Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Financiële steun aan VECT-HORUS wordt erkend van het Fonds Unique Interministeriel (FUI / MEDUL project) en vect-Horus en de UMR7259 laboratorium van het Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC en PREVENTAD samenwerkingsprojecten) . De UMR7259 laboratorium erkent ook financiële steun van het CNRS en van Aix-Marseille Universite.

1. Productie van Rat Astrocytes Voor elk preparaat gebruiken 10 neonatale Wistarratten van beide geslachten. <ol><li> Offer de ratten door snijkoppen met een schaar en zet ze onmiddellijk in een droge petrischaal onder een laminaire stroming kap. Verwijder de hersenen uit de schedel zonder cerebellum en overbrengen onmiddellijk in een petrischaal met koude dissectie buffer: HBSS aangevuld met 1% runderserumalbumine (lage endotoxine BSA), 100 eenheden penicilline / ml en streptomycine 100 ug / ml. </li><li> Snijd de hersenen in de helft, om de 2 hersenhelften gescheiden en breng ze in een schone petrischaal met dissectie buffer op ijs. Snijd de oogzenuw en verwijder de hersenvliezen onder een stereomicroscoop. </li><li> Was de corticale stukken uitgebreid in 50 ml koud dissectie buffer. </li><li> Plaats de corticale stukken van 3 hersenen in een 15 ml Falcon buis en distantiëren door en neer te pipetteren een staatsgreeple malen met 10 ml wegwerp pipet met een blauwe tip in 6 ml 0,05% trypsine - EDTA 0,02% gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 24 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en de volgende antibiotica, penicilline 100 eenheden / ml streptomycine en 100 ug / ml, media genaamd glia celmedium (GCM) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. FBS batches werden geselecteerd en gevalideerd voor de groei en overleving van astrocyten cutures. </li><li> Resuspendeer de pellet met de gedissocieerde cellen in 10 ml GCM en plaat in een 75 cm 2 T-kolf (T75). Verander het medium de volgende dag om de celresten te verwijderen en DNA. Vervang het kweekmedium tweemaal per week. </li><li> Na 1 week van proliferatie, schud de gliacellen met een orbitale schudder bij 60 rpm gedurende 24 uur bij 37 ° C in GCM. Als de T75 niet in een incubator worden gebracht met 5% CO 2/95% lucht bij 37 ° C bevochtigde atmosfeer, vullen de media 5 mM HEPES. Was de cellen tweemaal aan rchrap de niet-hechtende microgliale cellen. </li><li> Drie weken na het zaaien, was de cellen tweemaal met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg 3 ml warm trypsine-EDTA 0,05% 0,02%, incubeer bij 37 ° C en wacht tot de cellaag wordt verspreid (meestal 5 min). Remmen trypsine activiteit door toevoeging van 10 ml GCM, breng de celsuspensie in een 15 ml Falcon buis en centrifugeer bij 120 xg gedurende 8 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in astrocyte 90% FBS - 10% DMSO, overbrengen naar cryovials (2 x 10 6 cellen per cryoflesje) en bewaar in vloeibare stikstof. </li></ol> 2. Isolatie van Rat Brain microvessels Onze experimentele procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Faculteit van Marseille en voldoen aan de nationale en Europese regelgeving (EU-richtlijn nr. 86/609). Alle inspanningen werden geleverd om dierenleed te minimaliseren en vermindering van het aantal gebruikte dieren. <ol><li> Voor elk preparaat en voor een experimenter, gebruiken 3 vijf weken oude Wistarratten. </li><li> Maandag van de eerste week, 2 T75 kolven bereid door het coaten met type IV collageen en fibronectine, zowel 1 ug / cm 2 in steriele kweek water (10 ml per T75). Laat hechten bij 37 ° C tot microvaatje zaaien. </li><li> Woensdag ochtend van de eerste week, euthanaseren de ratten onder een toenemende flux CO 2 slaperigheid induceren, verlies van houding en ademhaling onderbreking, gevolgd door cervicale dislocatie. Spuit de koppen met 70% ethanol. Snijd de koppen met een schaar en overbrengen onder een laminaire stroming kap in een droge petrischaal. </li><li> Verwijder de hersenen uit de schedel zonder cerebellum en de optische zenuwen, dan overbrengen naar een petrischaal gekoeld op ijs en gevuld met koud dissectie buffer (HBSS aangevuld met 1% BSA, 100 eenheden penicilline / ml en streptomycine 100 ug / ml) . </li><li> Snijd de hersenen in de helft van de 2 hersenhelften en aparte middenhersenen scheiden van voorebrain. Breng de voorhersenen in een schone petrischaal op ijs met dissectie buffer. </li><li> Neem een ​​paar halve bollen in een nieuwe petrischaal met koud dissectie buffer om de hersenvliezen verwijder voorzichtig uit de voorhersenen onder een stereomicroscoop met N ° 5 gebogen pincet. Dan, het