Name: myelin oligodendrocyte glycoprotein (mog35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) in c57bl/6 mice
Uploaded: 2014-04-15T19:00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB).

En. Generelle kommentarer til Muse Experiments <ol><li> Alle eksperimenter med mus bør utføres i samsvar med retningslinjene i de respektive institusjonelle dyr omsorg og bruk komité. </li><li> Hold mus henhold patogen frie forhold og sette dem i stand til å ha tilgang til mat og vann ad libitum. Merk: Det er viktig å bruke alders-og kjønns matchet mus i eksperimentelle grupper fordi mottakelighet for sykdom kan variere med alder og kjønn. </li><li> Avhengig av de valgte eksperimentelle forhold, kan en humbug-vaksinert kontrollgruppe vurderes hvor MOG 35-55 peptid er erstattet av enten PBS uten antigen eller en nonencephalitogenic peptid. </li><li> Vennligst vurdere metodiske aspekter før startforsøk (se også nedenfor). Vi anbefaler å involvere en eller to blindet observatører for EAE scoring. </li></ol> 2. Utarbeidelse av MOG 35-55 Emulsion <ol><li> 200 ul av en 1:1-forhold av MOG 35-55 peptidoppløsningen og CFA bør injiseres hver mus. Det er noe tap av den viskøse emulsjon under klargjøring og injisere. Derfor forberede 1,5-2x av den nødvendige mengden. Beregn det totale volum av emulsjonen og dividerer med to for å få de nødvendige mengder av begge MOG 35-55 peptidoppløsningen og CFA. </li><li> Fortynn lyofilisert MOG 35-55 i DDH 2 O til en sluttkonsentrasjon på 2 mg / ml. Vi bruker vanligvis 200 mg MOG 35-55 peptid per mus. Denne mengde er inneholdt i 100 ul av stamløsningen. Peptidoppløsningen bør lagres ved -20 ° C. </li><li> Plasser innholdet av en ampulle med revet Mycobacterium tuberculosis H37RA (100 mg) i en morter. <ol><li> Bakke med morter og støter for å oppnå en tynn pulver. </li><li> Tilsett 10 ml av Freunds ufullstendige adjuvans for å oppnå en 10 mg / ml CFA stamløsning som kan lagres ved 4 ° C. </li><li> Før immunisering, fortynne CFA stamløsning viddh IFA til en sluttkonsentrasjon på 2 mg / ml. Bland grundig før hver bruk for å resuspendere partikkelformig materiale og vurdere noen volumtapet av den viskøse løsning i løpet av forsøkspreparater. </li><li> Bland 1:1 med MOG 35-55 peptid-oppløsning inntil sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml er nådd. FORSIKTIG: Varme drept Mycobacterium tuberculosis stimulerer det medfødte immunrespons. Unngå innånding, svelging og kontakt med hud og øyne. </li></ol></li><li> Precool løsninger på is. <ol><li> Tegn opp 1 ml av 2 mg / ml CFA og 1 ml av 2 mg / ml MOG 35-55 oppløsning i to 2 ml sprøyter. Beregn det antall sprøyter som er nødvendige i henhold til antallet av immuniserte dyr. FORSIKTIG: Strengt unngå å sy under forberedelse av adjuvans som det kan føre til granulomer eller indusere autoimmune reaksjoner. </li><li> Bruk en 27 G kanyle for MOG 35-55 løsning og en 20 G kanyle for CFA. Unngå luftbobler og koble begge sprøyter med påhree-veis-ventil. </li><li> Sende emulsjonen fra en sprøyte til den andre, og bland grundig i minst 10 minutter som en god emulgering er et kritisk trinn. Nær-lukke tre-veis-ventil for å støtte emulgering. Oppløsningen bør være hvitt, stivt og seigt uten separering av fasene. </li><li> Emulsjon kan lagres i flere dager før immunisering. Vent i minst 30 minutter etter fremstilling av emulsjoner for å observere hvorvidt de er stabile. Før immunisering, trekk oppløsningen inn i en av to sprøyter og koble en 27 G kanyle. </li></ol></li></ol> Tre. Utarbeidelse av Kikhoste Toxin <ol><li> Forskjellige mengder av pertussis-toksin kan bli funnet i litteraturen, som også avhenger av administrasjonsvei (for eksempel intravenøst ​​eller intraperitonealt). Våre laboratorie benytter 400 ng av pertussis-toksin i 200 pl PBS intraperitonealt på dagen for immunisering, og to dager senere. FORSIKTIG: Kikhoste toksinet har mange biologiske effekter. Unngå innånding, svelging og kontakt med hud og øyne. </li><li> Rekonstituer 50 