Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Финансовая поддержка VECT-Гор признал от Fonds Уникальный Interministériel (проект FUI / MEDUL) и в VECT-Гора и в UMR7259 лаборатории из Национальное агентство по де-ла-Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, AdHoc и PREVENTAD совместных проектов) . Лаборатория UMR7259 также признает финансовую поддержку от CNRS и из Экс-Марсель Université.

1. Производство Rat астроциты Для каждого препарата использовать 10 новорожденных крыс линии Вистар обоего пола. <ol><li> Жертвоприношение крыс на режущих головок с ножницами и передавать их сразу в сухом чашку Петри под ламинаре. Удалить мозги из черепа без мозжечка и передавать их непосредственно в чашку Петри, содержащую холодного буфера рассечение: HBSS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (низкий уровень эндотоксина BSA), пенициллин 100 ед / мл стрептомицина и 100 мкг / мл. </li><li> Отрежьте голову пополам, отделить 2 полушария головного мозга и передавать их в чистую чашку Петри с рассечение буфера на льду. Разрежьте зрительный нерв и удалить мозговые оболочки под стереомикроскопом. </li><li> Вымойте корковых куски широко в 50 мл холодного буфера рассечение. </li><li> Поместите корковых части от 3 мозгов в 15 мл трубки Сокол и отделить с помощью пипетки вверх и вниз переворотаLe раз с 10 мл пипеткой, снабженной наконечником синего в 6 мл 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С </li><li> Добавить 24 мл DMEM с добавлением 10% FBS и следующие антибиотики, пенициллин 100 ед / мл и стрептомицин 100 мкг / мл, медиа имени глиальных клеток информации (ГКМ) и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. FBS партии были отобраны и проверены для роста и выживания астроцитов cutures. </li><li> Ресуспендируют гранул, содержащий разложенных клеток в 10 мл GCM и пластины в 75 см 2 Т-колбы (T75). Измените среду на следующий день, чтобы удалить остатки клеток и ДНК. Замените питательных сред два раза в неделю. </li><li> Через 1 неделю пролиферации, осторожно встряхните глиальных клеток с круговой качалке при 60 оборотах в минуту в течение 24 часов при температуре 37 ° С в ГКМ. Если T75 не могут быть помещены в инкубатор с 5% CO 2/95% воздуха при 37 ° C увлажненной атмосфере, дополнить носитель с 5 мМ HEPES. Вымойте клетки дважды галить неадгезивные клеток микроглии. </li><li> Через три недели после посева, промыть клетки дважды DPBS без кальция и магния. Добавить 3 мл теплой 0,05% трипсина-ЭДТА 0,02%, инкубировать при 37 ° С и ждать, пока слой клеток не рассеивается (обычно 5 мин). Блокировка активности трипсина путем добавления 10 мл ГКМ, передача клеточной суспензии в 15 мл сокола трубки и центрифуге при 120 х г в течение 8 мин. </li><li> Ресуспендируют осадок в астроцитов 90% FBS - 10% DMSO, передать их в криопробирки (2 х 10 6 клеток на криопробирку) и хранятся в жидком азоте. </li></ol> 2. Выделение мозга крыс микрососудов Наши экспериментальные процедуры утверждаются Комитета по этике медицинского факультета Марселя на и соответствовать национальным и европейским нормам (Директива ЕС № 86/609). Все усилия были приложены к минимуму страданий животных и уменьшить количество животных, используемых. <ol><li> Для каждого препарата и в течение одного experimenteг, использовать 3 пять недельных крыс линии Вистар. </li><li> Понедельник первой недели, готовить 2 колбах Т75 путем нанесения коллагена типа IV и фибронектина, как на 1 мкг / см 2 в стерильной культуральной водой (10 мл на одно T75). Разрешить не придерживаться при 37 ° С до тех пор, микрососудов посева. </li><li> В среду утром в первую неделю, усыпить крыс под увеличением потока СО 2, чтобы вызвать сонливость, потеря осанки и дыхания перерыва, затем следуют смещения шейных позвонков. Спрей головы с 70% этанола. Отрежьте голову с ножницами и передавать их в сухую чашку Петри под ламинаре. </li><li> Удалить мозги из черепа без мозжечка и зрительных нервов, затем передать их в чашку Петри охлаждали на льду и наполнен холодной рассечение буфера (HBSS с добавлением 1% BSA, пенициллин 100 ед / мл стрептомицина и 100 мкг / мл) . </li><li> Отрежьте голову пополам, чтобы отделить 2 полушария головного мозга и отдельный средний мозг из заebrain. Трансфер переднего мозга в чистую чашку Петри на льду с рассечение буфера. </li><li> Возьмите пару полушарий в новом чашку Петри с холодной рассечение буфера тщательно удалить мозговые оболочки из переднего мозга под стереомикроскопом с N ° 5 пинцетов. Затем очистите внутреннюю часть мозга, чтобы удалить одеяло миелина и получить оболочку мозга. Эти шаги не должны принимать более 2 час для сохранения тканей и выживаемости клеток. </li><li> Диссоциируют