Name: setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Ekonomiskt stöd till VECT-Horus är erkänt från Fonds Unique Interministériel (FUI / MEDUL-projektet) samt att vect-HORUS och UMR7259 laboratoriet från Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC och PREVENTAD samarbetsprojekt) . Den UMR7259 laboratoriet erkänner också ekonomiskt stöd från CNRS och från Aix-Marseille Université.

1. Produktion av Rat Astrocyter För varje preparat använder 10 neonatala Wistarråttor av båda könen. <ol><li> Offer råttorna genom skärhuvuden med en sax och för över dem omedelbart i ett torrt petriskål under ett dragskåp med laminärt flöde. Avlägsna hjärnorna från skallen utan cerebellum och överföra dem omedelbart till en petriskål med kallt dissektion buffert: HBSS supplementerat med 1% bovint serumalbumin (låg nivå av endotoxin BSA), penicillin 100 enheter / ml och streptomycin 100 pg / ml. </li><li> Skär hjärnorna på mitten, för att separera de två hjärnhalvorna och överföra dem till en ren petriskål med dissektion buffert på is. Skär synnerven och avlägsna hjärnhinnorna under ett stereomikroskop. </li><li> Tvätta kortikala bitar omfattande i 50 ml kall dissektion buffert. </li><li> Placera de kortikala bitar från 3 hjärnor i en 15 ml Falcon rör och avstånd genom att pipettera upp och ned en kupple gånger med 10 ml engångspipett utrustad med en blå spets i 6 ml trypsin 0,05% - EDTA 0,02% under 5 minuter vid 37 ° C. </li><li> Lägg till 24 ml av DMEM kompletterat med 10% FBS och följande antibiotika, penicillin 100 enheter / ml och streptomycin 100 ^ g / ml, ett media som namnges gliacell medier (GCM) och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur. FBS partier valdes ut och validerats för tillväxt och överlevnad av astrocyternas cutures. </li><li> Suspendera pelleten innehåller dissocierade celler i 10 ml GCM och plattan i en 75 cm 2 T-kolv (T75). Ändra mediet följande dag för att avlägsna celldebris och DNA. Ersätt odlingsmediet två gånger i veckan. </li><li> Efter en vecka av proliferation, skaka försiktigt gliaceller med en orbital skakanordning vid 60 rpm under 24 h vid 37 ° C i GCM. Om T75 inte kan placeras i en inkubator med 5% CO 2/95% luft vid 37 ° C fuktad atmosfär, komplettera media med 5 mM HEPES. Tvätta cellerna två gånger med rEFlytta icke vidhäftande mikrogliaceller. </li><li> Tre veckor efter sådd, tvätta cellerna två gånger med DPBS utan kalcium och magnesium. Lägg 3 ml varmt trypsin 0,05%-EDTA 0,02%, inkubera vid 37 ° C och vänta tills cellskiktet är dispergerat (vanligen 5 min). Inhibera trypsin-aktivitet genom tillsats av 10 ml av GCM, överför cellsuspensionen till ett 15 ml Falcon-rör och centrifugera vid 120 x g under 8 min. </li><li> Resuspendera astrocyternas pelleten i 90% FBS - 10% DMSO, överföra dem till cryovials (2 x 10 6 celler per cryovial) och lagra i flytande kväve. </li></ol> 2. Isolering av råtthjäma mikrokärl Våra experimentella procedurer är godkända av den etiska kommittén vid medicinska fakulteten Marseille och uppfyller nationella och europeiska bestämmelser (EU-direktiv nr 86/609). Alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens lidande och minska antalet djur som används. <ol><li> För varje preparat och för en Experimenter, använd 3 fem veckor gamla Wistar råttor. </li><li> Måndagen den första veckan, förbereda 2 T75 kolvar genom beläggning med kollagen typ IV och fibronektin, både vid 1 mikrogram / ​​cm 2 i sterilt kultur vatten (10 ml per T75). Tillåt att vidhäfta vid 37 ° C tills mikrokärls sådd. </li><li> Onsdag morgon den första veckan, avliva råttorna i en ökande flöde av CO2 för att framkalla sömnighet, förlust av kroppshållning och andning avbrott, sedan följt av en cervikal dislokation. Spraya huvudena med 70% etanol. Skär huvudena med en sax och överföra dem till en torr petriskål under ett dragskåp med laminärt flöde. </li><li> Avlägsna hjärnorna från skallen utan cerebellum och synnerverna och därefter överföras i en petriskål kyldes på is och fylldes med kallt dissektion buffert (HBSS supplementerat med 1% BSA, penicillin 100 enheter / ml och streptomycin 100 pg / ml) . </li><li> Skär