reinigen van de binnenkant van de hersenen om het dekbed van myeline verwijderen en het verkrijgen van een schil van cortex. Deze stappen moeten meer dan 2 uur voor weefsel behoud en overleving van de cel niet nemen. </li><li> Distantiëren de cortex van 3 hersenen in 6 ml koud dissectie buffer in dounce homogeniseerapparaat een 7 ml met 10 opwaartse als neerwaartse slag met elk van 2 stampers van verschillende afstanden, 71 um gevolgd door 20 micrometer. </li><li> Verdeel de suspensie tot het equivalent van 1 cortex in 1 ml van een 50 ml Falcon buis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen. Verwijder het supernatant. </li><li> Digest de suspensie van 1 cortex met 1 ml van een enzymatische oplossing die een mengsel van collagenase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase type I (35 ug / ml - 20 K eenheden / ml) en gentamicine (50 ug / ml) in een schudder gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Meng 1 ml verteren van 1 cortex met 10 ml 25% BSA / 1X HBSS en gescheiden door densiteitafhankelijke centrifugeren bij 3600 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng zorgvuldig de bovenste schijf (myeline en de hersenen parenchym) en de bovenstaande vloeistof in een schone 50 ml Falcon buis en herhaal het centrifugeren. Houd de resulterende pellet die de hersenen microvaatjes bij 4 ° C. </li><li> Gooi de bovenste schijf en het supernatant voorzichtig. Resuspendeer beide resulterende pellets die de hersenen microvaatjes met 1 ml koude HBSS 1X en over in een schone 50 ml Falcon buis. </li><li> Was de microvaatjes door toevoeging van 20 ml koude HBSS 1X en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Verder verteren de microvaatjes van 1 cortex met 1 ml van dezelfde enzymatische oplossing zoals beschreven in stap 2.9 gedurende 1 uur bij 37 ° C in een shAker. </li><li> Vervolgens meng de gedigereerde microvaatjes uit elk van de 3 cortex in een buis en verder gescheiden in twee 50 ml Falcon buizen bloedvaten uit het equivalent van anderhalf (1,5) cortex per slangetje. Voeg 30 ml koud dissectie buffer en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 microvaatje ml DMEM/F12 aangevuld met 20% bovien bloedplaatjes arm plasma afgeleid serum, basische fibroblastgroeifactor (bFGF, 2 ng / ml) heparine (100 ug / ml), gentamicine (50 ug / ml) en HEPES (2.5 mM), genaamd endotheelcellen media (ECM) aangevuld met puromycine bij 4 ug / ml. </li><li> Neem de 2 gecoate T75 kolven uit de incubator, zuig het overtollige van de coating en de plaat de haarvaten van elke buis in een T75 fles (microvessels onttrokken 1.5 cortex per T75 fles). </li></ol> 3. Zuivering en verspreiding van RBEC Primocultures <ol><li> Zuivering: woensdag tot en met vrijdag, voeg puromycin bij 4 ug / ml aan het kweekmedium. Verander het medium op donderdag. Op vrijdag was de cellen en voeg puromycine op 2 ug / ml tot en met maandag. </li><li> Proliferatie: op maandag van de tweede week, was de cellen en voeg insuline, transferrine en natriumseleniet supplement aan het kweekmedium tot de culturen oplopen tot 90% samenvloeiing op woensdag van de tweede week. </li></ol> . 4 Differentiatie: Het opzetten van de In Vitro BBB Model <ol><li> Maandag van de tweede week, filters (polyethyleen, 12 wells, poriegrootte 1,0 um) bereid door bekleding met een combinatie van collageen type IV, fibronectine en zowel 0.5μg/cm 2 kweek in steriel water (500 ui mengsel in het bovenste compartiment en 1,5 ml steriel cultuur water in het onderste compartiment). Laat hechten bij 37 ° C tot RBEC zaaien. </li><li> Maandag van de tweede week, vijf dagen vóór de oprichting van de co-cultuur, ontdooien de astrocyten uit cryovials bij 37 ° C en de overdrachtin een 15 ml Falcon met 10 ml GCM. Centrifugeer de suspensie bij 120 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet in astrocyten GCM en plaat bij een dichtheid van 30 x 10 3 cellen per cm2 in 12-well platen. </li><li> Woensdag van de tweede week, net voor dissociatie van RBEC met trypsine, was tweemaal de pre-coated filter met DMEM/F12-medium. Pre-vul de kamers met ECM: 1,5 ml in het onderste compartiment en 0,5 ml in het bovenste compartiment. </li><li> Woensdag van de tweede week, was tweemaal de RBEC met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg 4 ml warm trypsine 0,05% - 0,02% EDTA-oplossing bij 37 ° C per T75 fles gedurende 30 seconden precies. Verwijder vervolgens 3,5 ml trypsine oplossing en nemen onder de microscoop. Wanneer de cellaag begint los te maken van de matrix, te helpen bij de rand van de T75 kolf te tikken totdat alle cellen zweven. </li><li> Voeg 9 