в кору от 3 мозгов в 6 мл холодного буфера рассечение в 7 мл Dounce гомогенизатор на 10 вверх и вниз ударов с каждого из 2 пестики различных зазоров, 71 мкм с последующим 20 мкм. </li><li> Разделить суспензии, чтобы получить эквивалент 1 коры в 1 мл 50 мл сокола трубки и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант. </li><li> Дайджест подвеску с 1 коры с 1 мл ферментативного раствора, содержащего смесь коллагеназ / диспазы (60 мкг / мл R11; 0,3 ед / мл), тип ДНКазы I (35 мкг / мл - 20 K единиц / мл) и гентамицин (50 мкг / мл) в шейкере в течение 30 мин при 37 ° С </li><li> Смешайте 1 мл переваривают с 1 коры с 10 мл 25% BSA / HBSS 1X и отдельный от плотности зависимой центрифугированием при 3600 х г в течение 15 мин при комнатной температуре. Тщательно передачи верхний диск (миелин и мозг паренхимы) и супернатант в чистую 50 мл сокола трубки и повторить центрифугирование. Хранить Полученный осадок, содержащий микрососудов мозга при 4 ° С. </li><li> Осторожно отбросить верхний диск и супернатант. Ресуспендируют обе полученные гранулы, содержащие микрососудов мозга с 1 мл холодного HBSS 1X и передачи в чистом 50 мл сокола трубки. </li><li> Промыть микрососудов добавлением 20 мл холодной HBSS 1X и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант. </li><li> Кроме того переварить микрососудов мозга от 1 с 1 мл того же раствора ферментного как описано в стадии 2,9 в течение 1 ч при 37 ° С в шAker. </li><li> Затем смешать переваренных микрососудов от каждой из 3 коры в одну пробирку и далее разделить на две 50 мл пробирки Фалкон получить микрососудов, извлеченные из эквивалент полутора (1,5) коры на пробирку. Добавить 30 мл буфера холодной рассечение и центрифуге при 1000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре. </li><li> Ресуспендируют осадок микрососудов в 10 мл DMEM/F12, дополненной 20% бычьей плазмы, обедненной тромбоцитами, полученной сыворотке, основной фактор роста фибробластов (оФРФ, 2 нг / мл), гепарина (100 мкг / мл), гентамицин (50 мкг / мл) и HEPES (2,5 мМ), названный эндотелиальных клеток медиа (ECM) с добавлением пуромицин на 4 мкг / мл. </li><li> Возьмите 2 покрытые колбах Т75 из инкубатора, аспирации избыток покрытия и пластины микрососудов от каждой трубы в одном T75 колбу (микрососудов, извлеченные из 1,5 коры на T75 колбу). </li></ol> 3. Очистка и размножение РБЕС Primocultures <ol><li> Очистка: со среды по пятницу, добавить puromycin на 4 мкг / мл в культуральной среде. Изменение среды на четверг. В пятницу, не мыть клетки и добавить пуромицина на 2 мкг / мл до понедельника. </li><li> Распространение: в понедельник второй недели, промыть клетки и добавить инсулин, трансферрин и дополнения селенит натрия в культуральной среде до культуры не достигают 90% слияния в среду второй недели. </li></ol> . 4 Дифференциация: Настройка Модель Экстракорпоральное ВВВ <ol><li> Понедельник второй недели, подготовить фильтры (полиэтилен, 12 лунок, размер пор 1,0 мкм) путем нанесения смеси коллагена типа IV и фибронектина как на 0.5μg/cm 2 в стерильной культуры воде (500 мкл смеси в верхнем отделении и 1,5 мл стерильной культуральной воды в нижнем отделении). Разрешить не придерживаться при 37 ° С до тех пор, РБЕС посева. </li><li> Понедельник второй недели, за пять дней до установления совместного культивирования, промойте астроциты от криопробирки при 37 ° С и передачив 15 мл сокола с 10 мл ГКМ. Центрифугируют суспензию с 120 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре. </li><li> Ресуспендируют осадок в астроцитов ГКМ и пластины с плотностью 30 х 10 3 клеток на см 2 в 12-луночных планшетах. </li><li> Среде на второй неделе, как раз перед диссоциации трипсином РБЕС, мыть два раза фильтр предварительно покрытую среде DMEM/F12. Предварительно заполнить камеры с ECM: 1,5 мл в нижнем отделении и 0,5 мл в верхний отсек. </li><li> Среда второй недели, мыть два раза РБЕС с DPBS без кальция и магния. Добавить 4 мл теплой трипсина 0,05% - ЭДТА 0,02% раствора при 37 ° С в T75 колбу во время 30 сек точно. Затем снять 3,5 мл раствора трипсина и наблюдать под микроскопом. Когда слой клеток начинает отделяться от матрицы, помочь им, осторожно нажав на край T75 колбу, пока все клетки не плавают. </li><li> Добавить 9 мл ECM на T75 колбу и передать в 15 мл трубки Сокол. Очень аккуратно отделить ячейкуподвеска помощью пипетки вверх и вниз 4 раза с 10 мл пипетки, снабженной наконечником желтого (производство избежать пузырьков в растворе). Граф клеток в суспензии (примерно 3 х 10 6 cells/T75) и сразу же пластины на предварительно покрытых и предварительно заполненных фильтров с высокой плотностью (160 х 10 3 клеток / фильтра, следовательно, около 