Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Le soutien financier à VECT-HORUS est reconnu dans le Fonds Unique Interministériel (projet FUI / MEDUL) et à Vect-Horus et le laboratoire UMR7259 de l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, l&#39;ADHOC et des projets de collaboration PREVENTAD) . Le laboratoire UMR7259 reconnaît également le soutien financier du CNRS et de l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille.

1. Production de Rat astrocytes Pour chaque préparation utiliser 10 rats Wistar néonatale de l&#39;autre sexe. <ol><li> Sacrifier les rats par des têtes de coupe avec une paire de ciseaux et de les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant un tampon de dissection froid: HBSS complété avec 1% de sérum-albumine bovine (niveau bas d&#39;endotoxine BSA), de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml. </li><li> Couper le cerveau en deux, pour séparer les deux hémisphères cérébraux et les transférer dans une boîte de Pétri propre avec un tampon de dissection sur la glace. Couper le nerf optique et retirez les méninges sous un stéréomicroscope. </li><li> Laver les morceaux corticales largement dans 50 ml de tampon de dissection froide. </li><li> Placez les morceaux corticales de 3 cerveaux dans un tube Falcon de 15 ml et dissocier par aspiration et refoulement d&#39;un couple de fois avec une pipette jetable de 10 ml équipé d&#39;une pointe bleue dans 6 ml de trypsine à 0,05% - EDTA 0,02% pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 24 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques suivants pénicilline, 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml, un milieu appelé milieu cellulaire gliale (MCG), et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Lots de FBS ont été sélectionnés et validés pour la croissance et la survie de cutures d&#39;astrocytes. </li><li> Reprendre le culot contenant les cellules dissociées dans 10 ml GCM et la plaque en 75 cm 2 T-ballon (T75). Changer le support le lendemain pour enlever les débris de cellules et de l&#39;ADN. Remplacez le support de culture deux fois par semaine. </li><li> Après 1 semaine de la prolifération, secouez doucement les cellules gliales avec un agitateur orbital à 60 rpm pendant 24 heures à 37 ° C dans GCM. Si le T75 ne peut pas être placé dans un incubateur avec 5% de CO 2/95% d&#39;air à 37 ° C atmosphère humidifiée, compléter les médias mM HEPES 5. Laver les cellules deux fois pour rEDéplacez les cellules microgliales non-adhérentes. </li><li> Trois semaines après le semis, laver les cellules deux fois avec DPBS sans calcium et magnésium. Ajouter 3 ml de trypsine chaud 0,05%-EDTA 0,02%, incuber à 37 ° C et attendre jusqu&#39;à ce que la couche de cellules est dispersée (généralement 5 min). Inhiber l&#39;activité de la trypsine en ajoutant 10 ml de GCM, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et Falcon à 120 g pendant 8 min. </li><li> Reprendre le culot des astrocytes dans 90% de FBS - 10% de DMSO, les transférer dans des cryotubes (2 x 10 6 cellules par tube cryogénique) et magasin dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Isolement des microvaisseaux du cerveau de rat Nos procédures expérimentales sont approuvés par le comité d&#39;éthique de la faculté de médecine de Marseille et sont conformes aux réglementations nationales et européennes (directive européenne n ° 86/609). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance des animaux et de réduire le nombre d&#39;animaux utilisés. <ol><li> Pour chaque préparation et pour un experimenter, utiliser 3 vieilles cinq semaines des rats Wistar. </li><li> Lundi de la première semaine, de préparer deux flacons T75 par revêtement avec du collagène de type IV et de la fibronectine, à la fois à 1 pg / cm 2 dans l&#39;eau de culture stérile (10 ml par T75). