Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Økonomisk støtte til Vect-HORUS er erkjent fra Fonds Unik Interministériel (FUI / MEDUL prosjekt) og til Vect-HORUS og UMR7259 laboratorium fra Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, Adhoc og PREVENTAD samarbeidsprosjekter) . Den UMR7259 laboratoriet erkjenner også økonomisk støtte fra CNRS og fra Aix-Marseille Université.

1. Produksjon av Rat Astrocytes For hver forberedelse bruke 10 nyfødte Wistar rotter av begge kjønn. <ol><li> Sacrifice rottene ved å kutte hoder med en saks og overføre dem umiddelbart i en tørr petriskål under en laminær hette. Fjern hjernene fra skallen uten cerebellum og overføre dem umiddelbart inn i en petriskål inneholdende kald disseksjon buffer: HBSS supplert med 1% bovint serumalbumin (lavt nivå av endotoksin BSA), penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml. </li><li> Skjær hjernen i to, for å skille de to hjernehalvkuler og overføre dem til en ren petriskål med disseksjon buffer på is. Skjær synsnerven og fjerne hjernehinnene under et stereomikroskop. </li><li> Vask de kortikale deler omfattende i 50 ml kald buffer disseksjon. </li><li> Plasser de kortikale stykker fra tre hjerner til en 15 ml Falcon rør og distansere ved pipettering opp og ned et kupple ganger med en 10 ml engangspipette utstyrt med et blått spiss inn i 6 ml av 0,05% trypsin - EDTA 0,02% i 5 min ved 37 ° C. </li><li> Til 24 ml av DMEM supplert med 10% FBS og følgende antibiotika, penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml, en media heter glial cellemedium (GCM) og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter ved RT. FBS grupper ble valgt ut og validert for vekst og overlevelse av astrocyte cutures. </li><li> Resuspender pelleten inneholdende de dissosierte cellene i 10 ml GCM og plate i en 75 cm to-T-kolbe (T75). Endre medium dagen etter for å fjerne celleavfall og DNA. Sett på kultur media to ganger i uken. </li><li> Etter en uke med spredning, rister forsiktig på gliacellene med en orbital shaker på 60 rpm i løpet av 24 timer ved 37 ° C i GCM. Hvis T75 ikke kan plasseres i en inkubator med 5% CO 2/95% luft ved 37 ° C fuktet atmosfære, supplere media med 5 mM HEPES. Vask cellene to ganger for å rEDra ikke-adherente mikrogliale celler. </li><li> Tre uker etter såing, vaskes cellene to ganger med DPBS uten kalsium og magnesium. Tilsett 3 ml varm 0,05% trypsin-EDTA 0,02%, inkuberes ved 37 ° C og vente til cellelaget er dispergert (vanligvis 5 minutter). Hemme trypsin-aktivitet ved tilsetning av 10 ml av GCM, overføre cellesuspensjonen til en 15 ml Falcon rør og sentrifuger ved 120 x g i 8 min. </li><li> Resuspender astrocyte pellet i 90% FBS - 10% DMSO, overføre dem til cryovials (2 x 10 6 celler per cryovial) og lagrer i flytende nitrogen. </li></ol> 2. Isolering av rottehjerne microvessels Våre eksperimentelle prosedyrer er godkjent av etikkomiteen ved det medisinske fakultet Marseille og i samsvar med nasjonale og europeiske bestemmelser (EUs direktiv nr. 86/609). Alle forsøk ble gjort for å minimalisere dyret lidelser og reduserer antall dyr benyttet. <ol><li> For hver forberedelse og for ett Experimenter, bruker tre fem uker gamle Wistar rotter. </li><li> Mandag av den første uken, klar 2 T75-kolber ved å belegge med kollagen type IV og fibronektin, både på 1 mikrogram / ​​cm 2 i sterilt kulturvann (10 ml pr T75). Tillat å følge ved 37 ° C før microvessel seeding. </li><li> Onsdag morgen av den første uken, avlive rottene under en økende strøm av CO 2 for å fremkalle søvnighet, tap av kroppsholdning og pusteavbrudd, deretter fulgt av en halshugging. Spray hodene med 70% etanol. Skjær hodene med en saks og overføre dem til en tørr petriskål under en laminær hette. </li><li> Fjern hjernene fra skallen uten cerebellum og de optiske nerver og deretter overføre dem til en petriskål avkjølt på is og fylt med kaldt disseksjon buffer (HBSS supplert med 1% BSA, penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml) . </li><li> Skjær hjernen i to for å skille de to hjernehalvkuler og separat midthjernen fra forebrain. Overfør forebrains i en ren petriskål på isen med disseksjon buffer. </li><li> Ta et par halvkuler i en ny petriskål med kaldt disseksjon buffer for å forsiktig fjerne hjernehinnene fra forebrains under et stereomikroskop med N ° 5 buede tang. Deretter rengjøre innsiden av hjernen for å fjerne dyne av myelin og få et skall av cortex. Disse trinnene bør ikke ta mer enn to timer for vev bevaring og celle overlevelse. </li><li> Dissosiere cortex fra 3 hjerner i 6 ml kald disseksjon buffer i et 7 ml Douce-homogenisator med 10 slag opp og ned med hver av to pestles av forskjellige klaringer, 71 mikrometer, etterfulgt av 20 