ml van ECM per T75 fles en over in een 15 ml Falcon buis. Heel voorzichtig distantiëren de celschorsing door en neer te pipetteren 4 keer met een pipet 10 ml voorzien van een gele tip (vermijd de productie van bellen in de oplossing). Tel de cellen in de suspensie (ca. 3 x 10 6 cells/T75) en direct plaat van vooraf gecoat en voorgevulde filters met hoge dichtheid (160 x 10 3 cellen / filter dus ongeveer 18 filters/T75) (Figuur 8 ). De volgende dag (donderdag), veranderen twee keer het medium van het bovenste compartiment naar cel vuil te verwijderen. </li><li> Donderdag van de tweede week, de dag vóór de oprichting van de co-cultuur, vervang de astrocyten cultuur media met 1,5 ml van differentiatie media (ECM met hydrocortison bij 500 nM) die kan worden aangevuld met 1/3 geconditioneerde medium van de basale compartiment van een eerdere co-cultuur (3 dagen van contact tussen endotheelcellen en astrocyten). </li><li> Vrijdag van de tweede week wordt gedefinieerd als dag 0 van differentiatie; Vervang het kweekmedium van de filters containing de RBEC met differentiatie media. Breng de RBEC filters in de putjes die de astrocyten. Onder deze omstandigheden in vitro modellen differentiëren en expressie-junction verwante eiwitten binnen 3 dagen. </li><li> De modellen houden hun optimale differentiatie gedurende 3 dagen, tussen maandag en woensdag van de derde week. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

We beschrijven de implementatie van een wekelijkse reproduceerbare protocol voor de isolatie en beplating van de hersenen haarvaten, na zuivering en de cultuur van RBEC en verder opzetten van co-cultuur met primaire astrocyten rat aan een in vitro BBB model met karakteristieke BBB eigenschappen genereren. Succesvol vaststellen van gestandaardiseerde in vitro kweken BBB vereist optimale omstandigheden in de verschillende opeenvolgende stappen van het proces. Het model werd (a) geoptimaliseerd voor de laagste paracellulaire permeabiliteit, die de &quot;heilige graal&quot; van in vitro BBB-modellen blijft, en (b) gevalideerd voor efflux en RMT mechanismen te verkrijgen. Productie, zuivering en verspreiding van RBEC De grootste uitdaging bij het kweken RBEC is om reproduceerbaarheid tussen verschillende culturen te bereiken. Standaardisatie van het protocol vereist hoogwaardige gereedschappen voor dissectie, hoge kwaliteit reagentia en respect van reagens vervaldata. De experimentator moet worden bedreven in micro-dissectie onder stereomicroscoop voor snelle verwijdering van hersenvliezen en grote schepen uit de cortex oppervlak. Zodra de hersenen geïsoleerd en mechanisch gedissocieerd een van de belangrijkste uitdagingen is de optimale enzymatische vertering van de vers geïsoleerde hersenen microvaatjes. Het type en de kwaliteit van de gebruikte enzymen kritisch. Een mix van collagenase type I en II en dispase in hoge concentratie met lage variabiliteit tussen batches gebruikt. Ook van belang zijn de duur van de enzymatische digestie en de verhouding tussen enzymconcentratie / weefsel gewicht / volume van de spijsvertering. De beste opbrengst van hersenen microvaatje productie werd verkregen met het equivalent van 1 cortex van de hersenen in 1 ml collagenase / dispase mengsel bij 60 ug / ml in beide ontsluitingen, respectievelijk 30 min en 1 uur. Ook kritisch is de eliminatie van contaminerende cellens (astrocyten en vooral pericyten). Deze cellen vermenigvuldigen bij een hogere snelheid dan endotheelcellen en geen krappe kruispunten niet vast te stellen met de laatste, waardoor het voorkomen van de opbouw van een homogene cel monolaag met goede paracellulaire restrictiviteit. Aangezien hersenen endotheelcellen tot expressie veel hogere efflux pomp, vooral P-gp, vergeleken met de andere celtypes in microvaatjes zij beter tolereren anders toxische concentraties van P-gp ligand drugs, terwijl niet-endotheelcellen worden geëlimineerd. Puromycine behandeling bij 4 ug / ml voor de eerste twee dagen werd gevolgd door twee dagen bij 2 ug / ml endotheelcel goede zuiverheid te verkrijgen. Deze selectie kan ook voorstander van capillaire endotheelcellen versus die van venulen, precapillaire arteriolen of grotere bloedvaten, en leiden tot strengere monolagen. Bovendien, het gebruik van slechte plasma afgeleide runderserum een noodzakelijk om zuivere kweken van endotheelcellen 47,48 verkrijgen. De plasma-derived serum mist bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF), dat mitogeen voor fibroblasten voor gladde spiercellen en derhalve pericyten. We vonden dat behandeling van kunststof en filters met een combinatie van