Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

תמיכה כספית לVect-הורוס הוא הודה מFonds ייחודי Interministériel (פרויקט fui / MEDUL) וVect-הורוס והמעבדה UMR7259 מNationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, adhoc ופרויקטים משותפים PREVENTAD) . המעבדה UMR7259 גם מכירה תמיכה כספית מCNRS ומAix-Marseille האוניברסיטה.

1. הפקה של עכברוש האסטרוציטים עבור כל הכנה להשתמש 10 חולדות Wistar יילודים משני מינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החולדות על ידי חיתוך ראשים עם זוג מספריים ולהעביר אותם באופן מיידי בצלחת פטרי יבשה תחת הזרימה למינרית. הסר את המוח מהגולגולת בלי המוח הקטן ולהעביר אותם באופן מיידי לתוך צלחת פטרי המכילה חיץ נתיחה קר: HBSS בתוספת 1% הסרום אלבומין שור (רמה הנמוכה של רעלן פנימי BSA), 100 יחידות פניצילין / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המוח לשניים, כדי להפריד בין 2 אונות המוח ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי נקייה עם חיץ לנתיחה על קרח. חותכים את עצב הראייה ולהסיר את קרומי המוח בסטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלקים בקליפת המוח בהרחבה ב50 מיליליטר של חיץ לנתיחה קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חתיכות קליפת המוח מ3 מוחות לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר ולנתק על ידי pipetting למעלה ולמטה הפיכהle פעמים עם טפטפת חד פעמי 10 מיליליטר מצויד בטיפ כחול ל6 מיליליטר של טריפסין 0.05% - EDTA 0.02% במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 24 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS והאנטיביוטיקה הבאות, פניצילין 100 יחידות / מיליליטר וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר, תקשורת בשם תקשורת גליה תא (GCM), ו צנטריפוגות XG 300 5 דקות ב RT. קבוצות FBS נבחרו ואושרו לצמיחה וההישרדות של cutures astrocyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור המכיל את התאים ניתקו ב10 GCM מיליליטר וצלחת לתוך 75 סנטימטר 2 T-צפחת (T75). לשנות את המדיום למחרת להסיר את פסולת התא וה-DNA. החלף את תרבות התקשורת פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השבוע של ריבוי 1, בעדינות לנער את תאי גלייה עם שייקר מסלולית ב60 סל&quot;ד במהלך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בGCM. אם T75 לא יכול להיות ממוקם באינקובטור עם 5% CO באוויר 2/95% על 37 מעלות אווירת humidified C, להשלים את התקשורת עם 5 HEPES מ&quot;מ. לשטוף את התאים פעמיים לימיןסר תאי microglial שאינם חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה שבועות לאחר הזריעה, לשטוף את התאים פעמיים עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 3 מיליליטר של טריפסין החם 0.05%-EDTA 0.02%, דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת התאים מפוזרת (בדרך כלל 5 דקות). לעכב פעילות טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של GCM, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 120 XG במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור astrocyte בFBS 90% - DMSO 10%, להעביר אותם לתוך cryovials (2 x 10 6 תאים לכל cryovial) ולאחסן בחנקן נוזלי. </li></ol> 2. בידוד של microvessels מוח החולדה הפרוצדורות שלנו מאושרות על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במרסיי ולעמוד בתקנות הלאומיות והאירופית (EU הוראת מס 86/609). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל של בעלי חיים ולצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל הכנה ולexperimente אחדr, השתמש 3 חולדות Wistar חמישה בשבוע ישנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שני של השבוע הראשון, להכין 2 צלוחיות T75 על ידי ציפוי עם סוג IV קולגן ופיברונקטין, הן במיקרוגרם / 1 סנטימטר 2 במי תרבות סטרילי (10 מיליליטר לT75). לאפשר לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עד זריעת דם קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוקר יום רביעי של השבוע הראשון, להרדים את החולדות תחת שטף גובר של CO 2 לגרום לנמנום, אובדן היציבה והפרעה בנשימה, לאחר מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. לרסס את הראשים עם 70% אתנול. חותכים את הראשים עם זוג מספריים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי יבשה תחת הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מהגולגולת בלי המוח הקטן ועצבי הראייה, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צלחת פטרי מקורר בקרח ומלא בחיץ לנתיחה קרה (HBSS השלים עם BSA 1%, 100 יחידות פניצילין / מיקרוגרם / מיליליטר 100 מיליליטר וסטרפטומיצין) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המוח במחצית להפריד את 2 אונות מוח ומוח תיכון נפרד לebrain. העבר forebrains לתוך צלחת פטרי נקייה על קרח עם חיץ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה חצאי המוח בצלחת פטרי חדשה עם חיץ לנתיחה קרה כדי להסיר את קרומי המוח בזהירות מforebrains תחת סטראו עם N ° 5 מלקחיים מעוקלים. לאחר מכן, לנקות את הפנים של המוח כדי להסיר את השמיכה של מיאלין ולקבל קליפה של קליפת המוח. צעדים אלה לא צריכים לקחת יותר משעה 2 לשימור רקמות והישרדות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הקליפה מ3 מוחות ל6 מיליליטר של חיץ לנתיחה קר ב7 מיליליטר dounce homogenizer ידי 10 למעלה ולמטה משיכות עם כל אחד מ2 עליים של סיווג שונה, 71 מיקרומטר ואחרי 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את ההשעיה כדי להשיג את המקבילה של קליפה 1 ב 1 מיליליטר של צינור 50 מיליליטר פלקון ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את ההשעיה מהקליפה 1 עם 1 מיליליטר של תמיסה אנזימטית המכילה תערובת של collagenases / dispase (R מיקרוגרם / מיליליטר 6011; 0.3 U / ml), סוג DNase אני (35 מיקרוגרם / מיליליטר - 20 K יחידות / מיליליטר) וגנטמיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) שבייקר ל30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את 1 מיליליטר לעכל מקליפה 1 עם 10 מיליליטר של BSA 25% / HBSS 1X ונפרד על ידי צנטריפוגה תלויה הצפיפות ב3,600 XG במשך 15 דקות ב RT. להעביר בזהירות את הדיסק העליון (parenchyma המיאלין והמוח) ואת supernatant לתוך צינור פלקון נקי 50 מיליליטר וחזור צנטריפוגה. שמור את הכדור וכתוצאה מכך המכיל microvessels המוח ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך בזהירות את הדיסק העליון ואת supernatant. Resuspend שני כדורים וכתוצאה מכך המכילים microvessels המוח עם 1 מיליליטר של קר HBSS 1X ולהעביר לתוך צינור פלקון נקי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את microvessels על ידי תוספת של 20 מיליליטר של קר HBSS 1X ו צנטריפוגות XG ב 1000 למשך 5 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד לעכל את microvessels מקליפה 1 עם 1 מיליליטר של הפתרון זהה האנזימטית כמתואר בשלב 2.9 בשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס בshאקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לערבב את microvessels מתעכל מכל אחת מ3 הקורטקס לתוך צינור אחד ולהפריד עוד יותר לשני 50 צינורות מיליליטר פלקון להשיג microvessels חולץ מן המקבילה של וחצי אחד (1.5) קליפת המוח לכל צינור. הוסף 30 מיליליטר של חיץ לנתיחה קרה ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור הדם הקטן ב10 מיליליטר של DMEM/F12 בתוספת סרום פלזמה עני 20% טסיות דם שור נגזר, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, 2 ng / ml), הפרין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וHEPES (2.5 מ&quot;מ), בשם מדיה תא האנדותל (ECM) בתוספת puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 צלוחיות T75 מצופים מן החממה, לשאוב את עודף הציפוי וצלחת microvessels מצינור אחד בבקבוק אחד T75 (microvessels מופק 1.5 קליפת המוח לכל בקבוק T75). </li></ol> 3. טיהור והפצתו של RBEC Primocultures <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור: יום רביעי עד שישי, להוסיף puromycin ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר לתקשורת והתרבות. לשנות את המדיום ביום חמישי. ביום שישי, לשטוף את התאים ולהוסיף puromycin ב2 מיקרוגרם / מיליליטר עד יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות: ביום שני של השבוע השני, לשטוף את התאים ולהוסיף אינסולין, transferrin ותוספת סלניום נתרן לתקשורת והתרבות ועד לתרבויות להגיע למפגש 90% ביום רביעי של השבוע השני. </li></ol> . 4 בידול: הגדרת המודל חוץ גופית BBB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום שני של השבוע השני, להכין מסננים (פוליאתילן, 12 בארות, גודל נקבובית 1.0 מיקרומטר) על ידי ציפוי בתערובת של סוג IV קולגן ופיברונקטין הן ב0.5μg/cm 2 במי תרבות סטרילי (500 μl של תערובת בתא העליון ו1.5 מיליליטר של מים סטריליים תרבות בתא התחתון). לאפשר לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עד זריעת RBEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום שני של השבוע השני, חמישה ימים לפני הקמתה של התרבות המשותפת, להפשיר את האסטרוציטים מcryovials על 37 מעלות צלזיוס והעברהבפלקון 15 מיליליטר עם 10 GCM מיליליטר. צנטריפוגה ההשעיה ב120 XG במשך 8 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור astrocyte בGCM וצלחת בצפיפות של 30 x 10 3 תאים לכל 2 סנטימטר ב12 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום רביעי של השבוע השני, ממש לפני הניתוק של RBEC עם טריפסין, לשטוף פעמיים את המסנן המצופה מראש עם מדיום DMEM/F12. טרום למלא את התאים עם ECM: 1.5 מיליליטר בתא התחתון ו0.5 מיליליטר בתא העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום רביעי של השבוע השני, לשטוף פעמיים RBEC עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 4 מיליליטר של טריפסין החם 0.05% - פתרון 0,02% EDTA ב 37 C ° לכל בקבוק T75 במהלך 30 שניות בדיוק. ואז להסיר 3.