mikrometer. </li><li> Fordel suspensjonen for å oppnå den tilsvarende 1 cortex i 1 ml av en 50 ml Falcon rør og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved RT. Kast supernatanten. </li><li> Fordøy suspensjonen fra en cortex med 1 ml av en enzymoppløsning inneholdende en blanding av kollagenaser / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase type I (35 mg / ml - 20 K enheter / ml) og gentamicin (50 pg / ml) i en ristemaskin i 30 min ved 37 ° C. </li><li> Bland 1 ml fordøye fra en cortex med 10 ml 25% BSA / HBSS 1X og atskilt ved tetthetsavhengig sentrifugering ved 3600 xg i 15 min ved RT. Overføre forsiktig det øvre skiven (myelin og hjernen parenchyma) og supernatanten til et rent 50 ml Falcon rør og gjenta sentrifugering. Hold den resulterende pellet inneholdende hjerne microvessels ved 4 ° C. </li><li> Forkaste nøye øvre disken og supernatanten. Resuspender begge resulterende pellets inneholdhjerne microvessels med 1 ml kald HBSS 1X og overfør til et rent 50 ml Falcon-røret. </li><li> Vask microvessels ved tilsetning av 20 ml kald HBSS 1X og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min. Kast supernatanten. </li><li> Ytterligere fordøye microvessels fra en cortex med 1 ml av den samme enzymatiske løsning som er beskrevet i trinn 2,9 i løpet av 1 time ved 37 ° C i en shaker. </li><li> Deretter blandes de fordøyde microvessels fra hver av de tre cortices i ett rør og videre dele opp i to 50 ml Falcon-rør for å oppnå microvessels trukket ut fra tilsvarende ett og et halvt (1.5) cortex per rør. Tilsett 30 ml kald buffer disseksjon og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved RT. </li><li> Resuspender microvessel pelleten i 10 ml DMEM/F12 supplert med 20% bovint blodplatefattig plasma-avledet serum, basic fibroblast vekstfaktor (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 ug / ml), gentamicin (50 pg / ml) og HEPES (2,5 mM), oppkalt endotelial cellemateriale (ECM) supplert med puromycin ved 4 ug / ml. </li><li> Ta de to belagte T75 kolber fra inkubatoren, aspirer overkant av belegg og plate microvessels fra hvert rør i en T75 kolbe (microvessels utvunnet fra 1,5 cortex per T75 kolbe). </li></ol> Tre. Rensing og spredning av RBEC Primocultures <ol><li> Rensing: Onsdag til fredag, legge puromycin ved 4 ug / ml i kulturmediene. Endre medium på torsdag. På fredag, vaske cellene og legge puromycin på 2 mikrogram / ml før mandag. </li><li> Spredning: på mandag av den andre uken, vaske cellene og legge insulin, transferrin og natriumselenitt supplement til kultur media før de kulturene nå 90% samløpet på onsdag av den andre uken. </li></ol> . 4 Differensiering: Sette opp In Vitro BBB Model <ol><li> Mandag av den andre uken, klar filtre (polyetylen, 12 brønner, porestørrelse 1,0 mm) ved å belegge med en blanding av kollagen type IV og fibronektin både ved 0.5μg/cm 2 i sterilt kulturvann (500 mL av blandingen i det øvre kammer og 1,5 ml sterilt kulturvann i det nedre kammer). Tillat å følge ved 37 ° C før RBEC seeding. </li><li> Mandag av den andre uken, fem dager før etableringen av co-kultur, tine astrocytter fra cryovials ved 37 ° C og overføringi en 15 ml Falcon med 10 ml GCM. Sentrifuger suspensjonen ved 120 x g i 8 min ved RT. </li><li> Resuspender pellet i astrocyte GCM og plate ved en tetthet på 30 x 10 3 celler per cm2 i 12-brønns plater. </li><li> Onsdag av den andre uken, like før dissosiasjon av RBEC med trypsin, vaskes to ganger det forhåndsbelagt filter med DMEM/F12 medium. Pre-fylle kamrene med ECM: 1,5 ml i det nedre rom og 0,5 ml i det øvre kammer. </li><li> Onsdag av den andre uken, vask to ganger i RBEC med DPBS uten kalsium og magnesium. Tilsett 4 ml varmt trypsin 0,05% - 0,02% EDTA-løsning ved 37 ° C pr T75 kolbe i løpet av 30 sek nøyaktig. Deretter fjernes 3,5 ml av trypsin-løsning og observere under mikroskopet. Når celleskiktet begynner å løsne fra matrisen, hjelpe dem ved å banke forsiktig på kanten av T75 kolbe inntil alle celler er flytende. </li><li> Legg 9 ml ECM per T75 kolbe og overfør til en 15 ml Falcon rør. Veldig forsiktig distansere cellensuspensjonen ved å pipettere opp og ned fire ganger med en 10 ml pipette utstyrt med en gul spiss (unngå produksjon av bobler i løsningen). Tell cellene i suspensjonen (ca. 3 x 10 6 cells/T75) og umiddelbart plate på pre-belagte og ferdigfylte filtre ved en høy tetthet (160 x 10 tre celler / filter derav ca 18 filters/T75) (figur 8 ). Den følgende dag (torsdag), endrer det dobbelte av mediet i det øvre kammeret for å fjerne celleavfall. </li><li> Torsdag av den andre uken, dagen før etableringen av co-kulturen, erstatte astrocyte kultur media med 1,5 ml av differensiering media (ECM med hydrokortison på 500 nM) som kan bli supplert med 1/3 aircondition medium fra basal rommet av en tidligere co-kultur (3 dager for kontakt mellom endotelceller og astrocytter). </li><li> Fredag ​​av den andre uken er definert som dag 0 av differensiering; erstatte kultur media fra filtre Containing den RBEC med differensiering media. Overfør RBEC filtre i brønnene inneholder astrocytter. Under disse forholdene, in vitro-modeller differensiere og uttrykke koblingsrelaterte proteiner innen tre dager. </li><li> Modellene holde optimal differensiering i løpet av tre dager, mellom mandag og onsdag i den tredje uken. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Vi beskriver gjennomføringen av et ukentlig reproduserbar protokoll for isolering og plating av hjerne microvessels, etter rensing og kultur av RBEC og videre etablering av co-kulturer med primære rotte astrocytter å generere en in vitro BBB modell med karakteristiske BBB egenskaper. Vellykket etablere standardisert in vitro BBB kulturer krever optimale forhold i de flere etterfølgende trinn i prosessen. Modellen var (a) optimalisert for å få lavest paracellular permeabilitet, som fortsatt er den &quot;hellige gral&quot; av in vitro BBB modeller, og (b) validert for effluks og RMT mekanismer. Produksjon, Rensing og spredning av RBEC Den største utfordringen når dyrke RBEC er å oppnå reproduserbarhet mellom ulike kulturer. Standardisering av protokollen krever høy kvalitet verktøy for disseksjon, høy kvalitet reagenser og respekt reagenser utløpsdatoer. Eksperimentator må være dyktige i mikro-disseksjon henhold stereo for rask fjerning av hjernehinnene og store fartøyer fra cortex overflaten. Når hjerner er isolert og mekanisk dissosiert, en av de største utfordringene er den optimale enzymatiske fordøyelse av de nylig isolerte hjerne microvessels. Den typen og kvaliteten på de enzymene som brukes er avgjørende. En blanding av kollagenaser av type I og II, og dispase ved høy konsentrasjon og en lav variasjon mellom batcher ble brukt. Også viktig er varigheten av den enzymatiske fordøyelse og forholdet mellom enzym-konsentrasjon / vev vekt / volum av fordøyelsen. Det beste utbytte av hjernen microvessel produksjon ble oppnådd med tilsvarende kortekser fra en hjerne i 1 ml kollagenaser / dispase blande 60 ug / ml i begge digereringer, henholdsvis 30 minutter og 1 time. Også kritisk er eliminering av forurensende celles (astrocytes og hovedsakelig pericytes). Disse celler sprer ved høyere hastighet enn endotelceller og ikke etablere tett veikryss med sistnevnte, og dermed hindrer etablering av en homogen cellemonosjikt med god paracellular restrictiveness. Med tanke på at hjerne endotel-celler uttrykker mye høyere nivåer av efflux pumper, spesielt P-gp, sammenlignet med de andre celletyper som finnes i microvessels, de tåler bedre de ellers toksiske konsentrasjoner av P-gp ligand medikamenter, mens ikke-endotelceller er eliminert. Puromycin behandling på 4 mikrogram / ml for de første to dagene ble etterfulgt av to dager ved 2 ug / ml for å oppnå god endotelcelle renhet. Dette utvalget kan også favorisere kapillære endotelceller versus de fra venules, pre-kapillære arterioler eller større microvessels, og føre til strammere monolayers. I tillegg er bruken av fattig plasma-avledet bovint serum absolutt nødvendige for å oppnå rene kulturer av endotelceller 47,48. Plasma-derived serum mangler blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), som er mitogent for fibroblaster, for glatte muskelceller, og derfor til pericytes. Vi har observert at behandlingen av plast og filtre med en blanding av kollagen type IV fra mus og human fibronectin gir en betydelig fordel, med en 2-gangers økning i proliferasjon utbytte i sammenligning med den tradisjonelle anbefalte kollagen type I fra rottehale. Viktige signaler for celleproliferasjon er gitt av den ekstracellulære matriks som integrin-og vekstfaktor (bFGF) aktivering 49.. Buffer-konsentrasjon og pH-verdien i dyrkningsmedium, er beskrevet å virke positivt på paracellular tetthet 50 og vi har observert en bedre reproduserbarhet mellom kulturer med tillegg av HEPES-buffer ved 5 mM. Differensiering av RBEC: Co-kultur Establishment Sett Filters Når hjernen endotelceller har been renset og har proliferated i 6 dager, kan de bli sådd ut på filtere. Cell plettering ved høy tetthet er kritisk for å oppnå en perfekt monolag. En seeding tetthet på 160x10 tre celler per 12 brønn plate filtre var nødvendig og tilstrekkelig for å oppnå et konfluent monolag 24 timer etter tilsetningen. Imidlertid isolering av primære hjerne kapillær endotel celler fra deres miljø er et paradoks i konstruksjonen av en BBB in vitro-modell slik det er kjent at primære celler, og spesielt hjernekapillære endotelceller, er