Name: imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy
Uploaded: 2014-05-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Grant-Nummer VIDI H64.09.016, der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) zu CPF finanziert. CPF dankt Dr. Silvina A. Fratantoni für ihre kritischen Anmerkungen und Korrekturen in der letzten Manuskripts. GMRDL / Emmm werden von der niederländischen Technologiestiftung STW (Projekt 12151 und 11350), die Teil der NWO ist, und die teilweise durch das Wirtschaftsministerium gefördert unterstützt. Wir danken der Catherine Kitts und Peter Drent von Nikon Instruments Europe BV für Hilfe und Unterstützung. HX wurde von der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (Zuschuss 11CDP10) und WT unterstützt wurde durch Erteilung der Niederländischen Organisation für Wissenschaftliche Forschung (Förder 820.02.006) unterstützt.

Alle Experimente mit Tieren wurden optimiert, um das Leiden der Tiere zu verringern und wurden von der Kommission für Tierversuche, Universität Amsterdam, DEC-Protokoll # DED204 und DED250 genehmigt. 1. Coverslip Vorbereitung <ol><li> Reduzieren Sie die Deckgläser zu einer Größe von 15 mm x 15 mm mit einem Hartmetall-oder Diamant-Schreiber, so dass sie in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte passen. </li><li> Während der Arbeit in einem Abzug beginnen Deckbeschichtung durch Untertau...

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	<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+formation+and+stabilization.">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).</li><li>Dailey, M. E., Smith, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+transgene+delivery+to+the+hippocampus+reveals+sub-field+specific+differences+in+expression.">Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression.</a> BMC Neurosci. , (2009).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. 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In diesem Artikel wird ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen aus Ratten-Hippocampus-Neuronen primäre Verwendung der SIM in vitro beschrieben. Der primäre Hippocampus Kultur-Methode ist eine Anpassung der von Kaech und Banker 18 beschrieben ursprünglichen Methode. Die Hauptunterschiede sind die Verwendung von Neurobasal/B27 Kulturmedium, das das Erfordernis der Zuführung Astroglia Kulturen eliminiert, und die Zugabe des mitotischen Inhibitor FUDR an Tag 3, der das Überleben von Neuro...

Ein dendritisches Wirbelsäule ist ein kleiner Vorsprung des Neurons Membran. Diese charakteristische Struktur ist darauf spezialisiert, in der Regel erhalten Input von einer einzigen Synapse und stellt die physikalische Kontaktfläche zwischen zwei Nervenzellen. Die meisten funktionell reifen dendritischen Dornen bestehen aus einem kugelförmigen Spitze, genannt Kopf und einem dünnen Hals, der den Kopf mit dem dendritischen Welle verbindet. Allerdings sind nicht statisch, Stacheln und aktiv zu bewegen und ändern ihre Morphologie kontinuierlich auch im erwachsenen Gehirn 2. In einem 2-wöchigen Zeitraum, Ratte primären Hippocampus-Neuronen-Kulturen vom späten embryonalen oder frühen postnatalen Zeit abgeleitet Entwicklung komplexer dendritischen Dornen mit zahlreichen Membran Vorsprünge, die von Anfang an filipodia stachelartigen Strukturen 3 entwickeln. Basierend auf diesem dynamischen Verhalten und andere Merkmale werden dendritischen Dornen haben, um einen anatomischen Substrat für Speicher und synaptische Transmission 4,5 bereitzustellen. Angesichts thE kritischen Rolle, die dendritischen Dorn Größe und Form haben in der synaptischen Funktion, ist es wichtig, ihren Abmessungen exakt zu messen. Stacheln variieren von etwa 200 bis 2000 Nanometer in der Länge und kann leicht mit Hilfe der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie identifiziert werden. Aber auch andere als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel unter Auflösung der herkömmlichen optischen Systeme &quot;, theoretisch durch Beugung um 200 Nanometer 6 befestigt. Diese Auflösungsvermögen unzureichend zur Abbildung feiner Details, wie die Breite der Wirbelsäule Hals und Kopf. Viel Arbeit wurde gewidmet, um dieses Problem zu lösen und viele relativ neue Super-Resolution-Mikroskopie-Techniken haben erhebliche Fortschritte zur Verfügung gestellt. Insbesondere ist es möglich, die Auflösung über die klassische Grenze ohne Verwerfen jede Emissionslicht durch die Verwendung seitlich Structured Illumination Microscopy (SIM) in einer Weitfeld-, nicht-konfokalen Mikroskop 7-10 zu erreichen. Unter Verwendung dieser Technik in Kombination mit nicht-linear Mikroskopie-Techniken, ist es theoretisch möglich, die laterale Auflösung des Lichtmikroskops von einer unbegrenzten Faktor 11 zu verbessern. Aber in den meisten experimentellen Bedingungen erlaubt SIM zur Auflösungsgrenze um einen Faktor von zwei 1 übertreffen. Andere höchstauflösenden optischen Mikroskopie-Techniken wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie 12 und Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) 12 haben Bildgebung von dendritischen Dornen angewendet. Localization-basierte Verfahren wie PALM erfordern sehr große Zahl von RAW-Bilder zu Super-Auflösung zu erreichen und werden daher in der Geschwindigkeit beschränkt. Andererseits kann STED hohe Abbildungsgeschwindigkeit zu erreichen, wenn auch relativ geringe Photonenzählungen und kleine Sichtfeldern, die nicht für SIM 13 sein kann. In diesem Artikel ist das Ziel, ein Arbeitsprotokoll zum Bild dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro kultiviert bieten </em&gt; die Verwendung der SIM. Das Protokoll besteht aus zwei unterscheidbaren Phasen: eine erste, bestehend aus einer Einrichtung, Entwicklung, Transfektion und Immunhistochemie von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen Kulturen und einer späten Phase gewidmet Bildgebung probieren.