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין ולבחון מתחת למיקרוסקופ. כאשר שכבת התאים מתחילה להתנתק מהמטריצה, לעזור להם בעדינות על ידי הקשה על קצה בקבוק T75 עד שכל התאים צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיליליטר של ECM לכל בקבוק T75 ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. מאוד בעדינות לנתק את התאהשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 4 פעמים עם טפטפת 10 מיליליטר מצויד בקצה צהוב (למנוע את הייצור של בועות בפתרון). ספירת התאים בתרחיף (כ 3 x 10 6 cells/T75) ומייד צלחת על מסננים מראש מצופים ומילאו מראש בצפיפות גבוהה (160 x 10 3 תאים / מסנן ומכאן כ 18 filters/T75) (איור 8 ). למחרת (יום חמישי), לשנות פעמיים את המדיום של התא העליון כדי להסיר פסולת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום חמישי של השבוע השני, ביום שלפני הקמתה של התרבות המשותפת, להחליף את התקשורת ותרבות astrocyte ידי 1.5 מיליליטר של תקשורת בידול (ECM עם הידרוקורטיזון ב500 ננומטר), שניתן בתוספת 1/3 בינוניים מותנים מהתא הבסיסי של תרבות המשותפת קודם (3 ימים של קשר בין תאים והאסטרוציטים אנדותל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום שישי של השבוע השני מוגדר כהיום 0 בידול; להחליף את התקשורת והתרבות מconta המסנניםining RBEC עם תקשורת בידול. העבר את מסנני RBEC לתוך הבארות המכילות את האסטרוציטים. בתנאים אלה, במבחנה מודלים להבדיל ולבטא חלבונים הקשורים לצומת תוך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המודלים לשמור על הבידול האופטימלי שלהם במהלך 3 ימים נוספים, בין הימים שני ורביעי בשבוע השלישי. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

תרופות רבות שפותחו לטיפול במערכת עצבים מרכזית (CNS) הפרעות אינן יכולים להגיע למוח parenchyma בריכוזים רלוונטיים טיפולי. BBB מגן על רקמת עצבים במוח מהתנודות של הרכב פלזמה, מגורמים פתוגניים, ושומר על הומאוסטזיס של parenchyma המוח על ידי הגבלת שטף שאינו ספציפי של יונים, פפטידים, חלבונים ואף תאים לתוך ומחוץ למוח 1. מאפייני BBB מושרים ומתוחזק על ידי קירבה אינטימית ולדבר צולב בין התאים בכיתה מיוחדת microvessel המוח אנדותל והאלמנטים השכנים של יחידת נוירו, גליה וכלי הדם (NGVU) כגון תאי עצב, תאי גליה (לייתר דיוק astrocyte קצה רגליים), וpericytes ensheathed בקרום הבסיס שמורכב בעיקר מסוג IV קולגן, פיברונקטין, laminin וproteoglycans 2,3. Pericytes מכסה כ 22-32% מהאנדותל ברמת הנימים ולשחק חשובתפקיד בוויסות של התפשטות האנדותל, אנגיוגנזה ותהליכים דלקתיים. תאי האנדותל יוצרים גיליון רציף המכסה את פני השטח הפנימיים של נימי הדם. הם מחוברים ביניהם על ידי TJS, אשר יוצר מבנה דמוי חגורה באזור הפסגה ושתורם לתא קיטוב. האסטרוציטים מווסתים את מאפייני BBB ומקורות של גורמים רגולטוריים חשובים כגון TGF-β, GDNF, bFGF ו-IL-6. האסטרוציטים חסרים בGFAP עם פונקציונליות שלמה אינם מסוגלים לווסת את מאפייני BBB 4. הנוירונים לא ישירות מעורבים מבני במבנה של BBB, אלא גם להסדיר היבטים חשובים של ביטוי חלבון ופונקציות BBB 5. על מנת ללמוד את המבנה, הפיסיולוגיה ופתולוגיה של BBB נוסף, במבחנה מודלים של BBB פותחו ככלי מחקר. תאי האנדותל במוח כבר חולצו ממינים שונים ליישום בדגמי BBB מבחנה מבוססבתרבויות נמוכות מעבר עיקרי מ6,7 שור, חזיריים 8,9, עכברוש 10,11,12, עכבר 13 וגם 14,15 האנושי. דגמים אלה ידועים לחקות את in vivo BBB, במיוחד כאשר שיתוף תרבותי עם תאי גלייה מחולדה או עכברי ו / או pericytes 16,12, ו / או האסטרוציטים שמקורן בתאי אב עצביים 17 ו / או נוירונים 18. הדגמים &quot;במעבדה&quot; לעתים קרובות מיוצרים ממכרסמים משום שהם מאפשרים במבחנה / in vivo ניסויים והשוואות ו / או המחקר של תאי האנדותל במוח המופקים ממודלים מהונדסים 19. חדש שפותח במודלים של BBB מבחנה גם תוכנן כדי לעזור לנבא ספיגה במוח של תרופות פוטנציאליות במערכת העצבים המרכזית לפני בדיקת in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. במבחנה מודלים BBB משמשים