Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Økonomisk støtte til VECT-HORUS er anerkendt fra Fonds Unique Interministériel (FUI / MEDUL projektet), og at vect-HORUS og UMR7259 laboratorium fra Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC og PREVENTAD samarbejdsprojekter) . Den UMR7259 laboratorium anerkender også økonomisk støtte fra CNRS og fra Aix-Marseille Université.

1. Produktion af rotte Astrocyter For hvert præparat bruge 10 neonatale Wistarrotter af begge køn. <ol><li> Sacrifice rotterne ved at skære hovedet med en saks og overføre dem straks i en tør petriskål under en laminar flow hætte. Fjern hjerne fra kraniet uden cerebellum og overføre dem straks i en petriskål indeholdende koldt dissektion buffer: HBSS suppleret med 1% bovint serumalbumin (lavt niveau af endotoksin BSA), penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml. </li><li> Skær hjerner i halve, for at adskille de 2 hjernehalvdele og overføre dem til en ren petriskål med dissektion buffer på is. Skær synsnerven og fjerne meninges under et stereomikroskop. </li><li> Vask de cortikale stykker udførligt i 50 ml kold dissektion buffer. </li><li> Placer kortikale stykker fra 3 hjerner ind i et 15 ml Falcon rør og dissociere ved pipettering op og ned et kuple gange med 10 ml engangspipette udstyret med en blå spids i 6 ml trypsin 0,05% - 0,02% EDTA i 5 minutter ved 37 ° C. </li><li> Tilføj 24 ml DMEM suppleret med 10% FBS og følgende antibiotika, penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml, et medie navngivet glialcelle medier (GCM), og centrifugeres ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. FBS batches blev udvalgt og valideret til vækst og overlevelse af astrocyt cutures. </li><li> Pellet resuspenderes indeholder de dissocierede celler i 10 ml GCM og plade ind i et 75 cm 2 T-kolbe (T75). Skift medium den følgende dag for at fjerne cellerester og DNA. Udskift dyrkningsmediet to gange om ugen. </li><li> Efter 1 uges spredning, ryst forsigtigt gliaceller med en orbitalryster ved 60 rpm i løbet af 24 timer ved 37 ° C i GCM. Hvis T75 ikke kan placeres i en inkubator med 5% CO 2/95% luft ved 37 ° C befugtet atmosfære, supplere mediet med 5 mM HEPES. Vask cellerne to gange for at reFlyt de ikke-adhærente mikrogliaceller. </li><li> Tre uger efter såning, vaskes cellerne to gange med DPBS uden calcium og magnesium. Tilsæt 3 ml varmt trypsin 0,05%-EDTA 0,02%, inkuberes ved 37 ° C, og vent, indtil cellelag er spredt (normalt 5 min). Inhibere trypsin-aktivitet ved tilsætning af 10 ml GCM overføre cellesuspensionen i et 15 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 120 xg i 8 min. </li><li> Resuspender astrocyte pellet i 90% FBS - 10% DMSO, overføre dem i kryoglas (2 x 10 6 celler pr cryovial) og gemme i flydende nitrogen. </li></ol> 2.. Isolering af rottehjerne mikrokar Vores eksperimentelle procedurer er godkendt af den etiske komité i det medicinske fakultet i Marseille og i overensstemmelse med nationale og europæiske regler (EU-direktiv nr. 86/609). Blev gjort alle bestræbelser på at minimere dyrenes lidelser og mindske antallet af dyr, der anvendes. <ol><li> For hvert præparat og for en Experimenter, bruge 3 fem uger gamle Wistarrotter. </li><li> Mandag i den første uge, forberede to T75 kolber ved overtrækning med kollagen type IV og fibronektin, både på 1 ug / cm 2 i steril kultur vand (10 ml per T75). Tillad at klæbe ved 37 ° C, indtil mikrokardannelse såning. </li><li> Onsdag morgen af den første uge, aflive rotterne under en stigende flux af CO 2 for at fremkalde døsighed, tab af kropsholdning og vejrtrækning afbrydelse, derefter fulgt af en cervikal dislokation. Spray hoveder med 70% ethanol. Skær hovederne med en saks og overføre dem i en tør petriskål under en laminar flow hætte. </li><li> Fjern hjerne fra kraniet uden cerebellum og synsnerven og derefter overføre dem i en petriskål afkølet på is og fyldt med koldt dissektion buffer (HBSS suppleret med 1% BSA, penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml) . </li><li> Skær hjerner i halvdelen at adskille de 2 hjernehalvdele og separate midthjernen fra forEbrain. Overfør forebrains i en ren petriskål på is med dissektion buffer. </li><li> Tag et par halvkugler i en ny petriskål med koldt dissektion buffer til forsigtigt at fjerne meninges fra forebrains under et stereomikroskop med N ° 5 buede pincet. Derefter rense det indre af hjernen til at fjerne dynen af ​​myelin og få en skal af cortex. Disse skridt bør ikke tage mere end 2 timer for vævs bevarelse og celleoverlevelse. </li><li> Adskille cortex fra 3 hjerner i 6 ml koldt dissektion buffer i en 7 ml Dounce-homogenisator med 10 bevægelser op og ned med hver af to stempler af forskellige