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu&#39;à ce que microvaisseaux semis. </li><li> Mercredi matin de la première semaine, euthanasier les rats sous un flux croissant de CO 2 pour induire la somnolence, la perte de la posture et la respiration interruption, suivie d&#39;une dislocation cervicale. Vaporiser les têtes avec 70% d&#39;éthanol. Couper les têtes avec une paire de ciseaux et de les transférer dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les nerfs optiques, puis de les transférer dans une boîte de Pétri refroidi sur de la glace et rempli avec du tampon de dissection froide (HBSS complété avec 1% de BSA, de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml) . </li><li> Couper le cerveau en deux pour séparer les deux hémisphères cérébraux et le mésencéphale séparée de pourebrain. Transférer les forebrains dans une boîte de Petri propre sur la glace avec un tampon de dissection. </li><li> Prenez quelques hémisphères dans une nouvelle boîte de Pétri avec un tampon de dissection froide pour enlever soigneusement les méninges des forebrains sous un stéréomicroscope avec N ° 5 des pinces courbes. Ensuite, nettoyer l&#39;intérieur du cerveau pour enlever la couette de la myéline et obtenir une enveloppe de cortex. Ces mesures ne devraient pas prendre plus de 2 heures pour la préservation des tissus et la survie cellulaire. </li><li> Dissocier le cortex du cerveau en 3 6 ml de tampon de dissection froide dans un 7 ml DOUNCE homogénéisation par 10 de haut en bas coups avec chacun des deux pilons de différents jeux, 71 pm suivie par 20 um. </li><li> Diviser la suspension pour obtenir l&#39;équivalent d&#39;une cortex dans 1 ml d&#39;un tube Falcon de 50 ml et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant. </li><li> Digérer la suspension de 1 cortex avec 1 ml d&#39;une solution enzymatique contenant un mélange de collagénase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), la DNase de type I (35 ug / ml - 20 K unités / ml) et de la gentamicine (50 pg / ml) dans un agitateur pendant 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Mélanger le 1 ml de digérer 1 cortex avec 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X et séparé par centrifugation dépend de la densité à 3600 g pendant 15 min à température ambiante. Transférer délicatement le disque supérieur (la myéline et le parenchyme cérébral) et le surnageant dans un 50 ml tube Falcon propre et répéter la centrifugation. Gardez le culot obtenu contenant les microvaisseaux du cerveau à 4 ° C. </li><li> Prenez soin de le disque supérieur et le surnageant. Reprendre les culots résultants contenant les microvaisseaux du cerveau avec 1 ml de HBSS 1X froid et transférer dans un 50 ml tube Falcon propre. </li><li> Laver les microvaisseaux par addition de 20 ml de HBSS 1X froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Digérer en outre les microvaisseaux du cortex une avec 1 ml de la même solution enzymatique telle que décrite dans l&#39;étape 2.9 pendant 1 heure à 37 ° C dans un shAker. </li><li> Ensuite, mélanger les microvaisseaux digérés à partir de chacun des trois cortex dans un tube et en outre séparer en deux 50 ml tubes Falcon pour obtenir des microvaisseaux extraites à partir de l&#39;équivalent d&#39;une fois et demie (1,5) cortex par tube. Ajouter 30 ml de tampon de dissection froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot de microvaisseaux dans 10 ml de DMEM/F12 supplémenté avec 20% de plaquettes bovine plasma pauvre en sérum dérivé, fibroblastes facteur de croissance basique (bFGF, 2 ng / ml), de l&#39;héparine (100 ug / ml), de la gentamicine (50 pg / ml) et HEPES (2,5 mM), du nom de support de cellules endotheliales (ECM) supplémenté avec de la puromycine à 4 pg / ml. </li><li> Prendre les deux flacons T75 revêtues de l&#39;incubateur, aspirer l&#39;excès de revêtement et de la plaque les microvaisseaux de chaque tube dans un flacon T75 (des microvaisseaux extraits de cortex 1,5 par flacon T75). </li></ol> 3. Purification et la prolifération des RBEC Primocultures <ol><li> Purification: du mercredi au vendredi, ajouter puromycin à 4 pg / ml de milieu de culture. Changer le support le jeudi. Le vendredi, laver les cellules et ajouter puromycine à 2 pg / ml jusqu&#39;à lundi. </li><li> Prolifération: le lundi de la deuxième semaine, laver les cellules et ajouter de l&#39;insuline, de la transferrine et le supplément de sélénite de sodium pour les milieux de culture jusqu&#39;à ce que les cultures atteignent 90% de confluence le mercredi de la deuxième semaine. </li></ol> . 