sterkt regulert av deres miljø og induktive faktorer produsert av de forskjellige omliggende celletyper. Brain kapillære endotelceller dyrket alene raskt de-differentiate og miste noen spesifikke hjerne endothelial markører. Således bør primære endotelceller brukes ved lav passasje (P1) og re-koplet, i det minste delvis, med sine omgivelser ved ko-kultur med astrocytter eller medium betinget av astrocytter 47,51. Dette gjeldersant for astrocyte differensiering som hjernen endotelceller og astrocytter er involvert i to-veis induksjon. Dyrking RBEC med astrocytter førte til sterk induksjon av interendothelial TJ 52,23. De molekylære mekanismene for re-induksjon fortsatt i stor grad ukjent, og forskning pågår i flere laboratorier for å identifisere spesifikke stimulerende faktorer utskilt av astrocytter, som kan fremme optimal endothelial celledifferensiering 53,54. Faktorer utskilt av hjerne endotelceller inkludert leukemi-inhiberende faktor (LIF) er blitt vist å indusere differensiering astrocytic 55,56. Før co-kultur etablering, ble astrocytter utsatt for differensiering medium som inneholder glukokortikoid reseptor agonist hydrokortison, og co-kultur betinget medium. Hydrokortison er kjent for å forbedre tettheten av hjerne endotel-celler og brukes i BBB modeller spesielt fra rotte 57 og muse 58,59 endotelceller. Den betingede medium samles opp fra det nedre rom av endotelcelle / astrocyte ko-kultur-system etter 3 dager, og frosset for senere bruk. Bruken av ko-kultur kondisjonerte medium reduseres tiden for endotelial celledifferensiering til 3 dager med optimal paracellular permeabilitet i 2 dager, og også forbedret reproduserbarhet mellom kulturer. Totalt sett protokollen vi beskriver gir en reproduserbar Teer over 300 ohm · cm 2 og en gjennomsnittlig paracellular permeabilitetskoeffisient Pe (LY) på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, lik de beste primære cellebasert BBB modellene 22, 12. Protokollen beskriver vi i den foreliggende manuskript med den foreslåtte modulering av microvessel enzymatisk fordøyelse kan utvides til endotelceller fra rotteryggmarg 60 og fra mus i hjernen. Molekylær og funksjonell karakterisering I tilleggi TJ induksjon, astrocytter bidrar også til uttrykk av effluks-transportører som P-gp i hjernen endotelceller 61. Vi har faktisk viser ekspresjon av effluks transportør-P-gp i BBB-modellen og demonstrerer vi polariteten av P-gp efflukspumpe lokalisering ved hjelp av biokjemiske metoder, og av P-gp-aktivitet ved bruk av en funksjonell analyse. GLT-1 uttrykk ble oppdaget i basalmembranen brøkdel av microvessels men ble ikke oppdaget i kultivert RBEC. Vi hypotese at GLT-en ble nedregulert i vår RBEC kultur i sammenligning med in vivo-forhold og dermed ikke oppdages ved Western blot analyse. Overskudd av glutamat er nevrotoksisk og in vivo, er GLT-1 er ansvarlig for glutamat-utstrømning fra den basale rommet (parenchyma) til den apikale rommet (blodsirkulasjonen). I astrocyte kulturer forblir GLT-1-ekspresjon svært lav, og induseres ved tilsetning av glutamat i mediet 62,63. Vi har også confIRM uttrykk for tilstrømningen transportører på den apikale membran som LRP1, LDLR og TfR. Funksjonalitet av TfR og LDLR ble demonstrert med binding og transport eksperimenter av Tf-Cy3 og DiLDL fra luminal til abluminal side av monolaget som tidligere vist med en storfe in vitro BBB modell 64. Interessant nok har det vist seg at lipid kravet fra astrocytter øker ekspresjonen av LDLR på hjerne kapillær endotel celler 65,66 ytterligere bekrefter den fysiologiske krysstale mellom astrocytter og hjerne endotel celler, inklusive in vitro. Vi har valgt å eksemplifisere transport med fluorescerende fargestoffer f.eks som Cy3 og DII med tanke på at spectrofluorimetric analyse er tilgjengelig i de fleste laboratorier, og kan vise seg nyttig å validere in vitro BBB-modeller. Imidlertid er kvantifisering av fluorescens langt mindre følsom enn radioaktiviteten, og krever en økning i antall eksperimenter for å oppnå signifikante data.Ideelt sett Tf og LDL er vanligvis radiomerket (Jod 125) for slike bindende / opptak og transport eksperimenter. Vi viser også at den differensierte endothelial cellemonolag oppnådd med den foreslåtte protokollen reagerer på betennelse indusert av TNF-α, som avslørt av CCL2 utgivelse og BBB åpning. CCL2 (MCP-1) og dens reseptor CCR2 er involvert i CNS-sykdommer slik som multippel sklerose, eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) 67, CNS traume 68 og er kjent som mediatorer av leukocytt-migrering inn i CNS etter neuroinflammatory betingelser 69,70. Med testet protokollen, kan vi ikke konkludere på en polarisert sekresjon av CCL2 fordi BBB åpning gjør at CCL2 konsentrasjon for å