frirum, 71 um efterfulgt af 20 um. </li><li> Opdel suspensionen for at opnå svarende til 1 cortex i 1 ml af en 50 ml Falcon-rør og centrifugeres ved 1000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten. </li><li> Fordøje suspensionen fra 1 cortex med 1 ml af en enzymatisk opløsning, der indeholder en blanding af kollagenaser / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase I (35 ug / ml - 20 K enheder / ml) og gentamicin (50 ug / ml) i en ryster i 30 min ved 37 ° C. </li><li> Bland 1 ml fordøje 1. cortex med 10 ml 25% BSA / HBSS 1X og adskilt ved vægtfylde afhængig centrifugering ved 3.600 x g i 15 minutter ved stuetemperatur. Overføre forsigtigt den øverste skive (myelin og hjerneparenkymet) og supernatanten til et rent 50 ml Falcon rør og gentag centrifugering. Hold den resulterende pellet indeholdende hjernen mikrokar ved 4 ° C. </li><li> Kassere forsigtigt øvre skive og supernatanten. Resuspender begge resulterende pellets indeholdende hjernen mikrokar med 1 ml kold HBSS 1X og overføres til et rent 50 ml Falcon-rør. </li><li> Vask mikrokar ved tilsætning af 20 ml kold HBSS 1X og centrifugeres ved 1.000 xg i 5 min. Supernatanten. </li><li> Yderligere fordøje mikrokar fra 1 cortex med 1 ml af det samme enzymatiske opløsning som beskrevet i trin 2.9 i løbet af 1 time ved 37 ° C i en shAker. </li><li> Derefter blandes de spaltede mikrokar fra hver af de 3 cortex i et rør, og yderligere at adskille i to 50 ml Falcon-rør for at opnå mikrokar ekstraheret fra svarende til en og en halv (1,5) cortex per rør. Der tilsættes 30 ml kold dissektion buffer og centrifuger ved 1.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Resuspender mikrokar pellet i 10 ml DMEM/F12 suppleret med 20% bovint blodpladefattigt plasmaafledt serum, basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 ug / ml), gentamicin (50 ug / ml) og HEPES (2,5 mM), opkaldt endotelcelle medier (ECM) suppleret med puromycin ved 4 pg / ml. </li><li> Tag de 2 coatede T75 kolber fra inkubatoren, opsug overskud af belægning og pladen mikrokar fra hvert rør i en T75 kolbe (mikrokar udvundet fra 1,5 cortex pr T75 kolbe). </li></ol> 3.. Oprensning og spredning af RBEC Primocultures <ol><li> Oprensning: onsdag til fredag, tilføje puromycin ved 4 ug / ml til dyrkningsmediet. Skift mediet på torsdag. På fredag, vaske cellerne og tilføje puromycin ved 2 ug / ml indtil mandag. </li><li> Spredning: på mandag i den anden uge, vaske cellerne og tilføje insulin, transferrin og natriumselenit supplement til kulturen medier indtil kulturerne når 90% konfluens på onsdag i den anden uge. </li></ol> . 4. Differentiering: Opsætning af In Vitro BBB Model <ol><li> Mandag i den anden uge, forberede filtre (polyethylen, 12 brønde, porestørrelse 1,0 um) ved coating med en blanding af collagen type IV og fibronektin både 0.5μg/cm 2 i steril kultur vand (500 pi blanding i det øvre kammer og 1,5 ml sterilt kultur vand i den nederste rum). Tillad at klæbe ved 37 ° C, indtil RBEC såning. </li><li> Mandag i den anden uge, fem dage før etableringen af ​​co-kultur, tø astrocytterne fra kryoglas ved 37 ° C og overførseli et 15 ml Falcon med 10 ml GCM. Centrifugér suspensionen ved 120 x g i 8 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Resuspender astrocyt pelleten i GCM og plade ved en tæthed på 30 x 10 3 celler pr cm2 i 12-brønds plader. </li><li> Onsdag i den anden uge, lige før dissociering af RBEC med trypsin, vaskes to gange pre-coated filter med DMEM/F12-medium. Pre-fylde kamrene med ECM: 1,5 ml i nederste rum og 0,5 ml i det øvre kammer. </li><li> Onsdag i den anden uge, vaskes to gange RBEC med DPBS uden calcium og magnesium. Tilsæt 4 ml varmt trypsin 0,05% - EDTA 0,02% opløsning ved 37 ° C pr T75 kolbe i løbet af 30 sek nøjagtigt. Derefter fjernes 3,5 ml trypsin-opløsning og observere under mikroskop. Når cellen lag begynder at løsne sig fra matrixen, hjælpe dem ved forsigtigt at banke på kanten af ​​T75 kolben, indtil alle celler er flydende. </li><li> Tilføj 9 ml ECM pr T75 kolbe og overføres til en 15 ml Falcon rør. Meget forsigtigt adskille cellensuspension ved at pipettere op og ned 4 gange med en 10 ml pipette udstyret med en gul spids (undgå produktion af bobler i opløsningen). Tæl cellerne i suspension (ca. 3 x 10 6 cells/T75), og straks plade på præ-coatede og fyldte filtre ved en høj tæthed (160 x 10 3 celler / filter dermed cirka 18 filters/T75) (Figur 8 ). Den følgende dag (torsdag), ændrer det dobbelte medie af øvre rum for at fjerne cellerester. </li><li> Torsdag i den anden uge, dagen før etableringen af ​​co-kultur, udskifte astrocyte dyrkningsmedier med 1,5 ml af differentiering medier (ECM med hydrocortison ved 500 nm), som kan suppleres med 1/3 konditioneret medium fra den basale rum en tidligere co-kultur (3 dages kontakt mellem endothelceller og astrocytter). </li><li> Fredag ​​i den anden uge er defineret som dag 0 af differentiering; erstatte dyrkningsmediet fra filtrene contalingen den RBEC med differentiering medier. Overfør RBEC filtrene i brøndene indeholdende astrocytter. Under disse betingelser, har in vitro-modeller differentiere og udtrykke junction-relaterede proteiner inden for 3 dage. </li><li> Modellerne beholde deres optimale differentiering i 3 dage mere, mellem mandag og onsdag i den tredje uge. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Vi beskriver implementeringen af en ugentlig reproducerbar protokol til isolering og plettering af hjernens mikrokar, efter rensning og kultur RBEC og videre etablering af co-kulturer med primære rotte astrocytter til at generere en in vitro BBB model med karakteristiske BBB egenskaber. Succesfuld oprettelse standardiseret in vitro BBB kulturer kræver optimale betingelser i de mange sekventielle trin i processen. Modellen blev (a) optimeret til at opnå den lavest paracellulære permeabilitet, som stadig er den &quot;hellige gral&quot; af in vitro BBB-modeller, og (b), valideret for udstrømning og RMT mekanismer. Produktion, rensning og spredning af RBEC Den største udfordring ved dyrkning RBEC er at opnå reproducerbarhed mellem forskellige kulturer. Standardisering af protokollen kræver høj kvalitet værktøjer til dissektion, høj kvalitet reagenser og respekt reagenser udløbsdatoer. Forsøgslederen skal være dygtige i mikro-dissektion under stereomikroskop for hurtig fjernelse af meninges og store skibe fra cortex overflade. Når hjernen isoleres og dissocieret mekanisk, en af ​​de største udfordringer er optimal enzymatisk fordøjelse af de frisk isolerede hjerne mikrokar. Typen og kvaliteten af ​​de anvendte enzymer er kritisk. En blanding af collagenaser type I og II og dispase i høj koncentration med lav variabilitet mellem batcher blev anvendt. Også vigtigt er varigheden af ​​den enzymatiske fordøjelse og forholdet mellem enzymkoncentration / vævs vægt / volumen fordøjelse. Det bedste udbytte af hjernens mikrokar produktion blev opnået med de tilsvarende af cortex fra 1 hjernen i 1 ml collagenaser / dispase bland ved 60 ug / ml i begge fordøjelser henholdsvis 30 minutter og 1 time. Også kritisk er afskaffelsen af ​​kontaminerende celles (astrocytter og især pericytes). Disse celler formere sig ved højere hastighed end endotelceller og ikke etablere tætte forbindelser med sidstnævnte, og dermed forhindre etableringen af ​​en homogen cellemonolag med god paracellulær restrictiveness. I betragtning af, at hjernen endotelceller udtrykker meget højere niveauer af effluxpumper, navnlig P-gp, sammenlignet med de andre celletyper mikrokar de tåler bedre ellers toksiske koncentrationer af P-gp-ligand narkotika, mens ikke-endotelceller er elimineret. Puromycin behandling på 4 ug / ml for de første to dage blev efterfulgt af yderligere to dage ved 2 ug / ml for at opnå god endotelcelle renhed. Dette valg kan også favorisere kapillærendotelceller versus dem fra venules, præ-kapillære arterioler eller større mikrokar, og føre til strammere monolag. Desuden er en nødvendighed for at opnå rene kulturer af endotelceller 47,48 brugen af dårlig plasmaafledt bovint serum. Plasma-derived serum mangler blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF), som er mitogent for fibroblaster til glatte muskelceller og derfor pericytter. Vi observerede, at behandling af plast og filtre med en blanding af collagen type IV fra mus og human fibronectin giver en betydelig fordel med en 2-fold forøgelse af proliferation udbytte i sammenligning med traditionelt anbefalede collagen type I fra rotte hale. Vigtige signaler for celleproliferation leveres af den ekstracellulære matrix, såsom integrin og vækstfaktor (bFGF) aktivering 49. Koncentration og pH af kulturen medier buffer er blevet beskrevet til at have en positiv indflydelse på paracellulær tæthed 50 og vi observerede en bedre reproducerbarhed mellem kulturer med tilføjelse af HEPES buffer på 5 mm. Differentiering af RBEC: Co-kultur Etablering på Indsæt Filtre Når hjernen endotelceller have b.een renset og har spredt sig i 6 dage, kan de blive belagt på filtre. Celleudpladning ved høj tæthed er afgørende for at opnå en perfekt monolag. En podningstæthed på 160x10 3 celler pr 12 brønde pladefiltre var nødvendigt og tilstrækkeligt for at opnå et sammenflydende monolag 24 timer efter såning. Men isolering af primære hjerne-endotelceller fra deres miljø er et paradoks i opbygningen af en BBB in vitro-model, da det er kendt, at primære celler, og især hjerne kapillærendotelceller, er stærkt reguleret