4 Différenciation: Mise en place du modèle in vitro du Bureau <ol><li> Lundi de la deuxième semaine, préparer filtres (polyéthylène, 12 puits, la taille des pores 1,0 um) par enrobage avec un mélange de collagène de type IV et de la fibronectine à la fois à 0.5μg/cm 2 dans l&#39;eau de culture stérile (500 pi de mélange dans le compartiment supérieur et 1,5 ml d&#39;eau stérile de culture dans le compartiment inférieur). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu&#39;à ce que RBEC semis. </li><li> Lundi de la deuxième semaine, cinq jours avant la création de la co-culture, dégeler les astrocytes de cryotubes à 37 ° C et le transfertdans 15 ml Falcon avec 10 ml GCM. Centrifuger la suspension à 120 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Reprendre le culot dans des astrocytes et GCM plaque à une densité de 30 x 10 3 cellules par cm 2 dans des plaques à 12 puits. </li><li> Mercredi de la deuxième semaine, juste avant la dissociation de RBEC avec de la trypsine, laver deux fois le filtre de pré-enduit avec du milieu DMEM/F12. Pré-remplir les chambres avec ECM: 1,5 ml dans le compartiment inférieur et 0,5 ml dans le compartiment supérieur. </li><li> Mercredi de la deuxième semaine, laver deux fois avec du DPBS RBEC sans calcium et magnésium. Ajouter 4 ml de trypsine 0,05% chaud - EDTA solution de 0,02% à 37 ° C par flacon T75 pendant 30 secondes exactement. Ensuite, retirer 3,5 ml de solution de trypsine et observer au microscope. Lorsque la couche de cellules commence à se détacher de la matrice, les aider à en tapotant doucement le bord du flacon T75 jusqu&#39;à ce que toutes les cellules sont flottantes. </li><li> Ajouter 9 ml d&#39;ECM par flacon T75 et transférer dans un tube Falcon de 15 ml. Très dissocier doucement la cellulesuspension par pipetage de haut en bas quatre fois avec une pipette de 10 ml, muni d&#39;un embout jaune (éviter la production de bulles dans la solution). Compter les cellules dans la suspension (environ 3 x 10 6 cells/T75) et de la plaque immédiatement sur ​​des filtres de pré-revêtues et pré-remplis à haute densité (160 x 10 3 cellules / filtre donc environ 18 filters/T75) (Figure 8 ). Le lendemain (jeudi), changer deux fois la moyenne du compartiment supérieur pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Jeudi de la deuxième semaine, la veille de la création de la co-culture, remplacer le milieu de culture des astrocytes par 1,5 ml de milieu de différenciation (ECM avec hydrocortisone à 500 nM) qui peuvent être complétés par des tiers milieu conditionné du compartiment basal d&#39;une précédente co-culture (3 jours de contact entre les cellules endothéliales et les astrocytes). </li><li> Vendredi de la deuxième semaine est défini comme le jour 0 de différenciation; remplacer le milieu de culture à partir de la conta filtresining la RBEC avec les médias de différenciation. Transférer les filtres de RBEC dans les puits contenant les astrocytes. Dans ces conditions, des modèles in vitro se différencient et expriment des protéines liées à jonction-dans les 3 jours. </li><li> Les modèles gardent leur différenciation optimale pendant 3 jours, entre le lundi et le mercredi de la troisième semaine. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