stabilisere seg mellom både øvre (apikale) og nedre (basal) avdelinger. Derfor vi tydelig undervurdere hvor mye CCL2 produsert av RBEC i den apikale rommet på 24-timers (figur 5A). Generelt Oversikt og begrensninger av BBB In Vitro modeller: I n Vivo versus In Vitro og Rodent versus menneske Sammenligninger Mange lovende CNS stoffer som viste seg å være effektive i BBB passasje in vitro mislyktes i kliniske studier på grunn av mangel på forutsigbarhet fra in vitro-modeller BBB ofte basert på celler isolert fra andre arter enn mennesker. Så langt vi kjenner til, er in vitro BBB modeller er trolig mer intelligent når det gjelder å studere mekanistiske aspekter ved protein nettverk, signaltransduksjon, transportører og reseptorer. Hver mekanisme, gangsti eller mål å bli studert in vitro må karakteriseres for sin regulering av komplementære miljømessige signaler (andre celletyper, kjemikalier, proteiner) og kombinert til in situ studier med samme dyreart, Og når det er mulig, med microvessels og endotelceller isolert fra mennesker, med de restriksjoner og forsiktighet fremkalt under. In vitro BBB modellene har å bli sett på som autonome systemer, isolert fra kroppen regulering, men fortsatt utrustet med store in vivo egenskaper og et potensial for regulering av miljø-signaler. Ingen &quot;ideal&quot; in vitro BBB-modellen har vært foreslått enda 71,72,73 fordi endotelcelle-monolag mangler en rekke viktige bestanddeler av neuro-glia vaskulær enhet (NGVU) og er isolert fra blod-og organ-regulering. Mangelen på pericytes 74,16 eller nevroner 17,18 eller de forskjellige bestanddeler av den ekstracellulære matriks anvendes for plastbelegg eller kulturmediet og serum som brukes for cellevekst i de mest vanlige og &quot;letteste laget&quot; in vitro BBB-modeller basert på endotelial cellene differensiert med astrocytter kan modulere protein uttrykk in sammenligning med in vivo situasjonen 75. Disse modellene kan uttrykke mange transportører som vises in vivo, men ikke alle. I noen tilfeller ble transportparametere først bekreftet i isolerte microvessels (nærmest in vivo situasjon), og deretter studert i cellekultursystemer 76,61. Molekylærbiologi forskning har tillatt karakterisering av gen-og protein uttrykk i isolerte microvessels og lave passasje endothelial cellekulturer fra samme art og mellom ulike arter, oftest fra små dyr som gnagere (mus og rotter) eller fra ku og gris i forhold til mennesker 77,78,75,15. Transcriptomic sammenligning mellom in vivo og in vitro hjernen mikrovaskulære endotelceller viste tallrike gentranskriptene som ble differensielt uttrykte og oftest betydelig downregulated in vitro. Transkripsjoner som koder tilstrømningen transportører som TfR og proteins innblandet i vesikkel menneskehandel er i hovedsak downregulated i dyrkede hjerne endotelceller, som tyder på en generell nedgang i endocytose og vesikulært transport i slike celler. Kultur manipulasjon i form av renhet (puromycin behandling) og behandling med hydrokortison kan bidra til å gjenopprette en mer &quot;in vivo-lignende&quot; genuttrykk profil 77. Transcriptomic studier avdekket også viktige forskjeller mellom arter som ytterligere komplisere spådommer om narkotika opptak hos mennesker basert på gnager i vitro BBB modeller 75. In vitro BBB modeller som involverer co-kultur av humane endotelceller og astrocytter har blitt beskrevet 15. Selv om relevant, disse modellene er mer vanskelig å gjennomføre på en jevnlig basis som de krever regulert tilgang til post-mortem menneskelig vev, og det er heterogenitet i kvalitet / egenskaper av den menneskelige hjerne endotelceller avhengig av alder, sykdommer, og eventuelt medisinsk treatment av givere. Innsatsen må gjøres for å utvikle nye in vitro-modeller som bedre gjengi den fysiologiske, anatomiske og funksjonelle egenskaper ved in vivo BBB. Co-kulturer som involverer tre celletyper er svært restriktive og synes vanskelig å gjennomføre rutinemessig. Til dags dato, de mest komplekse in vitro BBB-modellene er de dynamiske in vitro modeller (DIV-BBB) som inkluderer fartøy lignende organisasjon med astrocytter og inkluderer en strøm av medium som etterligner blodstrømmen 75,79,80,81,82, 83,84,85. Når cerebrale endotelceller blir utsatt for en strøm, den genererte skjærspenningen aktiverer mechanotransducers på celleoverflaten, som modulerer ekspresjonen av forskjellige gener som er involvert i endotelial cellefysiologi, for eksempel celledeling, differensiering, migrasjon og apoptose 80. In vivo, skjærspenning generert av blodstrømmen er ansvarlig for mitotisk stopp i cellekontakt, som tillater opprettelse av enendothelial cellemonolag i blodkar 80. Genomisk og proteomikk analyser av normale menneskelige hjerne mikrovaskulær