18 filters/T75) (рис. 8 ). На следующий день (четверг), изменить два раза среду верхний отсек для удаления остатков клеток. </li><li> Четверг второй недели, за день до установления совместного культивирования, замените астроцитов питательных сред на 1,5 мл среде для дифференцировки (ECM гидрокортизоном при 500 нМ), которые могут быть дополнены с 1/3 кондиционированной среды от базальной отсеке предыдущего совместное культивирование (3 дня контакта между эндотелиальных клеток и астроцитов). </li><li> Пятница второй недели определяется как день 0 дифференциации; заменить питательные среды от Конта фильтровining в РБЕС с дифференцировки. Перенесите РБЕС фильтры в лунки, содержащие астроциты. В этих условиях, модели в пробирке дифференцировать и выразить распределительные связанных белков в течение 3 дней. </li><li> Модели держать их оптимальную дифференциацию в течение более 3 дней, с понедельника по среду третьей недели. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Многие препараты, разработанные для лечения центральной нервной системы (ЦНС), не могут прийти к паренхимы мозга в терапевтически значимых концентрациях. BBB защищает нервную ткань головного мозга от флуктуации состава плазмы, от патогенных агентов, а также поддерживает гомеостаз паренхимы мозга, ограничивая неспецифический поток ионов, пептидов, белков и даже клеток в и из мозга 1. BBB характеристики индуцированных и поддерживается интимной близости и перекрестных помех между специализированная класса мозг микрососудов эндотелиальных клеток и соседних элементов нейро-глии-сосудистой блока (NGVU), таких как нейроны, глиальные клетки (точнее астроцитов конечным футов), и перициты ensheathed в базальной мембране, которая состоит в основном из коллагена типа IV, фибронектин, ламинин и протеогликанов 2,3. Перициты покрывают примерно 22 - 32% от эндотелия на уровне капиллярного и играют важную роль вроль в регулировании пролиферации эндотелия, ангиогенеза и воспалительных процессов. Эндотелиальные клетки образуют непрерывный лист, покрывающий внутреннюю поверхность капилляров. Они соединены друг с ТТ, которые образуют структуру ленты, как в апикальной области и которые способствуют поляризации клеток. Астроциты регулировать свойства BBB и являются источниками важных регуляторных факторов, таких как TGF-β, GDNF, оФРФ и IL-6. Астроциты дефицитные по GFAP с неполной функциональностью не в состоянии регулировать BBB свойства 4. Нейроны непосредственно не вовлечены в структурно формирования BBB но также регулировать важные аспекты экспрессии белка и BBB функций 5. В целях дальнейшего изучения структуры, физиологию и патологию BBB, модели в пробирке из ГЭБ были разработаны в качестве исследовательских инструментов. Эндотелиальных клетках головного мозга были извлечены из различных видов осуществить в пробирке моделей на основе BBBна низких проходных первичных культур из бычьего 6,7, свиней 8,9, крысы 10,11,12, мыши 13, а также человеческой 14,15. Эти модели известны, чтобы имитировать в естественных условиях BBB, особенно при совместном культивировании с глиальных клеток от крысы или мыши и / или перицитов 16,12 и / или нейронных клеток-предшественников, полученных астроцитов 17 и / или 18 нейронов. Модели &quot;в лаборатории&quot; часто производятся от грызунов, поскольку они позволяют в пробирке естественных условиях экспериментов / в и сравнений и / или изучения мозга эндотелиальных клеток, полученных из трансгенных моделей 19. Недавно разработанный в пробирке моделей BBB также был разработан, чтобы помочь предсказать поглощение мозга потенциальных кандидатов наркотиков ЦНС до исследования на живом 15,20,21,3,6,22,11,23. В пробирке модели BBB обычно используется для сравнения транспортировка наркотиков с: I), известного проникновения в ЦНС или с лвл проницаемость через ВВВ и никаких центральных эффектов, и б) очевидны Pe из тех же препаратов, измеренных в моделях на животных того же вида. Препараты, которые легко проходить через ГЭБ в основном липофильным и пересекают мембраны эндотелиальных клеток головного мозга путем опосредованного липидами свободной диффузии (кофеин, карбамазепин и т.