ug av pertussis-toksin i 500 mL DDH 2 O for en 100 mg / ml stamløsning. Oppbevar ved 4 ° C. </li><li> Fortynn 1:50 med PBS. 200 ul inneholder nå 400 ng av PBS. Forbered den nødvendige mengden av sprøyter og vurdere en ekstra overflødig volum på ~ 100 mL for hver nål hub. </li></ol> 4. Animal Immunization <ol><li> Vennligst referer til den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité for spesifikke kriterier for nødvendig kortsiktig dødshjelp. Vårt laboratorium benytter kort narcotization med isofluran mens andre protokoller som ketamin / xylazin injeksjon eller halothan kan også være mulig. Vent på anestesi og bruke en foran foten tå klype for å vurdere nivået av anestesi. </li><li> Sørg for at immunisering er utført av en erfaren person til å minimere stress for dyrene og for å sikre optimal immunisering. </li><li> Injisere 100 mL av antigen / CFA emulsjon subkutant i to forskjellige steder på hver hind flanke. Påse at den oppsvulmede masseformer under huden som skal vedvare gjennom hele eksperimentet. </li><li> Injisere 200 mL av pertussis toksin intraperitonelly. </li><li> Sørg for at den enkelte mus enkelt kan identifiseres for daglig evaluering, for eksempel ved å fargemarkeringer på halen basen. </li><li> Administrere en andre dose av kikhoste toksin på dag to etter immunisering. </li></ol> 5. EAE Monitoring <ol><li> Vekt og klinisk poengsum bør vurderes daglig. Utbruddet av EAE korrelerer vanligvis med vekttap, noe som kan benyttes som en indikator for sykdomsaktivitet. Vennligst referer til den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité for å forhåndsdefinere kriterier når enkelte mus må tas ut av eksperimentene. Dette bør tas i betraktning når vekttap overstiger 20% av den opprinnelige kroppsvekt eller når alvorlige kliniske tegn (EAE score 7 eller verre) forekomme. Vennligst henvis til reAlle øvrige som retningslinjer for de respektive institusjonelle dyr omsorg og bruk komité for tillatt maksimal score. </li><li> Da mus har kliniske symptomer av EAE, er det viktig å sikre at vann flasken kan fortsatt bli nådd, og at maten er plassert på gulvet i buret. </li><li> Ulike scorings symptomer kan brukes. I vårt laboratorium er etablert en 0-10 skala. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Grad </td><td> Klinisk tegn </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Ingen kliniske tegn </td><td> Normal gange, hale trekk og kan heves, wraps hale rundt en rund gjenstand hvis musen holdes ved haleroten </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Delvis halte hale </td><td> Normal gange, tuppen av halen siger ned </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Lammet hale </td><td> Normal gange, siger ned halen </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Hind lem pareser, ukoordinert bevegelse </td&gt; <td> Ukoordinert gangart, hale halter, baklemmene svare på klyping </td></tr><tr><td> 4 </td><td> En hind lem lammet </td><td> Ukoordinert gangart med en hind lem dra, hale halter, gjør man hind lem ikke svare på klemme </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Begge bakbena lammet </td><td> Ukoordinert gangart med begge bakbena dra, hale halter, gjør begge bakbena ikke svare på klemme </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Baklemmene lammet, svakhet i forbein </td><td> Ukoordinert gangart med forbein sliter med å trekke kroppen, forbein refleks etter klemming, halter hale </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Baklemmene lammet, ett forbena lammet </td><td> Mus kan ikke bevege seg, svarer én forbena til tå klype, halter hale </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Baklemmene lammet, begge forbein lammet </td><td> Mus kan ikke bevege seg, begge forbein ikke svare på tå klype, halter hale </td></tr><tr><td> 9 </td&gt; <td> Døende </td><td> Ingen bevegelse, endret puste </td></tr><tr><td> 10 </td><td> Død </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 1. Klinisk scoring system.