hjärnorna på mitten för att separera de två hjärnhalvorna och separat mitthjärnan från förebrain. Överför framhjärnorna i en ren petriskål på is med dissektion buffert. </li><li> Ta ett par halvklot i en ny petriskål med kallt dissektion buffert för att försiktigt ta bort hjärnhinnorna från framhjärnorna under ett stereomikroskop med N ° 5 böjda pincett. Sedan rengör insidan av hjärnan för att ta bort täcket av myelin och erhållande av ett skal av cortex. Dessa åtgärder bör inte ta mer än 2 timmar för vävnads bevarande och cellöverlevnad. </li><li> Dissociera cortex från 3 hjärnor i 6 ml kallt dissektion buffert i en 7 ml Dounce homogenisator med 10 upp och ner slag med vardera 2 pestles av olika godkännanden, 71 um följt av 20 um. </li><li> Dela upp suspensionen för att erhålla motsvarande 1 cortex i en ml av en 50 ml Falcon-rör och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid rumstemperatur. Kasta bort supernatanten. </li><li> Digerera suspension från en cortex med 1 ml av en enzymlösning som innehåller en blandning av kollagenas / dispas (60 | ig / ml R11; 0,3 U / ml), DNas typ I (35 ^ g / ml - 20 K enheter / ml) och gentamicin (50 ug / ml) i en skakanordning under 30 min vid 37 ° C. </li><li> Blanda 1 ml smälta från 1 cortex med 10 ml 25% BSA / HBSS 1X och separat genom densitetsberoende centrifugering vid 3600 xg under 15 min vid RT. Försiktigt överföra den övre skivan (myelin och hjärnparenkymet) och supernatanten i en ren 50 ml Falcon rör och upprepa centrifugering. Håll den resulterande pelleten innehållande hjärnmikrokärl vid 4 ° C. </li><li> Försiktigt kassera den övre skivan och supernatanten. Resuspendera båda resulte pellets innehåller hjärnan mikrokärl med 1 ml kall HBSS 1X och överför till en ren 50 ml Falcon rör. </li><li> Tvätta mikrokärl genom tillsats av 20 ml kall HBSS 1X och centrifugera vid 1000 xg under 5 min. Kasta bort supernatanten. </li><li> Ytterligare smälta mikrokärl från 1 cortex med 1 ml av samma enzymatisk lösning som beskrivs i steg 2,9 under 1 timme vid 37 ° C i en shaker. </li><li> Sedan blanda de uppdelade mikrokärl från var och en av de 3 cortex i ett rör och ytterligare dela upp i två 50 ml Falcon-rör för att erhålla mikrokärl utvinns ur motsvarande en och en halv (1,5) cortex per rör. Tillsätt 30 ml kallt dissektion buffert och centrifugera vid 1000 xg under 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Resuspendera mikrokärls pelleten i 10 ml av DMEM/F12 kompletterat med 20% bovint blodplättsfattig plasma härlett serum, basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 2 ng / ml), heparin (100 pg / ml), gentamicin (50 pg / ml) och HEPES (2,5 mM), som namnges endotelcell media (ECM) kompletterat med puromycin vid 4 ug / ml. </li><li> Ta de två belagda T75 kolvar från inkubatorn, aspirera överskottet av beläggning och platta de mikrokärl från varje rör i en T75 kolv (mikrokärl extraherade från 1,5 cortex per T75 kolv). </li></ol> 3. Rening och spridning av RBEC Primocultures <ol><li> Rening: onsdag till fredag, lägga puromycin vid 4 ^ g / ml till odlingsmediet. Ändra mediet på torsdagen. På fredag, tvätta cellerna och lägga puromycin på 2 mikrogram / ml till måndag. </li><li> Proliferation: på måndagen i den andra veckan, tvätta cellerna och lägga insulin, transferrin och natriumselenit tillägg till odlingsmedia tills kulturerna når 90% sammanflödet på onsdagen i den andra veckan. </li></ol> . 4 Differentiering: Inställning av in vitro BBB-modell <ol><li> Måndagen i den andra veckan, förbereda filter (polyeten, 12 brunnar, porstorlek 1,0 mikrometer) genom beläggning med en blandning av kollagen typ IV och fibronektin både 0.5μg/cm 2 i sterilt kultur vatten (500 l av blandningen i det övre facket och 1,5 ml sterilt odlingsvatten i den undre avdelningen). Tillåt att vidhäfta vid 37 ° C tills RBEC sådd. </li><li> Måndagen i den andra veckan, fem dagar före inrättandet av co-kultur, tina de astrocyter från cryovials vid 37 ° C och överföringi ett 15 ml Falcon med 10 ml GCM. Centrifugera suspensionen vid 120 x g under 8 min vid rumstemperatur. </li><li> Resuspendera astrocyt pelleten i GCM