af deres miljø og induktive faktorer produceret af de forskellige omgivende celletyper. Brain kapillærendotelceller dyrket alene hurtigt de-differentiere og løse nogle specifikke hjerne endotel markører. Således bør anvendes primære endotelceller ved lav passage (P1), og tilsluttes igen, i det mindste delvist, med deres omgivelser ved co-kultur med astrocytter eller medium konditioneret med astrocytter 47,51. Dette gældersandt for astrocyt differentiering som hjerne endotelceller og astrocytter er involveret i to-vejs-induktion. Dyrkning RBEC med astrocytter førte til stærk induktion af interendothelial TJ 52,23. De molekylære mekanismer i re-induktion fortsat er stort set ukendte, og forskning er i gang i flere laboratorier at identificere specifikke modulerende faktorer, der udskilles af astrocytter, som kan fremme en optimal endothelcelle differentiering 53,54. Faktorer, der udskilles af hjernens endotelceller inklusive leukæmi-inhibitorisk faktor (LIF) er blevet vist at inducere astrocytisk differentiering 55,56. Før co-kultur etablering blev astrocytter udsat for differentiering medium indeholdende glucocorticoidreceptoren agonist hydrocortison, og co-kultur medium. Hydrocortison er kendt for at forbedre tætheden af hjernens endotelceller og anvendes i BBB modeller især fra rotte 57 og mus 58,59 endotelceller. Den konditionerede medium er indsamlet fra det nedre kammer af endotelcelle / astrocyt co-kultur-systemet efter 3 dage og frosset til senere brug. Brugen af ​​co-kultur medium reduceret den tid af endothelcelle differentiering til 3 dage med optimal paracellulær permeabilitet for 2 dage mere og også forbedret reproducerbarhed mellem kulturer. Samlet set protokol beskriver vi giver en reproducerbar TEER over 300 ohm · cm2 og en gennemsnitlig paracellulær permeabilitetskoefficient Pe (LY) på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, svarende til de bedste primære cellebaserede BBB modellerne 22, 12.. Protokollen beskriver vi i den foreliggende manuskript med den foreslåede graduering af mikrokardannelse enzymatisk fordøjelse kan udvides til endotelceller fra rat rygmarven 60 og fra mus hjerne. Molekylær og funktionel karakterisering Desudentil TJ induktion, astrocytter bidrager også til udtryk effluxtransportører såsom P-gp i hjerne endotelceller 61. Vi viser faktisk ekspression af efflux-transporteren P-gp i BBB model og vi påvise polariteten af ​​P-gp udstrømningspumpe lokalisering ved hjælp af biokemiske metoder og P-gp-aktivitet under anvendelse af et funktionelt assay. GLT-1-ekspression blev detekteret i basalmembranen fraktion af mikrokar, men blev ikke påvist i dyrkede RBEC. Vi hypotesen, at GLT-1 ned var reguleret i vores RBEC kultur i sammenligning med in vivo betingelser og derfor ikke kan påvises ved western blot analyse. Overskydende glutamat er neurotoksisk og in vivo, GLT-1 er ansvarlig for glutamat udstrømning fra det basale kammer (parenkym) til det apikale kammer (blodcirkulationen). I astrocyt kulturer GLT-1-ekspression er fortsat meget lav og fremkaldes ved tilsætning af glutamat på mellemlang 62,63. Vi har også confIRM udtryk for tilstrømningen transportører på den apikale membran, såsom LRP1, LDLR og TFR. Funktionalitet TFR og LDLR blev demonstreret med binding og transport eksperimenter af Tf-Cy3 og DiLDL fra den luminale til den abluminale side af monolag som tidligere vist med en kvæg in vitro BBB model 64.. Interessant nok har det vist sig, at lipid krav fra astrocytter øger ekspressionen af LDLR på hjernens endotelceller 65,66 hvilket yderligere bekræfter den fysiologiske krydstale mellem astrocytter og hjerne endotelceller, herunder in vitro. Vi har valgt at eksemplificere transport med fluorescerende farvestoffer, såsom som Cy3 og Dil overvejer at spektrofluorimetrisk analyse er tilgængelig i de fleste laboratorier, og kan vise sig nyttigt at validere in vitro BBB-modeller. Men kvantificering af fluorescens er langt mindre følsomme end radioaktivitet og kræver en forøgelse i antallet af forsøg til opnåelse af signifikante data.Ideelt, Tf og LDL er normalt radioaktivt mærket (Jod 125) for sådanne binding / optagelse og transport eksperimenter. Vi viser også, at den differentierede endothelcelle monolag opnået med den foreslåede protokol reagerer på inflammation induceret af TNF-α, som afsløret ved CCL2 frigivelse og BBB åbning. CCL2 (MCP-1) og dets receptor CCR2 er involveret i CNS-sygdomme såsom multipel sclerose, eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) 67, CNS-trauma 68 og er kendt som mediatorer af leukocytmigration i CNS under neuroinflammatoriske betingelser 69,70. Med den testede protokol, kan vi ikke konkludere på et polariseret sekretion af CCL2 fordi BBB åbning