בדרך כלל כדי להשוות ההובלה של תרופות עם: i) חדירה ידועה לתוך מערכת העצבים המרכזית או עם low חדירות פני BBB וללא תופעות מרכזיות, וii) Pe לכאורה של אותן התרופות שנמדדו במודלים של בעלי חיים מאותו המין. התרופות שעוברות בקלות BBB הן בעיקר lipophilic ולחצות את קרום תא אנדותל המוח על ידי תיווך שומנים דיפוזיה חופשית (קפאין, קרבמזפין, וכו &#39;). התרופות מועברים באופן שלילי כגון דיגוקסין, verapamil או ציקלוספורין נמתחים באופן פעיל על ידי מובילים בזרימת אנדותל המוח כגון P-GP. עם זאת, רבים של המולקולות הטיפוליות החדש שפותחו הם תרופות ביולוגיות, כגון חלבונים רקומביננטיים, siRNAs או נוגדנים חד שבטיים. רובם לא לחצות את BBB עקב: א) היעדרות של מובילים מסוימים, וii) השכבה צפופה של תאי האנדותל, המונעים מולקולות במשקל מולקולריות גבוהות מעובר מעבר paracellular. במגבלות אלה, אסטרטגיות &quot;סוס טרויאני&quot; יושמו באמצעות וקטורים (נוגדנים, פפטידים) נגד קולטנים ידועים בBBB, מעורב in קולטן בתיווך תחבורה או transcytosis (RMT), כגון transferrin קולט (TF) (TFR), קולטן האינסולין (IR), או חברים של הקולטן ה-LDL (LDLR) הקשורים למשפחת קולט (LDLR, LRP1). קולטנים כאלה נמצאו בנימים במוח מבודדות ובBBB in vivo 24,25. פרופילי תעתיק לקולטנים אלה, ובמיוחד אלה של משפחת LDLR, נותחו והשוואה בין תאי מוח אנדותל ותאי האנדותל במוח שיתוף תרבותי עם האסטרוציטים או בנימי דם במוח מייד לאחר חילוצם מהמוח 26. 24 Pardridge פתח את השדה עם נוגדן OX-26 נגד קולט transferrin (TFR), ואחריו נוגדנים כנגד קולטן האינסולין והקולטן לגורם צמיחת אינסולין 27,28. עם וקטורי נוגדנים מבוססים אלה, ArmaGen טכנולוגיות פיתחה פלטפורמה טכנולוגית סוס טרויאני BBB מולקולרי, כדי לספק תרופות, כוללים חלבונים, מעבר לBBB 29.הספרות עשירה בנתונים המראים ביטוי LRP1 בתאי האנדותל במוח ואת תפקידה כקולט endocytic / נבלות רבות עוצמה. ניתוח כתם מערבי הציע כי LRP1 מתבטא בשברים מועשרים בנימים במוח ובתאי אנדותל נימים במוח חולדה 30. חברות כמו LRP1 יעד Angiochem עם וקטורי פפטיד נגזרו aprotinin המקדמים זרם תרופה יעיל על פני BBB ביום 31. עם זאת, LRP1 מעורב גם בהובלה פעילה של Aβ והזרימה / פינויה מparenchyma המוח לדם 32. נתונים אלה כוללים LRP1 בתחבורה דו כיוונית על פני BBB בהתאם ligands שלה. biOasis מפתחת טכנולוגית Transcend באמצעות melanotransferrin חלבון להובלת ביולוגי כגון אנזימי lysosomal ונוגדנים פני BBB 33 תוך Vect-הורוס מפתחת וקטורי פפטיד כי יעד LDLR 34. הנתונים מצביעים על כך שיש LRP וLDLR יכולים לשמש להובלת הבדלמולקולות erent כגון אנזימי lysosomal 35,36 או מתחמי nanoparticle פני BBB 37. תחום העניין שלנו הוא אספקת סמים למערכת העצבים המרכזית באמצעות מולקולות וקטור וסמי מועמדי vectorized לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית. בפרט, משלוח סמים ברחבי BBB יש לשקול בהקשר של neuroinflammation, תהליך שעשויה להשתנות במידה שלה, אבל זה כנראה משותף לכל נגעים במערכת העצבים המרכזית ומחלות, כולל דלקת קרום המוח, טרשת נפוצה, מחלת אלצהיימר ועוד neuroinflammation קשור עם דלקת BBB ואפשרות לשינויים בפיזיולוגיה של BBB וחדירות בהתחשב בכך שparacellular והתחבורה transcellular יכולים להיות מוגברת במצבים פתולוגיים 38,39,40,41,42,43. למשל, TNF-α, לצבוט, וציטוקינים אחרים לווסת את הדלקת, וניסויים במבחנת מודלים BBB הראו כי הם יכולים לשנות את המאפיינים של ה paracellularדואר monolayer אנדותל תא 38,39,40 וכי TNF-α מובילים גם לעלייה