och platta vid en densitet av 30 x 10 3 celler per cm 2 i 12-brunnsplattor. </li><li> Onsdagen i den andra veckan, strax före dissociation av RBEC med trypsin, tvätta två gånger pre-belagda filter med DMEM/F12-medium. Pre-fylla kamrarna med ECM: 1,5 ml i nedre facket och 0,5 ml i det övre facket. </li><li> Onsdagen i den andra veckan, tvätta två gånger RBEC med DPBS utan kalcium och magnesium. Tillsätt 4 ml varmt trypsin 0.05% - EDTA 0,02% lösning vid 37 ° C per T75 kolv under 30 sekunder exakt. Ta sedan bort 3,5 ml av trypsinlösning och observera under mikroskop. När cellskikt börjar lossna från matrisen, hjälpa dem genom att knacka försiktigt kanten av T75 kolv till dess att alla celler är flytande. </li><li> Lägg till 9 ml ECM per T75 kolv och överför till en 15 ml Falcon rör. Mycket försiktigt dissociera cellsuspension genom pipettering upp och ned fyra gånger med en 10 ml pipett utrustad med en gul spets (undvika produktion av bubblor i lösningen). Räkna celler i suspension (approximativt 3 x 10 6 cells/T75) och omedelbart plattan på förbelagda och förfyllda filter vid en hög densitet (160 x 10 3 celler / filter därmed cirka 18 filters/T75) (Figur 8 ). Följande dag (torsdag), ändrar dubbelt mediet den övre kammaren för att avlägsna celldebris. </li><li> Torsdag i den andra veckan, dagen före inrättandet av co-kultur, byt astrocyternas odlingsmedia med 1,5 ml av differentiering media (ECM med hydrokortison vid 500 nM) som kan kompletteras med 1/3 konditionerat medium från basala facket av ett tidigare samodling (3 dagar av kontakt mellan endotelceller och astrocyter). </li><li> Fredagen den andra veckan definieras som dagen 0 av differentiering; ersätta odlingsmedia från filter containing den RBEC med differentieringsmedia. Överför RBEC filter i brunnarna innehåller astrocyter. Under dessa betingelser in vitro-modeller differentiera och uttrycka kopplingsrelaterade proteiner inom tre dagar. </li><li> Modellerna håller optimal differentiering under ytterligare 3 dagar, från måndag till onsdag i den tredje veckan. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

Vi beskriver genomförandet av en vecko reproducerbar protokoll för isolering och plätering av hjärnmikrokärl, efter rening och kultur RBEC och vidare inrätta samkulturer med primär rått astrocyter att generera en in vitro BBB-modell med karaktäristiska BBB: egenskaper. Framgångsrikt upprättandet standardiserade in vitro-BBB: kulturer kräver optimala förhållanden i de multipla sekventiella steg av processen. Modellen (a) optimeras för att erhålla lägsta paracellulära permeabilitet, vilket fortfarande är den &quot;heliga graal&quot; av in vitro BBB: modeller, och (b) validerats för utflöde och RMT mekanismer. Produktion, rening och spridning av RBEC Den största utmaningen vid odling RBEC är att uppnå reproducerbarhet mellan olika kulturer. Standardisering av protokollet kräver högkvalitativa verktyg för disavsnitt, högkvalitativa reagenser och för reagensutgångsdatum. Försöksledaren måste vara skicklig i mikro-dissektion i stereomikroskop för snabb borttagning av hjärnhinnor och stora fartyg från cortex ytan. När hjärnan är isolerade och mekaniskt dissocierade, en av de stora utmaningarna är den optimala enzymatisk nedbrytning av de nyligen isolerade hjärnmikrokärl. Den typ och kvalitet av de enzymer som används är kritisk. En blandning av kollagenaser typ I och II och dispas vid hög koncentration med låg variabilitet mellan batcher användes. Viktigt är också varaktigheten av enzymatisk spjälkning och förhållandet mellan enzymkoncentrationen / vävnad vikt / volym av matsmältningen. Det bästa utbytet av hjärnmikrokärls produktion erhölls med motsvarigheten av cortex från en hjärna i en ml av kollagenaser / dispas blanda vid 60 | ig / ml under både spjälkningar, respektive 30 minuter och 1 timme. Också kritiska är att eliminera kontaminerande cells (astrocyter och främst pericyter). Dessa celler förökar sig med högre hastighet än endotelceller och inte etablera tight junctions med det senare, vilket förhindrar upprättandet av en homogen cellmonolager med god paracellulär restriktivitet. Med