tillader CCL2 koncentration i ligevægt mellem begge øverste (apikale) og nedre (basal) rum. Derfor er vi helt klart undervurderer mængden af CCL2 produceret af RBEC i den apikale rum ved 24 timer (figur 5A). Generelt Oversigt og begrænsninger BBB vitro-modeller: I n Vivo versus In vitro og gnaver versus Menneskelige Sammenligninger Mange lovende CNS-lægemidler, der viste sig effektiv i BBB passage in vitro mislykkedes i kliniske forsøg på grund af manglende forudsigelighed fra in vitro BBB-modeller ofte er baseret på celler isoleret fra andre arter end mennesker. Til vor bedste viden, in vitro BBB modeller er sandsynligvis mere intelligent, når det kommer til at studere mekanistiske aspekter af protein netværk, signaltransduktion, transportører og receptorer. Hver mekanisme, gangsti eller mål, der skal undersøges in vitro skal karakteriseres for sin regulering af supplerende miljømæssige signaler (andre celletyper, kemikalier, proteiner) og kombineres til in situ undersøgelser med samme dyreart, Og når det er muligt, med mikrokar og endotelceller er isoleret fra mennesker, med de begrænsninger og forsigtighed evoked nedenfor. In vitro BBB-modeller skal ses som selvstændige systemer, isoleret fra kroppen regulering, men stadig udstyret med store in vivo egenskaber og et potentiale for regulering af miljømæssige signaler. Nr. &quot;ideelle&quot; in vitro BBB model er blevet foreslået endnu 71,72,73 fordi endotelceller cellemonolag mangler en række vigtige bestanddele af neuro-glia vaskulær enhed (NGVU) og er isoleret fra blod og krop regulering. Manglen på pericytter 74,16 eller neuroner 17,18 eller de forskellige bestanddele af den ekstracellulære matrix, der anvendes til plastbelægning eller dyrkningsmediet og serum anvendes til cellevækst i de mest almindelige og &quot;nemmeste fremstillet&quot; in vitro BBB modeller baseret på endotel celler differentierede med astrocytter kan modulere protein udtryk in sammenligning med in vivo-situationen 75. Disse modeller kan udtrykke mange transportører, der vises in vivo, men ikke alle. I nogle tilfælde blev transport parametre først verificeret i isolerede mikrokar (tættest på in vivo-situationen), og derefter studerede i cellekultursystemer 76,61. Molekylærbiologisk forskning har gjort det muligt karakterisering af genet og protein udtryk i isolerede mikrokar og lave passage endotel cellekulturer fra samme art og mellem forskellige arter, oftest fra små dyr såsom gnavere (mus og rotter) eller fra ko og gris i forhold til mennesker 77,78,75,15. Transkriptomisk sammenligning mellem in vivo og in vitro hjerne mikrovaskulære endotelceller viste talrige gentranskripter, som blev differentielt udtrykte og oftest betydeligt nedreguleret in vitro. Udskrifter, der koder tilstrømning transportører såsom TFR og PRoteins impliceret i vesikeludveksling hovedsageligt nedreguleret i dyrkede hjerne endotelceller, hvilket tyder på en generel nedgang i endocytose og vesikulær transport i sådanne celler. Kultur manipulation i form af renhed (puromycin behandling) og behandling med hydrocortison kan bidrage til at genoprette en mere &quot;in vivo-lignende&quot; genekspression profil 77. Transkriptom undersøgelser afslørede også betydelige forskelle mellem arter, der yderligere komplicerer forudsigelser om lægemiddeloptagelse hos mennesker baseret på gnaver in vitro BBB-modeller 75. In vitro BBB-modeller, der involverer co-kultur af humane endotelceller og astrocytter er blevet beskrevet 15. Selvom det er relevant, er vanskeligere at gennemføre disse modeller på en regelmæssig basis, da de kræver reguleret adgang til post mortem menneskeligt væv, og der er heterogenitet i de kvalitetskrav / egenskaber af den menneskelige hjerne endotelceller afhængigt af alder, sygdom, og eventuelt medicinsk behandlit af donorer. Indsatsen skal gøres for at udvikle nye in vitro-modeller, der bedre gengiver fysiologiske, anatomiske og funktionelle egenskaber in vivo BBB. Co-kulturer, der involverer tre celletyper er meget restriktive og synes vanskeligt at gennemføre rutinemæssigt. Til dato den mest komplekse in vitro BBB-modeller er de dynamiske in vitro modeller (DIV-BBB), som omfatter fartøj-lignende organisation med astrocytter og inkluderer en strøm af medium, der efterligner blodgennemstrømningen 75,79,80,81,82, 83,84,85. Når cerebrale endotelceller eksponeres for et flow, den genererede forskydningsspænding aktiverer mechanotransducers på celleoverfladen, som modulerer ekspressionen af forskellige gener involveret i endotelcelle fysiologi, såsom celledeling, differentiering, migration og apoptose 80. In vivo forskydningsspænding genereret af blodgennemstrømningen er ansvarlig for mitotisk anholdelse på den celle kontakt, der