collageen type IV van muizen en humaan fibronectine levert een belangrijk voordeel, met een 2-voudige toename van de proliferatie opbrengst in vergelijking met de traditioneel aanbevolen collageen type I uit rattenstaart. Belangrijke aanwijzingen voor celproliferatie werden door de extracellulaire matrix zoals integrine en groeifactor (bFGF) activering 49. Buffer concentratie en pH van het kweekmedium zijn beschreven positief effect hebben op paracellulaire dichtheid 50 en observeerden we een betere reproduceerbaarheid tussen culturen aangevuld met HEPES buffer bij 5 mM. Differentiatie van RBEC: Co-cultuur Vestiging op Filters Insert Zodra hersenen endotheliale cellen bEEN gezuiverd en hebben zich verspreid voor 6 dagen, kunnen ze worden uitgeplaat op filters. Cel plating bij hoge dichtheid is van cruciaal belang om een ​​perfecte monolaag verkrijgen. Een zaaien dichtheid van 160x10 3 cellen per 12 wells plaat filters noodzakelijk en voldoende was om een confluente monolaag 24 uur na het uitzaaien verkrijgen. Echter, isolatie van primaire hersentumoren capillaire endotheelcellen uit hun omgeving is paradoxaal in de bouw van een BBB in vitro model zoals bekend is dat primaire cellen, met name de hersenen capillaire endotheelcellen, sterk gereguleerd door de omgeving en inductieve factoren door de verschillende omringende celtypen. Brain capillaire endotheelcellen alleen gekweekt snel de-differentiëren en verliest wat specifieke hersengebieden endotheliale markers. Daarom moet primaire endotheelcellen worden bij lage doorgang (P1) en opnieuw aangesloten, althans gedeeltelijk, met de omgeving door co-cultuur met astrocyten of medium geconditioneerd door astrocyten 47,51. Dit geldtgeldt voor astrocyten differentiatie hersenen endotheelcellen en astrocyten zijn betrokken bij twee-weg inductie. Kweken RBEC met astrocyten geleid tot een sterke inductie van interendotheliale TJ 52,23. De moleculaire mechanismen van herinductietherapie blijven grotendeels onbekend en onderzoek gaande in verschillende laboratoria specifieke modulerende factoren afgescheiden door astrocyten, zodat optimale endotheelcel differentiatie 53,54 kunnen bevorderen identificeren. Factoren uitgescheiden door de hersenen endotheelcellen waaronder leukemie inhiberende factor (LIF) is aangetoond astrocytaire 55,56 differentiatie induceren. Voordat co-cultuur vestiging, werden astrocyten blootgesteld aan differentiatie medium dat de glucocorticoïdereceptoragonist hydrocortison, en co-cultuur geconditioneerd medium. Hydrocortison is bekend dat de dichtheid van hersenen endotheelcellen verbeteren en wordt gebruikt BBB modellen bijzonder van 57 ratten en muizen 58,59 endotheelcellen. De geconditioneerde medium wordt na 3 dagen verzameld uit de onderste compartiment van de endotheelcellen / astrocyten co-cultuur systeem en voor later gebruik bevroren. Het gebruik van co-cultuur geconditioneerd medium verminderde de tijd van endotheliale celdifferentiatie tot 3 dagen met een optimale paracellulaire permeabiliteit voor 2 dagen en ook verbeterd reproduceerbaarheid tussen culturen. Kortom, het protocol beschrijven we levert een reproduceerbare TEER dan 300 ohm-cm 2 en een gemiddelde paracellulaire permeabiliteit coëfficiënt Pe (LY) van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, vergelijkbaar met de beste primaire celgebaseerde BBB modellen 22, 12. Het protocol beschrijven we in dit manuscript met de voorgestelde modulatie van microvaatje enzymatische digestie kunnen worden uitgebreid aan endotheelcellen van de ratten ruggenmerg 60 en hersenen van muizen. Moleculaire en functionele karakterisering BovendienTJ inductie, astrocyten ook bijdragen aan de expressie van transporters zoals P-gp in de hersenen endotheelcellen 61. We zien inderdaad expressie van de efflux transporter P-gp in de BBB model en we tonen de polariteit van het P-gp efflux pomp localisatie middels biochemische benaderingen en P-gp activiteit met behulp van een functionele test. GLT-1 expressie werd gedetecteerd in de basale membraan fractie van microvaatjes, maar was niet in gekweekte RBEC gedetecteerd. Onze hypothese is dat GLT-1 down is geregeld in onze RBEC cultuur in vergelijking met de in vivo omstandigheden en dus niet gedetecteerd door western blot analyse. Overmaat glutamaat neurotoxisch en in vivo, GLT-1 is verantwoordelijk voor glutamaat efflux van het basale compartiment (parenchym) aan het apicale compartiment (bloedcirculatie). In astrocyten blijft GLT-1-expressie zeer laag en wordt geïnduceerd door de toevoeging van glutamaat in het medium 62,63. We hebben ook confIRM de uitdrukking