tanke på att hjärnans endotelceller uttrycker mycket högre nivåer av effluxpumpar, speciellt P-gp, jämfört med andra celltyper som finns i mikrokärl, bättre de tolererar de annars toxiska koncentrationer av P-gp ligand droger, medan icke-endotelceller elimineras. Puromycin behandling på 4 mikrogram / ml för de första två dagarna följdes av ytterligare två dagar till 2 mikrogram / ml för att erhålla god endotelceller renhet. Detta val kan också gynna kapillärendotelceller kontra de från venoler, pre-kapillär arterioler eller större mikrokärl, och leda till stramare monolager. Dessutom är en nödvändighet för att erhålla rena kulturer av endotelceller 47,48 användningen av plasma-härlett bovint serum. Plasman-derived serum saknar platelet-derived growth factor (PDGF), vilket är mitogen för fibroblaster, för glatta muskelceller och därmed för pericyter. Vi konstaterade att behandlingen av plast och filter med en blandning av kollagen typ IV från möss och mänskliga fibronektin ger en betydande fördel, med en 2-faldig ökning av spridningen avkastning jämfört med traditionellt rekommenderat kollagen typ I från råtta svans. Viktiga signaler för cellproliferation tillhandahålls av den extracellulära matrisen såsom grin och tillväxtfaktor (bFGF) aktivering 49. Buffert koncentration och pH i odlingsmedia har beskrivits för att positivt påverka paracellulär täthet 50 och vi observerade en bättre reproducerbarhet mellan kulturer med tillägg av HEPES buffert vid 5 mM. Differentiering av RBEC: Co-kultur Etablering på Infoga Filter När hjärnans endotelceller har been renat och frodats under 6 dagar, kan de pläterade på filter. Cell plätering med hög densitet är avgörande för att få en perfekt monolager. En såddtäthet av 160x10 3 celler per 12-brunnars platta filter var nödvändig och tillräcklig för att erhålla ett sammanflytande monoskikt 24 h efter sådd. Emellertid är isoleringen av primära hjärn kapillär endotelceller från sin omgivning en paradox i konstruktionen av en BBB in vitro-modell som det är känt att primära celler, och i synnerhet hjärnkapillära endotelceller, starkt regleras av deras miljö och induktiva faktorer som produceras av de olika omgivande celltyper. Brain kapillärendotelceller odlade ensam snabbt de-differentiera och förlorar vissa specifika hjärn endothelial markörer. Sålunda bör primära endotelceller utnyttjas vid låg passage (P1) och anslutas på nytt, åtminstone delvis, med sin omgivning genom samodling med astrocyter eller medium konditionerat av astrocyter 47,51. Detta gällersant för astrocyternas differentiering som hjärn endotelceller och astrocyter är involverade i tvåvägs induktion. Odling RBEC med astrocyter ledde till kraftig induktion av interendothelial TJ 52,23. De molekylära mekanismerna för re-induktion fortfarande till stor del okända, och forskning pågår på flera laboratorier för att identifiera specifika modulerande faktorer som utsöndras av astrocyterna, som kan främja optimal endotelceller differentiering 53,54. Faktorer som utsöndras av hjärnans endotelceller inklusive leukemi hämmande faktor (LIF) har visats inducera astrocytisk differentiering 55,56. Före samodling etablering var astrocyter exponerades för differentiering medium innehållande glukokortikoid-receptoragonist hydrokortison och samodling konditionerat medium. Hydrokortison är känt för att förbättra tätheten hos hjärnan endotelceller och används i BBB: modeller speciellt från råtta 57 och mus 58,59 endotelceller. Den rade medium samlas in från den undre avdelningen av endotelcell / astrocyt samodlingssystemet efter 3 dagar och frystes för senare användning. Användningen av co-kultur medium reducerade tiden för endotelceller differentiering till 3 dagar med optimal paracellulär permeabilitet för ytterligare 2 dagar och även förbättrad reproducerbarhet mellan kulturer. Sammantaget protokollet beskriver vi ger en reproducerbar TEER över 300 ohm-cm 2 och en genomsnittlig paracellulär permeabilitetskoefficienten Pe (LY) av 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, som liknar de bästa primära cellbaserade BBB: modellerna 22, 12. Protokollet som vi beskriver