tillader oprettelsen af ​​enendotelcelle monolag i blodkar 80. Genomisk og proteom analyse af normale menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller viste virkningen af forskydningsspænding i BBB endotel fysiologi 84. Shear stress er ansvarlig for celle overlevelse, en højere grad af endotelcelleadhæsion, udstrømningspumpe induktion og bedre polarisering af transportører 75, regulering af glukosemetabolismen 75,86, oxidation via CYP450 enzymer 75 og reguleringen af paracellulær permeabilitet ved at øge udtrykket af gener, der koder for intercellulære Junctional elementer som occludin og ZO-1 87,75,80 og dermed høj TEER omkring 1.500 - 2.000 ohm · cm2, tættest på kendte in vivo parametre 79,80 I den bioteknologiske og farmaceutiske industri, rutinemæssig screening af lægemidler eller endda high throughput screening (HTS) og indsatsen for at reducere dyreforsøg, ledettil udvikling af forskellige cellelinier, der skal anvendes i stedet for den primære kultur af cerebrale endotelceller som forbliver sværere at sætte op rutinemæssigt. I de fleste tilfælde blev primære kulturer af cerebrale endotelceller transduceret med en udødeliggørende gen (SV40 eller polyomavirus stort T-antigen-eller adenovirus E1A), enten ved transfektion af plasmid-DNA eller ved infektion ved hjælp af retrovirale vektorer 88,89,75. Adskillige endotel cellelinier af cerebral oprindelse er blevet udviklet som RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS eller rBCEC4 rotte cellelinjer 88,75, den b.End3 musecellelinie 90,75, den PBMEC/C1 - 2 porcin cellelinje 87,75 og hCMEC/D3 humane cellelinie 89,75. Andre modeller er baseret på celler af ikke-cerebral oprindelse såsom Madin-Darby hunde nyre (MDCK) eller Caco2 cellelinier 12,75. Blandt de forskellige humane cerebrale endotelceller cellelinier har hCMEC/D3 blevet bredt cited og forbedret som en model af BBB siden sin oprettelse i 2005 91,92. Ligesom primære kulturer, cellelinjer nuværende fordele og begrænsninger. De er lettere at håndtere end primære kulturer, har en længere levetid, er velkarakteriserede og tillade reproducerbarhed mellem store eksperimenter. Dog kan cellelinjer miste vævsspecifikke funktioner, mister miljøregulering og erhverve en molekylær fænotype helt forskellig fra celler in vivo 75 89. Især monolag genereret fra cellelinier nuværende reducerede tæthed, lav TEER og show transportør profil variation 75,89. Således dyreforsøg eller studier i primære celler foretrækkes ofte på trods af deres ekstra kompleksitet.

Mange lægemidler, der er udviklet til behandling af centralnervesystemet (CNS) lidelser er ude af stand til at nå hjernen parenkym i terapeutisk relevante koncentrationer. BBB beskytter hjernen nervevæv fra udsving i plasma sammensætning, patogene midler og fastholder homeostase hjerneparenkymet ved at begrænse ikke-specifik flux af ioner, peptider, proteiner og endda celler ind og ud af hjernen 1. BBB egenskaber induceres og vedligeholdes af intim nærhed og cross-talk mellem de specialiserede klasse hjerne mikrokardannelse endotelceller og tilstødende elementer i neuro-glia-kar-enhed (NGVU) såsom neuroner, gliaceller (mere præcist astrocyte ende-fod), og pericytes ensheathed i basalmembranen, der hovedsagelig består af collagen type IV, fibronektin, laminin og proteoglycaner 2,3. Pericytes dækker cirka 22-32% af endotel på kapillær niveau og spiller en vigtigrolle i reguleringen af ​​endotel proliferation, angiogenese og inflammatoriske processer. Endotelceller udgør et kontinuerligt ark, der dækker den indvendige overflade af kapillærerne. De er indbyrdes forbundet ved TJs, der danner et bælte-lignende struktur på den apikale region, og som bidrager til celle polarisering. Astrocytter regulere BBB egenskaber og er kilder af vigtige regulatoriske faktorer, såsom TGF-β, GDNF, bFGF og IL-6. Astrocytter med mangelfuld GFAP ufuldstændig funktionalitet er ikke i stand til at regulere BBB egenskaber 4. Neuroner er ikke direkte involveret strukturelt i dannelsen af BBB, men også regulere vigtige aspekter af protein-ekspression og BBB-funktioner 5. For yderligere at studere strukturen, fysiologi og patologi BBB blev in vitro modeller af BBB udviklet som forskning værktøjer. Brain endotelceller er blevet udvundet fra forskellige arter for at gennemføre in vitro BBB-modeller baseretpå lavpassage primære kulturer fra kvæg 6,7, svin 8,9, rotte 10,11,12, mus 13 og også menneskelig 14,15. Disse modeller er kendt for at efterligne in vivo BBB, især når co-dyrket med gliaceller fra rotte eller murine og / eller pericytter 16,12 og / eller neurale progenitor celleafledte astrocytter 17 og / eller neuroner 18. De &quot;i lab&quot; modeller er ofte fremstillet af gnavere, fordi de tillader