van instroom transporters op de apicale membraan zoals LRP1, LDLR en TfR. Functionaliteit van TfR en LDLR werd gedemonstreerd met binding en transport experimenten van Tf-Cy3 en DiLDL van de luminale naar de abluminale kant van de monolaag zoals eerder getoond met een rund in vitro BBB model 64. Interessant is aangetoond dat lipide behoefte van astrocyten verhoogt de expressie van LDLR op de hersenen capillaire endotheelcellen 65,66 verdere bevestiging van de fysiologische overspraak tussen astrocyten en de hersenen endotheelcellen, zoals in vitro. Wij hebben besloten om vervoer illustreren met fluorescerende kleurstoffen zoals als Cy3 en Dil gezien het feit dat spectrofluorimetrische analyse is beschikbaar in de meeste laboratoria, en kan nuttig zijn om te valideren in vitro BBB-modellen. Echter, kwantificering van fluorescentie is veel minder gevoelig dan radioactiviteit en vereist een toename van het aantal experimenten significante gegevens te verkrijgen.Idealiter Tf en LDL zijn gewoonlijk radioactief gemerkt (jodium 125) voor een dergelijke binding / opname en transport experimenten. We tonen ook dat de gedifferentieerde endotheelcellen monolaag verkregen met de voorgestelde protocol aan ontsteking geïnduceerd door TNF-α, zoals blijkt uit CCL2 afgifte en BBB opening. CCL2 (MCP-1) en zijn receptor CCR2 betrokken bij CZS aandoeningen zoals multiple sclerose, experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) 67, CNS trauma 68 en staan ​​bekend als mediatoren van migratie van leukocyten in het CZS onder neuro-inflammatoire condities 69,70. Met de geteste protocol, kunnen we niet concluderen op een gepolariseerde secretie van CCL2 omdat BBB opening kan de CCL2 concentratie in evenwicht tussen beide bovenste (apicale) en lagere (basale) compartimenten. Daarom hebben we duidelijk onderschatten de hoeveelheid CCL2 door de RBEC in het apicale compartiment van 24 uur (Figuur 5A). Algemeen Overzicht en Beperkingen van BBB in vitro modellen: I n Vivo versus In Vitro en knaagdieren versus Human Vergelijkingen Veelbelovende CNS geneesmiddelen die effectief BBB passage in vitro bleek niet in klinische onderzoeken door een gebrek aan voorspelbaarheid van in vitro modellen BBB vaak gebaseerd op cellen geïsoleerd uit andere soorten dan menselijke. Aan het beste van onze kennis, de in vitro BBB modellen zijn waarschijnlijk meer voorspellend als het gaat om het bestuderen van mechanistische aspecten van eiwitnetwerken, signaaltransductie, transporters en receptoren. Elk mechanisme, pad of doel te worden bestudeerd in vitro te worden gekarakteriseerd voor de regulering van complementaire omgevingsfactoren (andere celtypes, chemicaliën, eiwitten) en gecombineerd om in situ studies met dezelfde diersoort, En indien mogelijk, met bloedvaten en endotheelcellen geïsoleerd van de mens, met de beperkingen en voorzichtigheid opgeroepen hieronder. In vitro BBB-modellen moeten worden gezien als autonome systemen, geïsoleerd uit het lichaam van regelgeving, maar toch begiftigd met grote in vivo eigenschappen en een potentieel voor regulering door omgevingsfactoren. Nee &quot;ideaal&quot; in vitro BBB model wordt nog voorgesteld 71,72,73 omdat de endotheelcel monolagen missen een aantal belangrijke onderdelen van de neuro-vasculaire glia eenheid (NGVU) en worden geïsoleerd uit bloed en lichaamsvloeistoffen regelgeving. Het ontbreken van pericyten 74,16 17,18 neuronen of de verschillende bestanddelen van de extracellulaire matrix voor kunststofbekleding of het kweekmedium en serum voor celgroei in de meest voorkomende en &quot;gemakkelijkst gemaakt&quot; in vitro BBB modellen gebaseerd op endotheliale gedifferentieerde cellen met astrocyten kan eiwitexpressie i modulerenn vergelijking met de in vivo situatie 75. Deze modellen kunnen veel transporters in vivo uit te drukken, maar niet allemaal. In sommige gevallen werden transportparameters eerst gecontroleerd in geïsoleerde bloedvaten (het dichtst bij de in vivo situatie), en vervolgens onderzocht in celkweek systemen 76,61. Moleculair biologisch onderzoek heeft geleid tot de karakterisering van gen-en eiwitexpressie in geïsoleerde bloedvaten en lage passage endotheliale celculturen van dezelfde soort, en tussen verschillende soorten, meestal van kleine dieren zoals knaagdieren (muizen en ratten) of van koe en varken in vergelijking mens 77,78,75,15. Transcriptoom vergelijking van in vivo en in vitro hersenen microvasculaire endotheelcellen liet talrijke gen transcripten die differentieel tot expressie werden gebracht en meestal aanzienlijk downregulated in vitro. Transcripten coderend