לדגימות מצעדי הבידוד השונים. שלושה פרמטרים לאיכות הבידוד נגזרים מניתוחים אלו. ראשית, אם RNA או חלבונים בדגימות הם שלמי...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation at JoVE.com

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

יישום של תנועת ראש פסיבית ליצירת תאוצות מוגדרות בראשי מכרסמים

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...