in vitro / in vivo-forsøg og sammenligninger og / eller undersøgelse af hjernens endotelceller fremstillet af transgene modeller 19. Nyudviklet in vitro BBB-modeller er også blevet designet til at hjælpe med at forudsige hjerneoptagelse af potentielle CNS lægemiddelkandidater inden in vivo-test 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB modeller er normalt bruges til at sammenligne transport af stoffer med: i) kendte indtrængen i CNS eller med low gennemtrængelighed over BBB, og ingen centrale virkninger, og ii) den tilsyneladende Pe af de samme stoffer målt i dyremodeller af samme art. De lægemidler, der let passerer BBB er for det meste lipofile og krydse hjernens endotel cellemembraner ved lipidmedieret fri diffusion (koffein, carbamazepin, osv.). De negativt transporterede stoffer som digoxin, verapamil eller cyclosporin A er aktivt ekstruderet af hjernen endotel effluxtransportører såsom P-gp. Men mange af de nyudviklede terapeutiske molekyler er biopharmaceuticals, såsom rekombinante proteiner, siRNAs eller monoklonale antistoffer. De fleste af dem ikke krydse BBB skyldes: i) der ikke findes specifikke transportører, og ii) det tætpakkede lag af endothelceller, som forhindrer højmolekylære molekyler fra undergår paracellulær passage. Med disse grænser, &quot;trojanske hest&quot; strategier er blevet gennemført ved hjælp af vektorer (antistoffer, peptider) mod kendte receptorer på BBB, der er involveret in receptormedieret transport eller transcytose (RMT), såsom transferrin (Tf)-receptor (TFR), insulinreceptoren (IR) eller medlemmer af LDL-receptoren (LDLR)-relateret receptor familien (LDLR, LRP1). Sådanne receptorer er blevet fundet på isolerede hjerne kapillærer og BBB in vivo 24,25. Transkriptionelle profiler til disse receptorer, især dem på LDLR familien, blev analyseret og sammenlignet mellem hjernens endotelceller og hjerne endotelceller co-dyrket med astrocytter eller i hjernens kapillærer direkte efter deres udvinding fra hjerne 26. Pardridge 24 åbnede felt med OX-26-antistof mod transferrin-receptor (TFR), efterfulgt af antistoffer mod insulin-receptoren og insulin-vækstfaktor receptor 27,28. Med disse antistofbaserede vektorer har ArmaGen Technologies udviklet en BBB molekylær trojansk hest platform teknologi til at levere lægemidler, herunder proteiner, over BBB 29. Denlitteratur er rig på data, der viser LRP1 udtryk i hjernens endotelceller og dens rolle som en stærk endocytic / scavenger receptoren. Western blot-analyse antydede, at LRP1 udtrykkes i fraktioner beriget med hjerne kapillærer og rottehjerne endotelceller 30. Firmaer som Angiochem target LRP1 med peptid vektorer afledt fra aprotinin, der fremmer en effektiv medicin tilstrømning over BBB 31. Dog er LRP1 også involveret i aktiv transport af Ap og dets udstrømning / clearance fra hjerneparenkymet til blod 32. Sådanne data indebærer LRP1 i et tovejs transport over BBB, afhængigt af dets ligander. biOasis udvikler Transcend teknologi ved hjælp af et protein melanotransferrin til transport af biologiske lægemidler, såsom lysosomale enzymer og antistoffer over BBB 33 mens VECT-HORUS udvikler peptid vektorer, der er målrettet LDLR 34. Der er data tyder på, at LRP og LDLR kan anvendes til at transportere different molekyler, såsom lysosomale enzymer 35,36 eller nanopartikel komplekser over BBB 37. Vores område af interesse er drug delivery til CNS hjælp vektormolekyler og vektoriseret lægemiddelkandidater-kandidater til behandling af CNS-sygdomme. Især drug delivery over BBB skal betragtes inden for rammerne af neuroinflammation, en proces, der kan variere i sin udstrækning, men det er nok fælles for alle CNS-læsioner og sygdomme, herunder encephalitis, dissemineret sklerose, Alzheimers sygdom osv. Neuroinflammation er forbundet med BBB betændelse og potentielt med ændringer i BBB fysiologi og permeabilitet overvejer at paracellulære og transcellulær transport kan forstærkes i patologiske tilstande 38,39,40,41,42,43. For eksempel, TNF-α, nappe og andre cytokiner modulerer inflammation og forsøg med in vitro BBB modeller har vist, at de kan ændre den paracellulære egenskaber the endotelcelle monolag 38,39,40 og TNF-α fører også til en stigning i transcellulær transport af LDL 41 holotransferrin 42 og lactoferrin 43. Vores mål var at udvikle og karakterisere en optimeret og meget reproducerbar rotte syngen BBB model ved hjælp af co-kulturer af primære hjerne endotelceller og astrocytter. Vi brugte 5 uger gamle og neonatale Wistar-rotter for hjernens endotelceller produktion og astrocyt produktion hhv. En udfordring var at etablere en protokol mulighed for produktion af &quot;ugentlig reproducerbare&quot; BBB-modeller. For at nå dette mål blev alle