בתחבורה transcellular של LDL 41, holotransferrin 42 ולקטופרין 43. המטרה שלנו הייתה לפתח ולאפיין מותאם ומודל BBB syngeneic עכברוש מאוד לשחזור באמצעות שיתוף תרבויות של תאים ראשוניים במוח אנדותל והאסטרוציטים. אנחנו השתמשנו חולדות Wistar 5 בן שבוע ויילודים לייצור תאי אנדותל במוח וייצור astrocyte בהתאמה. אתגר אחד היה להקים פרוטוקול המאפשר הייצור של דגמי BBB &quot;שבועי לשחזור&quot;. כדי להגיע למטרה זו, בכל שלב של פרוטוקול הייצור בוצע בימים קבועים בשבוע, החל מייצור דם קטן במוח ביום רביעי של השבוע הראשון. ניתוחים בוצעו כמעט בכל שבוע במהלך 3 השנים האחרונות. כדי לשפר את שחזור של התרבויות נוספות, מערכת אבטחת איכות הוקמה. כל reagents וכימיקלים היו בהפניה במסד נתונים (מועד כניסתו, מניות, לטווח תפוגה, וכו &#39;). המודל התאפיין הבא במספר הקריטריונים, כגון ארגון תא האנדותל ובטהרה, Teer, חדירות LY, בתגובה לסוכנים פרו דלקתיים, ביטוי איכותי וכמותית של חלבוני TJ, פונקציונלי של מובילים בזרימת כגון P-GP, וקולטנים מעורב בtranscytosis ברחבי monolayer התא האנדותל כגון TFR או LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

מחסום דם המוח (BBB) ​​במיוחד מסדיר שטף מולקולרי ותאי בין הדם ורקמת העצבים. המטרה שלנו הייתה לפתח ולאפיין syngeneic חולדה לשחזור מאוד במודל חוץ גופית של BBB באמצעות שיתוף תרבויות של תאים ראשוניים עכברוש אנדותל המוח (RBEC) והאסטרוציטים ללמוד הקולטנים מעורבים בtranscytosis ברחבי monolayer התא האנדותל. האסטרוציטים בודדו על ידי נתיחה מכאנית הבאה עיכול טריפסין והוקפאו לתרבות משותפת מאוחר יותר. RBEC בודדו מקליפת מוח חולדה 5 שבועות בן. המוחות נוקו של קרומי המוח וחומר לבן, ומכאני ניתקו הבא עיכול אנזימטי. לאחר מכן, homogenate הרקמה היה centrifuged באלבומין בסרום שור להפריד ברי כלי מרקמת עצבים. שברי הכלי עברו עיכול אנזימטי שני לתאי האנדותל חופשיים מהמטריצה ​​תאית שלהם. תאים מזהמים שנותרו כגון pericytes היו further בוטל על ידי ציפוי שברי הדם הקטן במדיום המכיל puromycin. לאחר מכן הם היו passaged על מסננים לתרבות משותפת עם האסטרוציטים גדלו על החלק התחתון של הבארות. RBEC הביע רמות גבוהות של צומת הדוקה (TJ) חלבונים כגון occludin, claudin-5 והסתדרות ציונית-1 עם לוקליזציה טיפוסית בגבולות התא. התנגדות transendothelial החשמלית (Teer) של monolayers אנדותל במוח, המציינת את אטימות של TJS הגיעה 300 אוהם · 2 סנטימטר בממוצע. מקדמי החדירות האנדותל (PE) לוציפר הצהוב (LY) היו לשעתקו מאוד עם ממוצע של x 0.26 ± 0.11 10 -3 סנטימטר / דקה. תאי האנדותל במוח מאורגנים בmonolayers הביעו P-גליקופרוטאין בזרימת טרנספורטר (P-gp), הראו תחבורה מקוטבת של rhodamine 123, ליגנד עבור P-GP, והראו תחבורה ספציפית של transferrin-Cy3 וDiILDL ברחבי monolayer התא האנדותל. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול להקמה במבחנהמודל BBB שהוא שחזור מאוד בשל שיטות אבטחת האיכות, וכי הוא מתאים למחקר על מובילי BBB וקולטנים.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MRI-מודרך שיבוש של מחסום דם מוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד Transcranial מודל עכברים

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

מודל עכברים של שיבוש מחסום דם מוח כדי לאפשר ממוקד Therapeutics Neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

פציעת בלון עכברוש ראש דגם כדי לבדוק Therapeutics שיפוץ אנטי-וסקולרית

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...