<ol>
	<li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+a+complicated+picture+of+autoimmunity.">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li><li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation:+the+world+is+not+enough.">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li><li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis.">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li><li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+multiple+sclerosis.">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li><li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li><li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+men:+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis.">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li><li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EAE:+an+immunologist's+magic+eye.">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li><li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li><li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice:+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells.">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li><li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund's+adjuvant:+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells.">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Et mangfold av ulike EAE modeller med aktiv immunisering protokoller har blitt beskrevet de siste tiårene. Mens rottemodeller har vært mye brukt inntil nylig, mus er nå den mest populære modellorganisme for EAE forskning. Denne utviklingen er blant annet på grunn av den omfattende og stadig økende repertoar av tilgjengelige transgene mus. Immunisering av C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptidet er en av de mest utbredte EAE-modeller, og kan betraktes som en pålitelig og repliserbar og godt å bruke dyremodell. I mange neuroimmunological laboratorier, er MOG 35-55 indusert EAE etablert som modell for valg mens andre EAE modeller brukes til mer spesifikke eksperimentelle spørsmål. Et kritisk punkt å vurdere er planleggingen av den eksperimentelle innstillinger for å sikre at EAE eksperimenter utføres metodisk korrekt. For intern validitet, er blindet scoring av sykdom symptomer anbefales. Kompetanseimental grupper bør være alders, vekt-og sex-matchet og mus bør være tilfeldig fordelt til behandlingsgruppene. Eksperimenter skal alltid utføres i samsvar med dyrevern forskrifter. EAE studier er ofte underpowered og ikke tar hensyn til statistiske type II feil. Derfor, før forsøk, beregninger prøvestørrelse bør utføres. Nødvendige gruppe størrelser er avhengig av den forventede effektstørrelse. Høring av en ekspert for statistisk analyse kan tas i betraktning før du starter EAE eksperimenter. Noen begrensninger i protokollen må holdes i bakhodet. Viktigst er tolkningen av aEAE data kompromittert av modusen for immunisering ved bruk av hjelpestoff-og pertussis-toksin som har både ekstra innflytelse på den immunologiske reaksjon. Det bør også tas i betraktning at MOG 35-55 EAE-modellen viser i hovedsak en CD4 + T-celle drevet immunologisk respons. CD8 + T-celler og B-celler spilleren mindre fremtredende rolle og alternative protokoller bør vurderes når du adresserer disse celletypene. Den forventede sykdomsforløp er akutt, monofasisk og selvbegrensende. Alternativt kan en relapsing-remitting sykdomsforløpet også oppnås i alternative EAE modeller. En annen viktig begrensning av protokollen er en viss skjevhet mot den immunologiske komponent av MS patofysiologi. I løpet av de siste årene har det blitt stadig klarere at MS har en sterk nevrodegenerativ komponent. Den døde oligodendrocytes og nevroner resultater i en progressiv oppbygging av nevrologiske underskudd. Det må tas hensyn til at EAE modellen ikke kan være fullt egnet til å ta eksperimentet spørsmål om nevrodegenerative mekanismer for autoimmun betennelse. Alternative dyremodeller med fokus på CNS patologi kan betraktes - f.eks cuprizone modell som kompromisser giftig demyelinisering uten involvering av perifer immunsystemet. Den beskrevne protokollen anses som en grunnleggende neuroimmunological eksperimentell modell og kan endres for andre programmer. Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor kan lett anvendes på andre EAE protokoller ved varierende muse-stammer, eller type og mengde av protein (f.eks bruke PLP 139-151 peptid og SJL mus for en remitterende EAE sykdomsforløpet som er spesielt egnet for vurdering av terapeutisk virkninger på tilbakefall). Den beskrevne protokoll kan også brukes for adoptive overføringsforsøk (passive EAE). I denne modellen blir C57BL / 6 mus immunisert med MOG 35-55 peptid og CFA som beskrevet ovenfor. I kontrast er pertussis toksin ikke nødvendig. Etter 7-15 dager, milt eller lymfeknuter er isolert og immunceller er restimulert in vitro med MOG 35-55 peptidet og forskjellige cytokiner før overføring til en ny gruppe av C57BL/6se mus. Disse mottaker musene utvikler EAE noen dager tidligere enn på clasSical immunisering. In vitro-betingelsene kan varieres etter spesielle immunologiske spørsmål (f.eks polarisering inn i T H T H 1 eller 17 celler). Noen ganger kan lav sykdom forekomst eller svake symptomer være et eksperimentelt utfordring. Noen anbefalinger for feilsøking er: - Disease alvorlighetsgraden kan varieres med ulike mengder av peptid / mus. - Optimal CFA konsentrasjonen kan variere 1-5 mg / ml. Vurdere en titrering av CFA ved etablering av forsøkene. Vennligst referer til de respektive retningslinjer for de respektive institusjonelle dyr omsorg og bruk komité for tillatt CFA konsentrasjoner så mange forskrifter forby CFA konsentrasjoner som overstiger 2 mg / ml. - Ulike metoder er beskrevet for å forberede emulsjonen. Alternative metoder som virvling for en time eller lydbehandling kan vurderes hvis dårlig emulgering regnes som possible feilkilde. - Alder, kjønn, årstid og miljøforhold innenfor dyret anlegget er viktige faktorer som påvirker EAE mottakelighet. Det bør sikres at forholdene er sammenlignbare mellom uavhengige eksperimenter. Som beskrevet ovenfor, kan den nevnte protokoll brukes som utgangspunkt for adoptive EAE eksperimenter. Denne modellen er spesielt egnet for separering av perifere og CNS-effekter av en genetisk fenotype (for eksempel ved å overføre encefalitogeniske knockout cellene inn i villtype mottaker mus) og for spesifikke immunologiske spørsmål som fenotypen av de overførte cellene kan karakteriseres grundig. Den siste utviklingen i EAE forskning i løpet av de siste årene er T celle reseptor transgene mus. Disse musene utvikler EAE symptomer spontant uten ytre påvirkning å omgå problemet med adjuvant inokulering. Imidlertid krever denne modellen store mengder dyr for breeding å sikre tilstrekkelige gruppe størrelser. Evaluering av knockout mus krever kryssing før EAE eksperimenter i motsetning til aEAE. Ettersom hver mus utvikler sykdom symptomer på en annen dag, kan evalueringen av nye stoffer være ganske komplisert. Derfor forblir verdien av klassisk aEAE for neuroimmunological uimotsagt.