De nombreux médicaments développés pour traiter le système nerveux central (SNC) ne parviennent pas à le parenchyme cérébral à des concentrations thérapeutiques pertinentes. La BHE protège les tissus nerveux du cerveau à partir de la fluctuation de la composition du plasma, à partir d&#39;agents pathogènes, et maintient l&#39;homéostasie du parenchyme cérébral, en limitant le flux non spécifique des ions, des peptides, des protéines et même des cellules dans et hors du cerveau 1. Caractéristiques BBB sont induite et maintenue par la proximité intime et la diaphonie entre les classes spécialisées des cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux et des éléments voisins de l&#39;unité neuro-glie-vasculaire (NGVU) comme les neurones, les cellules gliales (plus précisément astrocytes fin-pieds), et péricytes ensheathed dans la membrane basale, qui se compose essentiellement de collagène de type IV, la fibronectine, la laminine et les protéoglycanes 2,3. Péricytes couvrent environ 22 - 32% de l&#39;endothélium au niveau des capillaires et jouent un rôle importantrôle dans la régulation de l&#39;endothélium prolifération, l&#39;angiogenèse et des processus inflammatoires. Les cellules endotheliales forment une nappe continue couvrant la surface interne des capillaires. Ils sont reliés entre eux par JT, qui forment une structure en forme de bande à la région apicale et qui contribuent à la cellule de polarisation. Les astrocytes régulent les propriétés et BBB sont des sources de facteurs de régulation importants tels que le TGF-β, du GDNF, du bFGF et de l&#39;IL-6. Astrocytes déficientes en GFAP avec des fonctionnalités incomplètes ne sont pas en mesure de réglementer BBB propriétés 4. Les neurones ne sont pas directement impliqués dans la formation de structure de la BHE, mais également des aspects importants de réguler l&#39;expression des protéines et les fonctions BBB 5. Afin d&#39;étudier davantage la structure, la physiologie et la pathologie du Bureau, des modèles in vitro du Bureau ont été développées comme outils de recherche. les cellules endothéliales de cerveau ont été extraits de diverses espèces de mettre en oeuvre dans les modèles in vitro basé BBBde faibles cultures primaires de passage de bovin 6,7, 8,9 porcine, rat 10,11,12, 13 souris et aussi humain 14,15. Ces modèles sont connus pour imiter le Bureau vivo dans, en particulier lorsqu&#39;ils sont co-cultivées avec des cellules gliales de rat ou de souris et / ou de péricytes, 16,12 et / ou des astrocytes dérivées de cellules progénitrices neurales 17 et / ou 18 neurones. Les modèles &quot;de laboratoire&quot; en sont souvent fabriqués à partir de rongeurs car ils permettent à des expériences in vitro et des comparaisons et / ou l&#39;étude des cellules endothéliales de cerveau produites à partir de modèles transgéniques / 19 in vivo. Nouvellement développé des modèles in vitro BBB ont également été conçus pour aider à prévoir cerveau absorption de médicaments potentiels SNC candidats avant le test in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modèles in vitro BBB sont généralement utilisés pour comparer le transport de la drogue avec: i) la pénétration connu dans le SNC ou avec low perméabilité à travers la barrière hématoencéphalique et aucun des effets centraux, et ii) la Pe apparente des mêmes médicaments mesurées dans des modèles animaux de la même espèce. Les médicaments qui passent facilement la BBB sont principalement lipophiles et traversent les membranes des cellules endothéliales du cerveau par diffusion libre médiée par un lipide (caféine, la carbamazépine, etc.) Les médicaments transportés négativement tels que la digoxine, le vérapamil ou la cyclosporine A sont activement extrudées par endothéliales cérébrales transporteurs d&#39;efflux telles que la P-gp. Cependant, la plupart des molécules thérapeutiques nouvellement développés sont produits biopharmaceutiques, tels que les protéines recombinantes, siRNA ou des anticorps monoclonaux. La plupart d&#39;entre eux ne traversent pas la BBB en raison de: i) l&#39;absence de transporteurs spécifiques, et ii) la couche serrées des cellules endotheliales, qui empêchent les molécules de poids moléculaire élevé de subir passage paracellulaire. Avec ces limites, les stratégies &quot;Troie de cheval&quot; ont été mis en œuvre en utilisant des vecteurs (anticorps, peptides) contre les récepteurs connus au Bureau, impliqués in médiée par le récepteur du transport ou de transcytose (RMT), tels que la transferrine (Tf) récepteur (TfR), le récepteur de l&#39;insuline (IR), ou des membres du récepteur des LDL (LDLR), liés à la famille du récepteur (LDLR, LRP1). Ces récepteurs ont été trouvés sur isolés capillaires du cerveau et dans le Bureau in vivo 24,25. Les profils de transcription pour ces récepteurs, en particulier ceux de la famille LDLR, ont été analysés et comparés entre les cellules endothéliales cérébrales et cellules endothéliales cérébrales co-cultivées avec des astrocytes ou des capillaires du cerveau directement après leur extraction à partir de cerveau 26. Pardridge 24 a ouvert le champ avec l&#39;anticorps OX-26 contre le récepteur de la transferrine (TfR), suivis par des anticorps dirigés contre le récepteur de l&#39;insuline et le récepteur du facteur de croissance de type insuline 27,28. Avec ces vecteurs de base d&#39;anticorps, ArmaGen Technologies a développé un cheval de Troie moléculaire technologie de plate-forme de cheval du Bureau pour fournir des médicaments, y compris les protéines, à travers le Bureau 29. Lalittérature est riche en données montrant l&#39;expression de LRP1 dans des cellules endothéliales de cerveau et de son rôle en tant que récepteur d&#39;endocytose / scavenger puissant. L&#39;analyse Western blot a suggéré que LRP1 est exprimée en fractions enrichies dans des capillaires du cerveau et dans le cerveau de rat cellules endothéliales capillaires 30. Des sociétés telles que AngioChem cible LRP1 avec des vecteurs peptidiques dérivées de l&#39;aprotinine qui favorisent efficace afflux de drogues à travers le Bureau 31. Cependant, LRP1 est également impliquée dans le transport actif de Aß et son efflux / jeu de parenchyme cérébral à sang 32. Ces données impliquent LRP1 dans un transport bidirectionnel à travers le Bureau en fonction de ses ligands. biOasis développe la technologie de Transcend utilisant un mélanotransferrine de protéine pour le transport de produits biologiques tels que des enzymes lysosomales et des anticorps à travers la BHE 33 tandis que VECT-HORUS développe des vecteurs peptidiques qui ciblent le LDLR 34. Il données suggère que le PRL et LDLR peuvent être utilisés pour le transport de diffmolécules érents tels que les enzymes lysosomales 35,36 ou complexes de nanoparticules à travers la BHE 37. Notre champ d&#39;intérêt est l&#39;administration de médicaments pour le système nerveux central en utilisant des molécules de vecteur et de candidats-médicaments vectorisés pour le traitement des maladies du système nerveux central. En particulier, l&#39;administration de médicaments à travers la BHE doit être considérée dans le contexte de la neuro-inflammation, un processus qui peut varier dans son étendue, mais qui est probablement commun à toutes les lésions et les maladies du système nerveux central, y compris l&#39;encéphalite, la sclérose en plaques, la maladie d&#39;Alzheimer, etc Neuroinflammation est associée à l&#39;inflammation du Bureau et potentiellement à des changements dans la physiologie du Bureau et de la perméabilité paracellulaire et considérant que le transport transcellulaire peuvent être amplifiés dans des conditions pathologiques 38,39,40,41,42,43. Par exemple, le TNF-α, tordre, et d&#39;autres cytokines modulent l&#39;inflammation, et des expériences avec des modèles in vitro à BBB ont montré qu&#39;ils peuvent modifier les propriétés de paracellulaires ee monocouche de cellules endothéliales 38,39,40 et que le TNF-α conduit également à une augmentation du transport transcellulaire de LDL 41, holotransférrine 42 et 43 de la lactoferrine. Notre objectif était de développer et caractériser un optimisée et syngénique de rat hautement reproductible modèle du Bureau en utilisant des co-cultures de cellules primaires endothéliales cérébrales et les astrocytes. Nous avons utilisé cinq semaines vieux et néonatale rats Wistar pour la