instroom vervoerders zoals TfR en proteins betrokken bij blaasje mensenhandel worden voornamelijk downregulated in gekweekte hersenen endotheelcellen, hetgeen duidt op een algemene daling van de endocytose en vesiculair transport in dergelijke cellen. Cultuur manipulatie in termen van zuiverheid (puromycine behandeling) en behandeling met hydrocortison kan helpen om een meer &quot;in vivo-achtige&quot; genexpressieprofiel 77 herstellen. Transcriptomic studies bleek ook belangrijke verschillen tussen soorten die voorspellingen over drugs-opname verder te compliceren bij de mens op basis van knaagdieren in vitro BBB-modellen 75. In vitro BBB-modellen met co-cultuur van humane endotheelcellen en astrocyten zijn beschreven 15. Weliswaar relevant, deze modellen zijn moeilijker uit te voeren op regelmatige basis als ze dat gereglementeerde toegang tot post-mortem menselijk weefsel en er is heterogeniteit in de kwaliteit / eigenschappen van de menselijke hersenen endotheelcellen afhankelijk van de leeftijd, ziekten, en mogelijk medische treatment van donoren. Inspanningen worden gedaan om nieuwe in vitro modellen die beter reproduceren fysiologische, anatomische en functionele kenmerken van de in vivo BBB ontwikkelen. Co-culturen waarbij drie-celtypen zijn zeer restrictief en lijken moeilijk te routinematig uitvoeren. Tot op heden de meest complexe in vitro BBB-modellen zijn de dynamische in vitro modellen (DIV-BBB) die vatachtige organisatie met astrocyten omvatten en beschikken over een stroom van medium dat de bloedstroom 75,79,80,81,82 nabootst, 83,84,85. Wanneer cerebrale endotheelcellen worden blootgesteld aan een stroom, de gegenereerde schuifspanning activeert mechanotransducers op het celoppervlak, die de expressie van verschillende genen betrokken bij endotheliale celfysiologie zoals celdeling, differentiatie, migratie en apoptose 80 moduleren. In vivo schuifspanning gegenereerd door de bloedstroom is verantwoordelijk voor mitotische arrestatie in de cel contact, dat de oprichting van een toelaatendotheelcellen monolaag in bloedvat 80. Genomics en proteomics analyse van normaal menselijk brein microvasculaire endotheelcellen toonde het effect van shear stress in BBB-endotheel fysiologie 84. Schuifspanning is verantwoordelijk voor celoverleving, een hogere endotheelcel adhesie, efflux pomp inductie en betere polarisatie van transporteurs 75, regulering van glucosemetabolisme 75,86, oxidatie gemedieerd door CYP450-enzymen 75 en de regulering van paracellulaire permeabiliteit door het verhogen van de expressie van genen die coderen voor intercellulaire junctionele elementen zoals occludin en ZO-1 87,75,80 en bijgevolg hoge TEER rond 1500 - 2000 ohm · cm 2, het dichtst bij bekende in vivo parameters 79,80 In de biotechnologie en farmaceutische industrie, routinematige screening van drugs of zelfs high throughput screening (HTS) en inspanningen om dierproeven te verminderen, leiddede ontwikkeling van verschillende cellijnen worden gebruikt ter vervanging van de primaire kweek van cerebrale endotheelcellen die moeilijker op te zetten routinematig blijven. In de meeste gevallen, werden primaire kweken van cerebrale endotheelcellen getransduceerd met een onsterfelijk makend gen (SV40 of polyomavirus groot T-antigeen of adenovirus E1A), door transfectie van plasmide DNA of door infectie met retrovirale vectoren 88,89,75. Verschillende endotheliale cellijnen van cerebrale oorsprong zijn ontwikkeld, zoals de RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs of rBCEC4 rat cellijnen 88,75, de b.End3 muis cellijn 90,75, de PBMEC/C1 - 2 varkens cellijn 87,75, en de hCMEC/D3 humane cellijn 89,75. Andere modellen gebaseerd op cellen van niet-cerebrale oorsprong zoals Madin-Darby hondennier (MDCK) of Caco2 cellijnen 12,75. Van de verschillende humane cerebrale endotheliale cellijnen is de hCMEC/D3 wijd aubd en verbeterd als een model van BBB sinds haar oprichting in 2005 91,92. Net als primaire culturen, cellijnen aanwezig voordelen en beperkingen. Ze zijn gemakkelijker te hanteren dan de primaire culturen, hebben een langere levensduur, zijn goed gekarakteriseerd en laat reproduceerbaarheid tussen grootschalige experimenten. Echter, cellijnen weefsel-specifieke functies verliest, verlies milieuregelgeving en het verwerven van een moleculaire fenotype heel anders uit cellen in vivo 75, 89. In het bijzonder, monolagen gegenereerd uit cellijnen huidige verlaagde dichtheid, lage TEER-en show transporter profiel variatie 75,89. Zo dierproeven of studies in primaire cellen zijn vaak de voorkeur, ondanks hun toegevoegde complexiteit.