Multippel sklerose (MS) er en kronisk demyelinerende inflammatorisk sykdom i sentralnervesystemet, karakterisert ved at ødeleggelsen av oligodendrocytter og nevroner resulterer i heterogene og samler kliniske symptomer. MS er regnet som en prototypic autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) og dyremodeller har blitt utviklet for å belyse sin komplekse patogenesen. Videre er nåværende terapier er bare delvis effektive, og målet hovedsakelig den inflammatoriske fase av sykdommen, mens den neurodegenerative komponenten er sannsynligvis den største utfordring for fremtidig terapeutisk nærmer seg 1,2. Mens den eksakte etiologien av sykdommen er fremdeles usikker, er en autoimmun reaksjon mot epitoper på myelinlaget av aksoner i sentralnervesystemet antatt å provosere utbruddet av sykdommen. Feilregulering av immunsystemet, genetisk sårbarhet og miljøfaktorer (f.eks infeksjoner, vitamin D) antas åpåvirke sentrale aspekter ved de patofysiologiske mekanismene for MS. Tre ulike typer dyremodeller er i dag etablert for utforskning av patologiske mønstre av MS: Viral modeller som Theiler sin murine encefalomyelitt virus (TMEV), modeller indusert av giftstoffer som cuprizone, og til slutt ulike varianter av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) 3, 4. Selv om de alle etterligne funksjonene i MS, skiller de seg enormt i underliggende patologiske funksjoner som involvering av det adaptive immunsystemet. EAE er den mest vanlige dyremodell som den er spesielt nyttig for å undersøke neuroinflammatory trasé og ofte tjener som et &quot;bevis-for-prinsipp&quot; modell for effekten av nye behandlingsstrategier 5,6. EAE kan induseres i mange forskjellige dyr (for eksempel mus, rotter, miniswine, marsvin, kyllinger, eller primater). Imidlertid har musene blitt den mest utbredte bruk arter som er i det minste delvis på grunnå utvide repertoaret av sofistikerte transgene eller knockout mus 7. Patofysiologien av EAE er basert på reaksjonen av immunsystemet mot hjerne-spesifikke antigener. Denne reaksjonen induserer betennelse og ødeleggelse av antigen bærekonstruksjoner, noe som resulterer i nevrologiske og patologiske funksjoner sammenlignbare som de som ble observert hos MS-pasienter. Tre ulike tilnærminger kan skilles: Aktivt-indusert EAE (aEAE; aktiv immunisering), passivt overført EAE (pEAE; overføring av encefalitogeniske celler fra en immunisert dyr), og mer nylig spontane EAE musemodeller (sEAE) som gjør at studiet av autoimmune mekanismer uten eksogen manipulasjon. Den enkleste induserbar modellen er aEAE i mus givende i raske og robuste resultater. Denne modellen er regnet som &quot;gullstandarden&quot; av neuroimmunological dyremodeller av mange forskere på feltet åtte. For aEAE induksjon, dyreter immunisert med en subkutan injeksjon av en emulsjon som består av det valgte antigen, og Freunds fullstendige adjuvans (CFA) ledsaget av en intraperitoneal injeksjon av pertussis toxin på dagen for immunisering, og to dager senere. Følgelig er myelin-spesifikke T-lymfocytter aktiveres i periferien og migrere inn i CNS over blod-hjerne-barrieren. Ved registrering i CNS, er T-celler aktiveres av lokale og infiltrere antigenpresenterende celler som resulterer i påfølgende inflammatoriske kaskader, involvering av andre celler som monocytter eller makrofager og til slutt i demyelinisering og aksonal celledød ni. Avhengig av immuniseringsprotokollen, og kombinasjoner av musestamme (f.eks C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) og antigen (f.eks myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG), myelin basisk protein (MBP), myelin proteolipid protein (PLP)), sykdommen Selvfølgelig kan ta en akutt, kronisk progressiv eller relapsing remitting sykdomsforløpet. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; C57BL / 6 mus har blitt den mest brukte belastning for transgene mus konstruksjon og et voksende mangfold av knockout eller transgene mus er tilgjengelig. Vi her beskriver en protokoll for immunisering av C57BL / 6 mus med MOG 35-55 peptid 10 som resulterer i en monofasisk EAE med første symptomer etter 9-14 dager, sykdom maksimalt ca 3-5 dager etter sykdomsutbruddet og treg og delvis symptom utvinning i løpet av de neste 10-20 dagene. Som det immunogene potensial av MOG 35-55 peptidet alene er ikke tilstrekkelig til å fremkalle sykdommen, hjelpemidler slik som CFA er nødvendig. Det antas, at komponentene i CFA aktivere mononukleære fagocytter som induserer fagocytose av disse molekylene og sekresjon av cytokiner. Dette resulterer i en forlengelse av nærvær av antigener, og en mer effektiv transport av disse til det lymfatiske system. EAE-induksjon lettes ved anvendelse av pertussis toksin (PT), som er blant annet blitt foreslått å modulereblod-hjerne-barrieren, og den immunologiske respons i seg selv 11. Etter sykdom induksjon, må man være spesielt forsiktig for daglig evaluering av mus for sykdomssymptomer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Jackson Laboratory, Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Pepceuticals Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Incomplete Freund&#8217;s adjuvant (IFA)</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:119px;">F5506</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes, 1 ml with 26G3/8 needle&#160;</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes, 2 ml</td>
			<td style="width:205px;">e.g. B. Braun</td>
			<td style="width:119px;">7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needles, 25G5/8 and 30G1/2&#160;</td>
			<td style="width:205px;">e.g. Becton Dickinson &#38; Co.,</td>
			<td style="width:119px;">305122, 305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Three way halve</td>
			<td style="width:205px;">e.g. B. Braun</td>
			<td style="width:119px;">16494 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pertussis toxin, lyophilized in buffer</td>
			<td style="width:205px;">Enzo Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:119px;">BML-G100</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M. tuberculosis H37 RA</td>
			<td style="width:205px;">BD Difco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">231141</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myelin oligodendrocyte glycoprotein (mog35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) in c57bl/6 mice