д.). Отрицательно транспортируемые препараты, такие как дигоксин, верапамил или циклоспорина А активно экструдируют на мозг эндотелиальных эффлюкса транспортеров, такие как п-GP. Тем не менее, многие из недавно разработанных терапевтических молекул биофармацевтических, такие как рекомбинантные белки, киРНК или моноклональных антител. Большинство из них не проникает через ГЭБ за счет: I) отсутствие конкретных перевозчиков, и II) плотно набитый слой эндотелиальных клеток, которые препятствуют высокомолекулярных молекул от прохождения парацеллюлярного проход. С этих пределах, &quot;троянского коня&quot; стратегии были реализованы с использованием векторов (антитела, пептиды) против известных рецепторов на BBB, участвующих ян рецептор опосредованного транспорта или трансцитоз (RMT), такие как трансферрин (T) рецепторов (TfR), рецептора инсулина (ИК), или членов рецептора ЛПНП (LDLR), связанных рецепторов семью (LDLR, LRP1). Такие рецепторы были обнаружены на отдельных капилляров головного мозга и в BBB в естественных 24,25. Транскрипционные профили для этих рецепторов, в частности к семейству LDLR, были проанализированы и сравнены между эндотелиальных клетках головного мозга и эндотелиальных клетках головного мозга совместно культивировали с астроцитов или в капилляров головного мозга непосредственно после их извлечения из мозга 26. Pardridge 24 открыт поле с антителом OX-26 против рецептора трансферрина (TfR), а затем антител против рецептора инсулина и фактора роста инсулина рецептора 27,28. С помощью этих векторов антител основе, ArmaGen Технологии разработала технологию лошадь платформы ВВВ молекулярную Trojan для доставки лекарств, в том числе белков, через ГЭБ 29.литература богата данных, свидетельствующих LRP1 выражение в эндотелиальных клетках головного мозга и его роль в качестве мощного эндоцитотический / мусорщика рецептора. Вестерн-блот анализ предположил, что LRP1 определяется в долях, обогащенных капилляров головного мозга крысы и в капиллярных эндотелиальных клетках головного мозга 30. Такие компании, как Angiochem целевой LRP1 с пептидных векторов, полученных из апротинином, которые способствуют эффективной приток наркотиков через ГЭБ 31. Тем не менее, LRP1 также участвует в активном транспорте Ар и его оттока / оформление от паренхимы мозга с кровью 32. Такие данные включают в LRP1 двунаправленного транспорта через ВВВ в зависимости от его лигандов. biOasis развивает технологию Transcend с использованием белка melanotransferrin для перевозки биопрепаратов, таких как лизосомальных ферментов и антител через ГЭБ 33, одновременно VECT-HORUS развивается пептидные векторы, которые ударят по LDLR 34. Там данные о том, что LRP и LDLR может быть использован для транспортировки РазницаМолекулы, такие как отлична лизосомальных ферментов 35,36 наночастиц или комплексов через ВВВ 37. Наша сфера интересов находится доставки лекарств в ЦНС с использованием векторной молекулы и векторизованные наркотиков-кандидатов для лечения заболеваний ЦНС. В частности, для доставки лекарственных через ГЭБ должен быть рассмотрен в контексте Neuroinflammation, процесс, который могут быть в своей степени, но это, вероятно, общим для всех поражений ЦНС и болезней, в том числе энцефалит, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и т.д. Neuroinflammation связано с BBB воспаления и потенциально с изменениями в BBB физиологии и проницаемости, учитывая, что парацеллюлярная и трансцеллюлярного транспорт может быть усилен при патологических состояниях 38,39,40,41,42,43. Например, TNF-α, настроить и другие цитокины модулируют воспаление, и эксперименты с в пробирке моделей BBB показали, что они могут изменить трансклеточном свойства гое монослой эндотелиальных клеток 38,39,40 и что TNF-α также приводит к увеличению трансцеллюлярного транспорта LDL 41, 42 holotransferrin и лактоферрин 43. Наша цель заключается в разработке и охарактеризовать оптимизированы и высокую воспроизводимость крыса сингенными BBB модель с использованием совместно культур первичных эндотелиальных клетках головного мозга и астроцитов. Мы использовали 5 недельных и неонатальных крыс линии Вистар для производства мозг эндотелиальных клеток и производства астроцитов соответственно. Одна из проблем в том, чтобы создать протокол, позволяющий производство &quot;еженедельно воспроизводимых&quot; моделей BBB. Для достижения этой цели, каждый шаг протокола производства была выполнена на определенные дни недели, начиная с производства мозг микрососудов в среду первой недели. Вскрытия проводились почти каждую неделю в течение последних 3 лет. Для дальнейшего улучшения воспроизводимости культур, была создана система обеспечения качества. Все ReageNц и химические вещества были ссылки в базе данных (дата вступления, фондовом, срок годности, и т.д.). Модель характеризуется после ряда критериев, таких как организации эндотелиальных клеток и чистоты, TEER, LY проницаемость, ответ на провоспалительных агентов, качественного и количественного выражения TJ белков, функциональности эффлюкса перевозчиков, таких как P-GP, и рецепторов участие в трансцитозом через эндотелия монослоя клеток, таких как TfR или LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