endotelceller viste virkningen av skjærspenning i BBB endothelial fysiologi 84. Skjærspenning er ansvarlig for celle overlevelse, en høyere grad av endotelceller vedheft, efflukspumpe induksjon og bedre polarisering av transportører 75, regulering av glukosemetabolismen 75,86, oksidasjon mediert av CYP450-enzymer 75 og regulering av paracellular permeabilitet ved å øke uttrykket av gener som koder for intercellulær junctional elementer som occludin og ZO-en 87,75,80 og følgelig høy Teer rundt 1500 - 2000 ohm · cm 2, det som ligger nærmest kjent in vivo Parametere 79,80 I bioteknologi og farmasøytisk industri, rutinemessig screening av narkotika eller enda high throughput screening (HTS) og arbeidet med å redusere dyreforsøk, ledettil utvikling av forskjellige cellelinjer som kan benyttes som erstatning for den primære kultur av cerebrale endotelceller som forblir vanskeligere å sette opp rutinemessig. I de fleste tilfeller, ble primærkulturer av cerebral endoteliale celler transduseres med en immortalizing genet (SV40 eller polyomavirus stort T-antigen og adenovirus E1A), enten ved transfeksjon av plasmid-DNA eller ved hjelp av retrovirus-infeksjoner vektorer 88,89,75. Flere endothelial cellelinjer av cerebral opprinnelse har blitt utviklet som RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs eller rBCEC4 rottecellelinjer 88,75, den b.End3 musecellelinje 90,75, den PBMEC/C1 - 2 porcine cellelinjen 87,75 og hCMEC/D3 human cellelinje 89,75. Andre modeller er basert på celler av ikke-hjerne-opprinnelse slik som Madin-Darby kaninnyre (MDCK) eller Caco2-cellelinjer 12,75. Blant de forskjellige humane hjerne endotel-cellelinjer, har hCMEC/D3 blitt aner sitered og forbedret som en modell av BBB siden etableringen i 2005 91,92. Som primærkulturer, cellelinjer presentere fordeler og begrensninger. De er lettere å håndtere enn primærkulturer, har en lengre levetid, er godt karakterisert og tillater reproduserbarhet mellom storskalaforsøk. Men, kan cellelinjer miste vev-spesifikke funksjoner, mister miljøregulering og få en molekylær fenotype ganske forskjellig fra celler in vivo 75, 89. Spesielt monolayers generert fra cellelinjer stede redusert tetthet, lav Teer og vis transporter profil variasjon 75,89. Dermed dyreforsøk eller studier i primærceller blir ofte foretrukket til tross for deres ekstra kompleksitet.

Mange legemidler utviklet for å behandle sentralnervesystemet (CNS) lidelser er ute av stand til å nå hjernen parenchyma i terapeutisk relevante konsentrasjoner. BBB beskytter hjerne nervevev fra svingninger i plasma sammensetning, fra sykdomsfremkallende midler, og opprettholder homeostase av hjernen parenchyma ved å begrense ikke-spesifikk forandring av ioner, peptider, proteiner og til og med celler inn i og ut av hjernen 1.. BBB egenskaper er indusert og vedlikeholdes av intim nærhet og krysstale mellom de spesialiserte klasse hjernen microvessel endotelceller og nabo elementer av nevro-gliaceller-vaskulær enhet (NGVU) som nevroner, gliaceller (mer presist astrocyte slutt fot), og pericytes ensheathed i basalmembranen, som består hovedsakelig av kollagen type IV, fibronektin, laminin og proteo-glykaner 2,3. Pericytes dekker ca 22 - 32% av endotelet i kapillær nivå og spiller en viktigrolle i reguleringen av endotel proliferasjon, angiogenese og inflammatoriske prosesser. Endoteliale celler danner et sammenhengende ark som dekker den indre overflate av kapillærene. De er innbyrdes forbundet ved TJs, som danner en belte-lignende struktur på den apikale område og som bidrar til celle polarisering. Astrocytter regulere BBB egenskaper og er kilder til viktige regulatoriske faktorer som TGF-β, GDNF, bFGF-og IL-6. Astrocytter mangelfull i GFAP med ufullstendig funksjonalitet er ikke i stand til å regulere BBB egenskaper fire. Neuroner er ikke direkte involvert strukturelt i dannelsen av BBB, men regulerer også viktige aspekter av proteinekspresjon og BBB-5 funksjon. For ytterligere å studere strukturen, fysiologi og patologi av BBB, ble in vitro-modeller av BBB utviklet som forskningsverktøy. Brain endotelceller er hentet fra ulike arter å gjennomføre in vitro BBB modeller basertpå lav passasje primærkulturer fra storfe 6,7, svin 8,9, rotte 10,11,12, mus 13 og også menneskelig 14,15. Disse modellene er kjent for å etterligne in vivo BBB, spesielt når ko-dyrket med glial-celler fra rotte-eller muse-og / eller pericytes 16,12, og / eller nevrale stamceller avledet astrocytter 17 og / eller 18 nevroner. Den &quot;in Lab&quot;-modeller er ofte produsert fra gnagere, fordi de tillater in vitro / in vivo-eksperimenter og sammenligninger og / eller undersøkelse av hjernen endotelceller produsert fra transgene modeller 19. Nyutviklet in vitro BBB