Multippel sklerose er en kronisk neuroinflammatory demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet med en sterk neurodegenerative komponent. Mens den eksakte etiologi av sykdommen er ennå uklart, er autoreaktive T-lymfocytter tenkt å spille en sentral rolle i sin patofysiologi. MS terapi er bare delvis effektiv så langt og forskningsinnsats fortsette å utvide vår kunnskap om patofysiologien av sykdommen og for å utvikle nye behandlingsstrategier. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er den mest vanlige dyremodell for MS deler mange kliniske og patofysiologiske funksjoner. Det er et bredt mangfold av EAE modeller som reflekterer ulike kliniske, immunologiske og histologiske aspekter av menneskelige MS. Aktivt-indusert EAE i mus er den enkleste induserbar modell med robuste og kopier resultater. Det er spesielt egnet for å undersøke effekten av narkotika eller av bestemte gener ved hjelp av transgene mus utfordret av autoimmune neuroinflammation. Derfor blir musene immunisert med CNS-homogenater eller peptider av myelin proteiner. På grunn av den lave immunogene potensial av disse peptidene, er kraftige adjuvanser anvendes. EAE følsomhet og fenotype avhenger av den valgte antigen og gnager belastning. C57BL / 6 mus er ofte brukt påkjenning for transgen muse konstruksjon og svare bl.a. til myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG). Den immunogene epitop MOG 35-55 blir suspendert i Freunds fullstendige adjuvans (CFA) før immunisering og pertussis toxin anvendes på dagen for immunisering, og to dager senere. Mus utvikle en &quot;klassisk&quot; selvbegrensende monofasisk EAE med stigende slapp lammelse innen 9-14 dager etter vaksinasjon. Mus evalueres daglig bruker en klinisk scoring system for 25-50 dager. Spesielle hensyn til omsorg tar av dyr med EAE samt potensielle bruksområder og begrensninger av denne modellen blir diskutert.