trin i produktionen protokol udføres på faste dage i ugen, startende fra hjerne mikrokardannelse produktion på onsdag i den første uge. Dissektioner blev udført næsten hver uge i løbet af de sidste 3 år. For yderligere at forbedre reproducerbarheden af ​​kulturerne blev et kvalitetssikringssystem etableret. Alle reagents og kemikalier blev refereret i en database (dato for indrejse, bestand, udløb sigt osv.). Modellen var præget efter en række kriterier, såsom endothelcelle organisation og renhed, TEER, LY permeabilitet, reaktion på pro-inflammatoriske midler, kvalitative og kvantitative udtryk for TJ proteiner, funktionalitet effluxtransportører såsom P-gp, og receptorer involveret i transcytose over endotel cellemonolaget såsom TFR eller LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

Blod-hjerne barrieren (BBB) ​​regulerer specifikt molekylære og cellulære flux mellem blodet og nervevævet. Vores mål var at udvikle og karakterisere en meget reproducerbar rotte syngen in vitro model for BBB hjælp co-kulturer af primære rotte hjerne endotelceller (RBEC) og astrocytter til at undersøge receptorer involveret i transcytose over endotel cellemonolaget. Astrocytter blev isoleret ved mekanisk dissektion efter trypsinfordøjelse og blev frosset til senere co-kultur. RBEC blev isoleret fra 5 uger gamle rotte cortex. Hjernerne blev renset af meninges og hvid substans, og mekanisk dissocieret efter enzymatisk nedbrydning. Derefter blev vævet homogenatet centrifugeret i okseserumalbumin at adskille fartøjets fragmenter fra nervevæv. Fragmenterne fartøjets undergik en anden enzymatisk fordøjelse til frie endotelceller fra deres ekstracellulære matrix. De resterende kontaminerende celler, såsom pericytter blev further elimineres ved udpladning af mikrokar fragmenter puromycin-holdige medium. De blev derefter passeret på filtre til co-kultur med astrocytter dyrket på bunden af ​​brøndene. RBEC udtrykte høje niveauer af tight junction (TJ) proteiner såsom occludin, claudin-5 og ZO-1 med en typisk lokalisering ved cellekanterne. Den transendothelial elektriske modstand (TEER) af hjernens endotel monolag, der angiver tæthed TJs nåede 300 ohm · cm2 i gennemsnit. De endotelpermeabilitet koefficienter (PE) for lucifer gul (LY) var meget reproducerbar med et gennemsnit på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotelceller organiseret i monolag udtrykte efflux-transporteren P-glycoprotein (P-gp), viste en polariseret transport af rhodamin 123, en ligand for P-gp, og viste specifik transport af transferrin-Cy3 og DiILDL tværs af endothelcelle monolag. Afslutningsvis giver vi en protokol til opsætning af en in vitroBBB model, der er meget reproducerbar på grund af kvalitetssikring metoder, og det er velegnet til forskning på BBB transportører og receptorer.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Etablering af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Model of Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Fokus på BBB Uigennemtrængelighed og receptor-medieret transport

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at validere reproducerbarheden af en in vitro BBB model involverer en rotte syngen co-kultur af endothelceller og astrocytter. Endotelcellen monolag præsenteret høj TEER og lav LY permeabilitet. Ekspression af specifikke TJ proteiner blev funktionelle reaktioner på betændelse og funktionalitet af transportører og receptorer vurderes.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-guided Forstyrrelse af blod-hjerne barrieren ved hjælp af Transcranial fokuseret ultralyd i en rottemodel

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Rottemodel af blod-hjerne barrieren Disruption at muliggøre målrettede neurovaskulær Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stræk i Brain mikrovaskulære endotelceller (cEND) som et<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk Hjerneskade Model af blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoksiske Stimulering af Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ilt-Glucose afsavn og reoxygenering som en<em&gt; In vitro</em&gt; Iskæmireperfusion Skade Model for studere blod-hjerne barrieren dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

En Rat carotis ballon Skade Model til Test Anti-vaskulære Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-inducerende Procedure i en<em&gt; In vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro Assays at vurdere blod-hjerne barriere mesh-lignende fartøj dannelse og afbrydelse

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metode til etablering af et In Vitro blod - hjerne barrieren Model baseret på svin hjernen Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...