production de cellules endothéliale du cerveau et de la production des astrocytes respectivement. Un défi a été d&#39;établir un protocole permettant la production de modèles BBB &quot;hebdomadaire reproductibles». Pour atteindre cet objectif, chaque étape du protocole de production a été réalisée à des jours fixes de la semaine, à partir de la production cerveau des microvaisseaux le mercredi de la première semaine. Les dissections ont été réalisées presque chaque semaine au cours des 3 dernières années. Pour améliorer encore la reproductibilité des cultures, un système d&#39;assurance de la qualité a été créé. Tous Reagents et les produits chimiques ont été référencés dans une base de données (date d&#39;entrée, stock, la date d&#39;expiration, etc.) Le modèle a été caractérisée après un certain nombre de critères, tels que l&#39;organisation des cellules endothéliales et la pureté, TEER, LY perméabilité, la réponse aux agents pro-inflammatoires, l&#39;expression qualitative et quantitative des protéines TJ, la fonctionnalité des transporteurs d&#39;efflux telles que la P-gp, et les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endotheliales tels que le TfR ou le LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

La barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​régule spécifiquement flux moléculaire et cellulaire entre le sang et le tissu nerveux. Notre objectif était de développer et de caractériser un syngénique de rat hautement reproductible modèle in vitro de la BHE en utilisant des co-cultures de cellules endothéliales de cerveau de rat primaires (RBEC) et les astrocytes pour étudier les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endothéliales. Les astrocytes ont été isolés par dissection mécanique après digestion de la trypsine et ont été gelés pour la co-culture plus tard. RBEC ont été isolés à partir de 5 semaines d&#39;âge cortex de rat. Les cerveaux ont été nettoyés des méninges et de la substance blanche, et dissociées mécaniquement après digestion enzymatique. Ensuite, l&#39;homogénat a été centrifugé dans les tissus de l&#39;albumine de sérum bovin pour séparer les fragments de vaisseaux à partir de tissu nerveux. Les fragments de navires ont subi une deuxième digestion enzymatique des cellules endothéliales libres de leur matrice extracellulaire. Les cellules contaminantes restantes telles que les pericytes ont été Futres éliminé par l&#39;étalement des fragments de microvaisseaux dans un milieu contenant la puromycine. Elles ont ensuite été soumises à des passages sur des filtres pour la co-culture avec des astrocytes cultivés sur le fond des puits. RBEC exprimé des niveaux élevés de jonctions serrées (TJ) des protéines telles que occludine, claudine-5 et ZO-1 avec une localisation typique aux frontières cellulaires. La résistance électrique transendothéliale (TEER) de cerveau monocouches endothéliales, indiquant l&#39;étanchéité du JT atteint 300 ohms · cm 2 en moyenne. Les coefficients de perméabilité endothéliale (Pe) pour le jaune lucifer (LY) était très reproductible avec une moyenne de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. les cellules endothéliales de cerveau organisés en monocouches ont exprimé le transporteur d&#39;efflux P-glycoprotéine (P-gp), ont montré un transport polarisé de la rhodamine 123, un ligand de P-gp, et ont montré transport spécifique de la transferrine-Cy3 et DiILDL à travers la monocouche de cellules endothéliales. En conclusion, nous proposons un protocole pour la mise en place in vitroModèle du Bureau qui est hautement reproductible en raison des méthodes d&#39;assurance de la qualité, et qui est approprié pour la recherche sur les transporteurs et les récepteurs BBB.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d&#39;un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L&#39;expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l&#39;inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

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