modeller har også blitt utviklet for å hjelpe forutsi hjerne opptak av potensielle CNS narkotika kandidater før in vivo testing 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB modeller er vanligvis brukes til å sammenligne transport av stoffer som følger: i) kjent penetrasjon inn i CNS eller med low permeabilitet over BBB og ingen sentrale virkning, og ii) den tilsynelatende Pe av de samme stoffer, målt i dyremodeller av samme art. De medikamenter som lett passerer BBB er stort sett lipofilt og krysser hjerne endotel-cellemembraner ved lipid-mediert fri diffusjon (koffein, karbamazepin, etc.). De negativt transportert narkotika som digoksin, verapamil eller ciklosporin A er aktivt ekstrudert av hjernen endothelial frigivelshastigheter transportører som P-gp. Imidlertid er mange av de nylig utviklede terapeutiske molekyler er Biopharmaceuticals, slik som rekombinante proteiner, siRNAs eller monoklonale antistoffer. De fleste av dem ikke krysse BBB skyldes: i) fravær av spesifikke transportører, og ii) en tettpakket lag av endotelceller, som hindrer høymolekylære molekyler fra gjennomgår paracellular passasje. Med disse begrensningene, &quot;trojansk hest&quot; strategier har blitt gjennomført ved hjelp av vektorer (antistoffer, peptider) mot kjente reseptorer på BBB, involvert in reseptor-mediert transport eller transcytosis (RMT), slik som transferrin (Tf)-reseptor (TfR), insulinreseptor (IR), eller medlemmer av LDL-reseptoren (LDLR)-relaterte reseptor-familien (LDLR, LRP1). Slike reseptorer er blitt funnet på isolerte hjerne kapillarer og i BBB in vivo 24,25. Transkripsjons profiler for disse reseptorene, spesielt de av LDLR familien, ble analysert og sammenlignet mellom hjerne endotelceller og hjerne endotelceller co-kultivert med astrocytter eller i hjernen kapillærer direkte etter sin utvinning fra hjernen 26. Pardridge 24 åpnet feltet med OX-26 antistoff mot transferrin-reseptoren (TfR), etterfulgt av antistoffer mot insulin-reseptoren og insulinvekstfaktor-reseptor 27,28. Med disse antistoffbaserte vektorer, har ArmaGen Technologies utviklet en BBB molekylær trojansk hest plattform-teknologi for å levere narkotika, blant annet proteiner, over BBB 29. Denlitteratur er rik på data som viser LRP1 uttrykk i hjernen endotelceller og dens rolle som en kraftig endocytic / gatefeier reseptoren. Western blot analyse antydet at LRP1 er uttrykt i fraksjoner beriket i hjernen kapillærer og i rottehjerne kapillære endotelceller 30. Selskaper som Angiochem target LRP1 med peptid vektorer avledet fra aprotinin som fremmer effektiv narkotika tilstrømningen over BBB 31. Imidlertid er LRP1 også involvert i aktiv transport av Aβ og dens effluks / klarering fra hjernen parenchyma til blod 32. Slike data involvere LRP1 i en toveis transport over BBB avhengig av sine ligander. biOasis utvikler Transcend teknologien bruker et protein melanotransferrin for transport av biologiske som lysosomale enzymer og antistoffer over BBB 33 mens Vect-HORUS utvikler peptid vektorer som er rettet mot LDLR 34. Det er data som tyder på at LRP og LDLR kan brukes til å transportere different molekyler som lysosomale enzymer 35,36 eller nanopartikkel komplekser over BBB 37. Vår felt av interesse er for levering av legemidler til CNS ved bruk av vektormolekyler og vektorisert medikamentkandidater for behandling av CNS-lidelser. Spesielt har levering av legemidler over BBB ansees å være innenfor rammen av nevroinflammasjon, en prosess som kan variere i sin utstrekning, men det er sannsynligvis felles for alle CNS-skader og sykdommer, inkludert encefalitt, multippel sklerose, Alzheimers sykdom osv. nevroinflammasjon er assosiert med BBB betennelse og potensielt med endringer i BBB fysiologi og permeabilitet vurderer at paracellular og transcellular transport kan bli forsterket i patologiske tilstander 38,39,40,41,42,43. For eksempel, TNF-α, tweak, og andre cytokiner modulere betennelse, og eksperimenter med in vitro BBB modeller har vist at de kan endre de paracellular egenskapene til the endothelial cell monolayer 38,39,40, og at TNF-α fører også til en økning i transcellular transport av LDL 41, holotransferrin 42 og 43 laktoferrin. Vårt mål var å utvikle og prege en optimalisert og svært reproduserbare rotte syngene BBB-modellen ved hjelp av co-kulturer av primære hjerne endotelceller og astrocytter. Vi brukte fem uker gamle og neonatale Wistar rotter for hjernen endotelceller produksjon og astrocyte produksjon henholdsvis. En utfordring er å opprette en protokoll som tillater produksjon av &quot;ukentlig reproduserbare&quot; BBB-modeller. For å nå dette målet, ble hvert trinn i produksjons protokollen utføres på faste dager i uken, fra hjernen microvessel produksjon på