Veel geneesmiddelen ontwikkeld centraal zenuwstelsel (CNS) te behandelen aandoeningen zijn niet in staat om de hersenen parenchym in therapeutisch relevante concentraties bereiken. De BBB beschermt hersenen zenuwweefsel van de fluctuatie van plasma samenstelling van ziekteverwekkers en onderhoudt homeostase van het hersenparenchym door uitsluitend niet-specifieke flux van ionen, peptiden, eiwitten en zelfs cellen in en uit de hersenen 1. BBB kenmerken worden opgewekt en gehandhaafd door intieme nabijheid en overspraak tussen de gespecialiseerde klasse hersenen microvasculaire endotheelcellen en naburige elementen van de neuro-vasculaire glia-eenheid (NGVU) zoals neuronen, gliacellen (nauwkeuriger astrocyten eind voet), en pericyten gevat in de basale membraan dat in hoofdzaak bestaat uit collageen type IV, fibronectine, laminine en proteoglycanen 2,3. Pericytes dekken ongeveer 22-32% van het endotheel op het capillair niveau en spelen een belangrijkerol in de regulatie van endotheel proliferatie, angiogenese en ontstekingsprocessen. Endotheelcellen vormen een continu vel die het binnenoppervlak van de haarvaten. Zij zijn onderling verbonden door TJS die een bandvormige structuur te vormen in het apicale gebied en die bijdragen tot polarisatie cel. Astrocytes reguleren BBB eigenschappen en zijn bronnen van belangrijke regulerende factoren zoals TGF-β, GDNF, bFGF en IL-6. Astrocyten tekort aan GFAP met onvolledige functionaliteit zijn niet in staat om BBB-eigenschappen 4 reguleren. Neuronen zijn niet direct structureel betrokken bij de vorming van de BBB, maar reguleren ook belangrijke aspecten van eiwitexpressie en BBB functies 5. Om verdere studie van de structuur, fysiologie en pathologie van de BBB, in vitro modellen van BBB werd ontwikkeld als research tools. Brain endotheelcellen zijn gewonnen uit verschillende soorten uit te voeren in vitro BBB-modellen op basisop lage passage primaire kweken van runderen 6,7, varkens 8,9, 10,11,12 rat, muis 13 en ook de menselijke 14,15. Deze modellen zijn bekend bootsen de in vivo BBB, vooral wanneer co-gekweekt met gliale cellen van rat of muis en / of pericyten 16,12 en / of neurale voorlopercellen cel afkomstige astrocyten 17 en / of neuronen 18. De &quot;in lab&quot; modellen vaak uit knaagdieren omdat zij kunnen in vitro / in vivo experimenten en vergelijkingen en / of het onderzoek van de hersenen endotheelcellen uit transgene modellen 19. Nieuw ontwikkelde in vitro BBB-modellen zijn ook ontworpen om te helpen de hersenen opname van potentiële CNS kandidaat-geneesmiddelen voorafgaand aan in vivo testen 15,20,21,3,6,22,11,23 voorspellen. In vitro BBB-modellen worden meestal gebruikt om te vergelijken het vervoer van drugs met: i) bekend penetratie in het CZS of met low permeabiliteit over de BBB en geen centrale effecten, en ii) de schijnbare Pe van dezelfde geneesmiddelen gemeten in diermodellen van dezelfde soort. De geneesmiddelen die gemakkelijk over de BBB meestal lipofiele en steek de hersenen endotheliale celmembranen door lipide gemedieerde gratis verspreiding (cafeïne, carbamazepine, enz.). De negatief vervoerde geneesmiddelen zoals digoxine, verapamil of cyclosporine A actief geëxtrudeerd door hersenen endotheliale transporters zoals P-gp. Echter, veel van de nieuw ontwikkelde therapeutische moleculen biofarmaceutica, zoals recombinante eiwitten, siRNA of monoklonale antilichamen. De meeste van hen de BBB niet oversteken door i) het ontbreken van specifieke vervoerders, en ii) de dicht opeengepakte laag van endotheelcellen, die voorkomen dat hoge gewicht moleculen gevormd worden van het ondergaan paracellulaire passage. Met deze grenzen, &quot;Trojaans paard&quot; strategieën zijn geïmplementeerd met behulp van vectoren (antilichamen, peptiden) tegen bekende receptoren op de BBB, betrokken zijn in receptor gemedieerd transport of transcytose (RMT), zoals transferrine (Tf) receptor (TfR), de insulinereceptor (IR), of leden van de LDL receptor (LDLR)-gerelateerde receptoren (LDLR, LRP1). Dergelijke receptoren zijn gevonden op geïsoleerde hersenen haarvaten en de BBB in vivo 24,25. Transcriptionele profielen van deze receptoren, met name die van de familie LDLR, werden geanalyseerd en vergeleken tussen de hersenen endotheelcellen en hersenen endotheelcellen samen gekweekt met astrocyten of hersenen haarvaten direct na extractie uit de hersenen 26. Pardridge 24 opende het veld met de OX-26 antilichaam tegen de transferrinereceptor (TfR), gevolgd door antilichamen tegen de insulinereceptor en insuline-groeifactor receptor 27,28. Met deze antilichamen gebaseerde vectoren, heeft ArmaGen Technologies een BBB moleculair Trojaans paard platform technologie ontwikkeld om drugs te leveren, waaronder eiwitten, over de BBB 29. Deliteratuur is rijk aan gegevens waaruit blijkt LRP1 expressie in de hersenen endotheelcellen en haar rol als een krachtige endocytisch / scavenger receptor. Western blot analyse suggereerde dat LRP1 wordt uitgedrukt in fracties, aangerijkt met hersenen haarvaten en in de hersenen van de rat capillaire endotheelcellen 30. Bedrijven zoals Angiochem doel LRP1 met peptide vectoren afgeleid van aprotinine dat efficiënte drug instroom te bevorderen over de BBB 31. Echter, is LRP1 ook betrokken bij actief transport van AB en haar efflux / ontruiming van de hersenen parenchym om bloed 32. Deze gegevens omvatten LRP1 in een bidirectionele transport over de BBB afhankelijk van de liganden. biOasis