Etter immunisering, mus har til å bli evaluert daglig for endringer i vekt og kliniske symptomer. Sykdomsutbruddet er vanligvis forbundet med en reduksjon av vekten, som kan begynne 1-2 dager før EAE symptomer er synlige. Kliniske tegn på EAE begynner vanligvis mellom dag 9 og 14 post-immunisering. Som lesjoner er hovedsakelig lokalisert til ryggmargen i MOG-EAE i C57BL / 6 mus, de vanligvis utvikler hovedsakelig motoriske symptomer i en caudal til rostral mønster. En eksempelvis bilde av en immunisert mus med EAE symptomer (skår 6) er angitt i figur 1A. Noen atypiske EAE symptomer kan også forekomme som for eksempel å rulle i aksial-roterende måte, sammenkrøket utseende eller overfølsomhet som ikke er reflektert i den klassiske EAE scorer avbildet i tabell 1. Som motoriske symptomer er de viktigste kjennetegn på denne modellen, denne stillingen gir oss en god indikasjon på sykdommens alvorlighetsgrad. Forskjellige overvåkingssystemer (f.eks scorer 0 -5 eller 0-6) og mer komplekse sammensatte score vurdere ulike underskudd har også blitt publisert. Vær oppmerksom på at mus med alvorlige symptomer må tas ut av forsøket i henhold til de respektive institusjonelle dyr omsorg og bruk komité. Mus viser generelt delvis gjenvinning av symptomer i løpet av de neste 10-20 dagene. En representativ sykdomsforløp er vist i figur 1B. Det finnes forskjellige tidspunkt i løpet av EAE som er av interesse for å vurdere resultatparametre. Noen typiske analyser som kan ofte bli funnet er beskrevet svært kort. Ved sykdoms maksimum, kan mus bli evaluert for cytokinproduksjon eller proliferasjon etter restimulering av isolerte immunceller med MOG 35-55 peptidet in vitro (MOG recall-analyse). Immunceller kan også bli isolert fra hjernen og ryggmargen fra mus med EAE symptomer og viderebehandles, for eksempel ved strømningscytometri. Histologisk analyse av ryggmargs seksjoner kan utføres ved sykdoms maximum for lesjonmengden og demyelinisering, mens på senere tidspunkter markører for nevrodegenerasjon og nevronale celledød kan være av interesse. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" /> Figur 1. Representant EAE resultater. A. representativt bilde av en immunisert C57BL / 6 mus med EAE symptomer (EAE scorer 6). B. representant sykdomsforløp etter immunisering over 30 dager. Data er vist som gjennomsnitt og standardavvik (n = 5). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice at JoVE.com