Гематоэнцефалический барьер (BBB), специально регулирует молекулярную и клеточную потока между кровью и нервной ткани. Наша цель заключалась в разработке и характеризуют хорошо воспроизводимый крысы сингенной в модели пробирке ГЭБ, используя совместно культур первичных мозга крысы эндотелиальных клеток (РБЕС) и астроциты изучать рецепторы, участвующие в трансцитозом через эндотелия монослоя клеток. Астроциты выделяли механической вскрытия следующие трипсина пищеварения и были заморожены для последующего совместного культивирования. РБЕС были выделены из 5-недельных крыс коры. Головной мозг очищается от мозговых оболочек и белого вещества, и механически диссоциируют следующие ферментативного расщепления. После этого ткань Гомогенат центрифугировали в бычьего сывороточного альбумина, чтобы отделить фрагменты сосудов из нервной ткани. Фрагменты сосудов прошел второй ферментативного пищеварения освободить эндотелиальных клеток от их внеклеточного матрикса. Остальные загрязняющие клетки, такие как перицитов были Further устранены путем посева фрагменты микрососудов в пуромицина среде, содержащей. Затем они были пассируют на фильтров для совместного культивирования с астроцитов, выращенных на дне лунки. РБЕС выразил высокие уровни плотного контакта (TJ) белки, такие как occludin, Claudin-5 и ZO-1 с типичной локализации в клеточных границ. Трансэндотелиальный электрическое сопротивление (TEER) головного мозга эндотелиальных монослоев, что указывает на герметичность ТТ достиг 300 Ом · см 2 в среднем. Эти коэффициенты по проницаемости эндотелия (PE) для Люцифера желтого (LY) был очень воспроизводимые в среднем 0,26 ± 0,11 × 10 -3 см / мин. Эндотелиальных клетках головного мозга, организованные в монослоев выразил отток транспортера Р-гликопротеина (P-GP), показали, поляризованный транспорт родамином 123, лиганда для P-GP, и показал конкретную перевозку трансферрина-Cy3 и DiILDL через эндотелия монослоя клеток. В заключение, мы предоставляем протокол для создания в пробиркеBBB модель, которая является очень воспроизводимые из-за методов обеспечения качества, и который подходит для исследований в области BBB перевозчиков и рецепторов.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Наладка<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Модель крысы гематоэнцефалического барьера (ГЭБ): Фокус на BBB Герметичность и рецептор-опосредованного транспорта