onsdag av den første uken. Disseksjoner ble utført nesten hver uke i løpet av de siste tre årene. For ytterligere å forbedre reproduserbarhet av kulturer, ble et kvalitetssystem etablert. Alle Reagents og kjemikalier ble referert i en database (datoen for innreise, lager, utløps sikt, etc.). Modellen var preget etter en rekke kriterier, som for eksempel endotelceller organisasjon og renhet, Teer, LY permeabilitet, respons på pro-inflammatorisk agenter, kvalitative og kvantitative uttrykk for TJ proteiner, funksjonaliteten frigivelshastigheter transportører som P-gp, og reseptorer involvert i transcytosis tvers av endotelial cellemonolaget som TfR eller LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

Den blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​spesifikt regulerer molekylær og cellulær fluks mellom blodet og nervevev. Vårt mål var å utvikle og karakterisere en meget reproduserbar rotte syngene in vitro modell av BBB ved hjelp av ko-kulturer av primære rotte-hjerne endotel celler (RBEC) og astrocytter å studere reseptorer som er involvert i transcytosis tvers av endotelial cellemonolaget. Astrocytter ble isolert ved mekanisk disseksjon følgende trypsin fordøyelse og ble frosset for senere ko-kulturen. RBEC ble isolert fra 5-ukers gamle rotte cortices. Hjernene ble rengjort av hjernehinnene og hvit substans, og mekanisk dissosiert etter enzymatisk fordøyelse. Deretter ble vevet homogenatet sentrifugert i bovin-serum-albumin for å skille fartøy fragmenter fra nervevev. Fartøyet fragmenter gikk en andre enzymatiske fordøyelsen til gratis endotelceller fra sin ekstracellulære matrise. De resterende kontaminerende celler slik som pericytes ble further elimineres ved plating de microvessel fragmenter i puromycin-holdig medium. De ble deretter passaged til filtre for ko-kultur med astrocytter dyrket på bunnen av brønnene. RBEC uttrykte høye nivåer av tight junction (TJ) proteiner som occludin, claudin-5 og ZO-en med en typisk lokalisering på cellekantene. Den transendothelial elektrisk motstand (Teer) av hjernen endothelial monolayers, indikerer tetthet av TJs nådd 300 ohm · cm 2 i gjennomsnitt. De endothelial permeabilitet koeffisienter (PE) for lucifer gul (LY) var svært reproduserbare med et gjennomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotelceller organisert i monolayers uttrykt effluks transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), viste en polarisert transport av rhodamin 123, en ligand for P-gp, og viste konkret transport av transferrin-Cy3 og DiILDL over endothelial cellemonolag. I konklusjonen, gir vi en protokoll for å sette opp en in vitroBBB modell som er svært reproduserbare grunn av kvalitetssikringsmetoder, og som er egnet for forskning på BBB transportører og reseptorer.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Sette opp en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Rat blod-hjerne barrieren (BBB): Et fokus på BBB Ugjennomtrengelighet og Receptor-mediert transport

Hensikten med foreliggende studie var å validere reproduserbarheten av en in vitro-modell BBB involverer en rotte syngene ko-kultur av endotelceller og astrocytter. Den endothelial cell monolayer frem teer høy og lav permeabilitet LY. Uttrykk for spesifikke TJ proteiner, ble funksjonelle svar på betennelse og funksjonalitet av transportører og reseptorer vurderes.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-veiledet Forstyrrelse av blod-hjerne-barrieren ved hjelp Transkraniell fokusert ultralyd i en rotte Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Rotte modell av blod-hjerne barrieren avbrudd i Tillat Målrettet nevrovaskulære Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Strekk i Brain mikrovaskulær endotelceller (cend) som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatic Brain Injury Modell av blod-hjerne barrieren

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Eksitotoksiske Stimulering av Hjerne Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glukose deprivasjon og reoksygenering som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Iskemi-reperfusjonskade modell for å studere blod-hjernebarrieren Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

En rotte Carotis Balloon Injury Modell Test Anti-vaskulær remodelle Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-induserende prosedyre i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro- analyser for å vurdere blod-hjernebarriere Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Forbedret metoden for etablering av en In Vitro blod - hjerne barrieren modell basert på svin hjernen endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-modell for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...