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en etablert dyremodell av multippel sklerose. C57BL / 6 mus immunisert med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) peptid 35-55 (MOG 35-55), noe som resulterer i en stigende slapp lammelse forårsaket av autoreaktive immunceller i sentralnervesystemet. Protokoller for sykdom induksjon og overvåking vil bli diskutert.

Myelin oligodendrocyte Glycoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induced Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i C57BL / 6 Mus

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel og effektiv produksjon og rensing av Mouse Myelin oligodendrocyte glykoprotein for eksperimentell autoimmun encefalomyelitt Studier

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induksjon av legemiddelindusert, autoimmun hepatitt hos BALB/c mus for studier av dets patogene mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualisere nedsatt Endothelial og Glial barrierer av nevrovaskulære under eksperimentelle Autoimmune immunsviktvirus i Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptivimmunterapi av iNKT-celler i glucose-6-fosfat isomerase (G6PI)-induserte RA-mus

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

En rask, enkel og standardisert homogeniseringsmetode for å fremstille antigen / adjuvante emulsjoner for å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Immunogenicity Enhancement by Mycobacterium paratuberculosis in Autoimmune Encephalomyelitis

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Adjuvant Activity of Mycobacterium paratuberculosis in Enhancing the Immunogenicity of Autoantigens During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Video) | JoVE 

Adjuvant aktivitet av Mycobacterium paratuberculosis ved å øke immunogeniteten til autoantigener under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) requires immunization by a MOG peptide emulsified in ...