ontwikkelt Transcend technologie met een eiwit melanotransferrine voor het transport van biologische zoals lysosomale enzymen en antilichamen over de BBB 33 terwijl VECT-HORUS ontwikkelt peptide vectoren die de LDLR 34 richten. Er worden gegevens suggereren dat de LRP en LDLR kunnen worden gebruikt diff vervoerenErent moleculen zoals lysosomale enzymen 35,36 of nanodeeltjes complexen over de BBB 37. Ons aandachtsgebied is drug delivery aan de CNS behulp vectormoleculen en vectorized drug-kandidaten voor de behandeling van het centrale zenuwstelsel. Vooral geneesmiddelafgifte over de BBB is in het kader van ontstekingsprocessen in een proces dat kan variëren in de mate van belang, maar dat waarschijnlijk voor alle hersenletsels en ziekten, waaronder encefalitis, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer enz. ontstekingsprocessen wordt geassocieerd met BBB-ontsteking en mogelijk veranderingen in BBB fysiologie en permeabiliteit gezien het feit dat paracellulaire en transcellulaire vervoer kan worden versterkt in pathologische omstandigheden 38,39,40,41,42,43. Bijvoorbeeld, TNF-α, TWEAK, en andere cytokinen moduleren ontsteking en experimenten met in vitro BBB modellen hebben aangetoond dat zij de paracellulaire eigenschappen van e kan veranderene endotheelcellen monolaag 38,39,40 en TNF-α leidt ook tot een toename van transcellulair transport van LDL 41, holotransferrin 42 en 43 lactoferrine. Ons doel was het ontwikkelen en karakteriseren van een geoptimaliseerde en zeer reproduceerbaar rat syngeen BBB-model met behulp van co-culturen van primaire hersentumoren endotheelcellen en astrocyten. We gebruikten 5 week oud en neonatale Wistarratten voor hersenen endotheelcellen productie en astrocyten productie respectievelijk. Een uitdaging was om een ​​protocol waarmee de productie van &quot;wekelijkse reproduceerbare&quot; BBB-modellen vast te stellen. Om deze doelstelling te bereiken, elke stap van het productieproces protocol werd uitgevoerd op vaste dagen van de week, vanaf hersenen microvessel productie op woensdag van de eerste week. Dissecties werden bijna elke week uitgevoerd tijdens de laatste 3 jaar. Verdere verbetering van de reproduceerbaarheid van de culturen, werd een systeem voor kwaliteitsborging. Alle Reagents en chemicaliën werden verwezen in een databank (datum van binnenkomst, voorraad, vervaltermijn, enz.). Het model werd gekarakteriseerd na een aantal criteria, zoals endotheelcellen organisatie en zuiverheid, TEER, LY permeabiliteit, respons op pro-inflammatoire middelen, kwalitatieve en kwantitatieve expressie van eiwitten TJ functionaliteit van transporters zoals P-gp en receptoren betrokken transcytose in de endotheelcellen monolaag zoals TfR of LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​regelt specifiek de moleculaire en cellulaire flux tussen het bloed en het zenuwweefsel. Ons doel was het ontwikkelen en karakteriseren zeer reproduceerbare syngeen rat in vitro model van de BBB met co-culturen van primaire endotheelcellen van rattenhersenen (RBEC) en astrocyten receptoren betrokken transcytose in de endotheelcellen monolaag bestuderen. Astrocyten werden geïsoleerd door mechanische dissectie volgende trypsinedigestie en voor later co-cultuur zijn bevroren. RBEC werden geïsoleerd uit 5 weken oude cortex rat. De hersenen werden ontdaan van hersenvliezen en witte stof, en mechanisch gescheiden na enzymatische afbraak. Daarna werd het weefselhomogenaat in runderserumalbumine gecentrifugeerd verblijf fragmenten scheiden van zenuwweefsel. De fragmenten schip onderging een tweede enzymatische digestie vrij endotheelcellen uit hun extracellulaire matrix. De resterende contaminerende cellen zoals pericyten werden fERDERE geëlimineerd door plating de microvessel fragmenten in-puromycine bevattend medium. Ze werden vervolgens gepasseerd op filters voor co-cultuur met astrocyten geteeld op de bodem van de putjes. RBEC uitgedrukt hoge niveaus van tight junction (TJ) eiwitten zoals occludin, claudin-5 en ZO-1 met een typische lokalisatie in de cel grenzen. De transendotheliale elektrische weerstand (TEER) van de hersenen endotheliale monolagen, met vermelding van de dichtheid van TJs bereikt 300 ohm · cm 2 gemiddeld. De endotheliale permeabiliteit coëfficiënten (Pe) voor lucifer geel (LY) was zeer reproduceerbaar met een gemiddelde van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotheelcellen georganiseerd monolagen sprak de efflux transporter P-glycoproteïne (P-gp), toonde een gepolariseerd transport van rhodamine 123, een ligand voor P-gp, en toonde specifieke transport van transferrine-Cy3 en DiILDL in de endotheelcellen monolaag. Tot slot bieden we een protocol voor het opzetten van een in vitroBBB model dat zeer reproduceerbaar door de kwaliteitsborgingsmethoden en die geschikt is voor onderzoek naar BBB transporters en receptoren.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MRI-geleide Verstoring van de bloed-hersen barrière met behulp van Transcraniële Focused Ultrasound in een ratmodel

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Rat Model van bloed-hersen barrière Verstoring toestaan ​​Gerichte Neurovasculaire Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemie-reperfusie letsel model voor de studie bloed-hersenbarrière Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

Een Rat Carotis Balloon Injury Model te testen Anti-vasculaire remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...