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		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with illumination</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cell culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-temperature dry-oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator (5% CO2, 37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon structured illumination microscope setup consisting of:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Stage Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCL Nano-Drive piezo controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIM Microscope Enclosure temperature control</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor EM-CCD Camera iXon DU897</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with Microsoft Windows 7 Home Edition</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon&#8217;s NiS Elements 6.14 SIM software package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon type A immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy

Dendriten sind Vorsprünge, die aus der Dendriten eines Neurons und stellen die primären Ziele von exzitatorischen postsynaptischen Eingänge im Gehirn. Technologische Fortschritte haben diese Strukturen als Schlüsselelemente in Neuron-Konnektivität und synaptische Plastizität identifiziert. Die quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologie mittels Lichtmikroskopie bleibt ein wesentliches Problem aufgrund technischer Einschränkungen mit intrinsischer Brechungsgrenze Lichts verbunden. Dendritischen Dornen können leicht durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert werden. , Mess subtile Veränderungen in der Form und Größe der Stacheln ist jedoch schwierig, weil andere ist als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel kleiner als herkömmliche theoretische Auflösungsgrenze von 200 nm Lichtmikroskopie fixiert optische Auflösung. Mehrere neu entwickelten Super-Resolution-Techniken, um Bild zellulären Strukturen kleiner als die 200 nm, einschließlich dendritischen Dornen verwendet. Tiese Techniken basieren auf klassischen Fernfeld-Operationen auf der Grundlage und ermöglichen die Nutzung der vorhandenen Probenvorbereitung und Bild über die Oberfläche einer Probe. Beschrieben wird hier ein Arbeitsprotokoll zum Super Resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), um die Abbildung von dendritischen Dornen in primären hippokampalen Neuronenkulturen gelten. Mögliche Anwendungen der SIM schneiden sich mit denen der konfokalen Mikroskopie. Allerdings präsentieren sich die beiden unterschiedlichen Techniken Anwendbarkeit. SIM bietet eine höhere effektive laterale Auflösung, während der konfokalen Mikroskopie, die auf die Benutzung eines physischen Lochkamera, erreicht Verbesserung der Auflösung auf Kosten der Beseitigung der aus der Fokus Licht. In diesem Protokoll werden die primären Neuronen auf Deckgläschen mit einem Standard-Protokoll, mit DNA-Plasmiden, die fluoreszierende Proteine ​​und abgebildet mit SIM transfiziert, kultiviert. Die hierin beschriebene gesamte Protokoll dauert ca. 2 Wochen, da dendritischen Dornen abgebildet werden nach 16-17 Tagen in vitro, wenndendritischen Entwicklung optimal ist. Nach Beendigung des Protokolls kann dendritischen Dornen in 3D aus der Serie von SIM-Bildstapeln mit spezieller Software rekonstruiert werden.

Beschrieben wird hier eine standardisierte Arbeitsprotokoll zur Abbildung dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro mit SIM-Karte. Der Protokollablauf sowie die wesentlichen Schritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Insgesamt dauert das Protokoll etwa 2 Wochen nach der experimentellen Arbeit in einer ersten Phase der Probenvorbereitung, einschließlich Kultur, Entwicklung und Transfektion von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen und Immunhistochemie getrennt, un...

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Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

3D-Modellierung von Dendritischen Stacheln mit synaptischer Plastizität

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...