Цель настоящего исследования состояла в проверке воспроизводимости в пробирке BBB модели с участием крыс сингенной совместное культивирование эндотелиальных клеток и астроцитов. Эндотелиальных клеток монослоя представлены высокую TEER и низкую проницаемость LY. Экспрессия специфических белков TJ, функциональные ответы на воспаление и функциональность транспортеров и рецепторов были оценены.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

МРТ наведением Нарушение гематоэнцефалический барьер использованием транскраниальной сфокусированным ультразвуком в крысиной модели

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Крыса Модель гематоэнцефалический барьер Нарушение чтобы позволить Целевые нейрососудистой терапии

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Растянуть в мозге эндотелиальные клетки микрососудов (CEND) в качестве<em&gt; In Vitro</em&gt; Травматические повреждения мозга Модель из гематоэнцефалического барьера

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель инсульта

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Кислород-Глюкоза Лишение и реоксигенации в<em&gt; In Vitro</em&gt; Ишемии Травмы моделью для изучения гематоэнцефалического барьера дисфункции

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

Крыса Каротидное шар Травма Модель для тестирования Anti-сосудистое ремоделирование Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Глаукома индуцирующего процедуры в<em&gt; В Vivo</em&gt; Крыса модель и всего монтажа Retina Подготовка

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

В анализах in vitro для оценки образования и разрушения сосудов типа мозгового барьера

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель in vitro для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...