i föreliggande manuskript med den föreslagna moduleringen av mikrokärls enzymatisk nedbrytning kan utökas till endotelceller från råttryggmärg 60 och från möss hjärnan. Molekylär och funktionell karakterisering DessutomTJ induktion, astrocyter också bidrar till uttrycket av uttransportörer såsom P-gp i hjärnans endotelceller 61. Vi visar faktiskt expression av transportproteinet P-gp i BBB-modellen och vi visar polariteten på P-gp-effluxpump lokalisering med hjälp av biokemiska metoder, och av P-gp-aktivitet med användning av en funktionell analys. GLT-1 uttryck detekterades i basalmembranfraktionen av mikrokärl, men detekterades inte i odlade RBEC. Vår hypotes är att GLT-1 var ned reglerad i vår RBEC kultur jämfört med in vivo-förhållanden och därför inte upptäckas genom Western blot-analys. Överskott av glutamat är neurotoxisk och in vivo, är GLT-1 ansvarar för glutamat efflux från basalrummet (parenkym) till det apikala facket (blodcirkulationen). I astrocyternas kulturerna förblir GLT-1 uttryck mycket låg och induceras genom tillsats av glutamat i mediet 62,63. Vi conf ocksåirm expressionen av tillströmning transportörer vid den apikala membran såsom LRP1, LDLR och TfR. Funktionalitet för TfR och LDLR demonstrerades med bindning och transport experiment Tf-Cy3 och DiLDL från luminala till abluminala sidan av monolager som tidigare visats med ett nötkreatur in vitro BBB-modell 64. Intressant nog har det visat sig att lipid krav från astrocyter ökar expressionen av LDLR på hjärnans kapillära endotelceller 65,66 ytterligare bekräftar den fysiologiska överhörning mellan astrocyter och hjärna endotelceller, inklusive in vitro. Vi har valt att exemplifiera transport med fluorescerande färgämnen såsom som Cy3 och Dil tanke på att spektrofluorimetrisk analys finns i de flesta laboratorier, och kan vara användbar för att validera in vitro BBB: modeller. Emellertid är kvantifiering av fluorescens långt mindre känslig än radioaktiviteten och kräver en ökning av antalet försök för att erhålla signifikanta data.Helst Tf och LDL är oftast radioaktivt märkt (Jod 125) för sådan bindning / upptag och transportexperiment. Vi visar också att den differentierade endotelceller cellslager som erhålls med det föreslagna protokollet svarar på inflammation induceras av TNF-α, som avslöjades av CCL2 release och BBB öppning. CCL2 (MCP-1) och dess receptor CCR2 är involverade i CNS-sjukdomar såsom multipel skleros, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) 67, CNS-trauma 68 och är kända som förmedlare av leukocytmigration in i CNS i neuroinflammatoriska förhållanden 69,70. Med den testade protokoll, kan vi inte sluta på en polariserad utsöndring av CCL2 eftersom BBB öppning gör att CCL2 koncentrationen till jämvikt mellan de båda övre (apikala) och lägre (basala) fack. Följaktligen underskattar vi tydligt hur mycket CCL2 produceras av RBEC i apikala facket vid 24 tim (Figur 5A). Allmän översikt och begränsningar BBB In Vitro Models: I n Vivo kontra in vitro och Gnagare kontra mänskliga Jämförelser Många lovande CNS-läkemedel som visat sig effektiva i BBB passage in vitro misslyckades i kliniska prövningar på grund av bristande förutsägbarhet från in vitro BBB: modeller ofta baserade på celler som isolerats från andra arter än människa. Så vitt vi känner till har in vitro BBB: modeller är förmodligen mer prediktiva när det gäller att studera mekanistiska aspekter av proteinnätverk, signaltransduktion, transportörer och receptorer. Varje mekanism, väg eller mål som ska studeras in vitro måste karakteriseras för sin reglering av kompletterande miljö ledtrådar (andra celltyper, kemikalier, proteiner) och kombineras i studier situ med samma djurarter, Och när det är möjligt, med mikrokärl och endotelceller som isolerats från människor, med de begränsningar och försiktighet frammanade nedan. In vitro BBB: modeller måste ses som autonoma system, isolerade från kroppen reglering, men ändå begåvad med stora vivo egenskaper i och en potential för reglering av miljö-stickrepliker. Nr &quot;ideal&quot; in vitro BBB modell har föreslagits ännu 71,72,73 eftersom endoteliala cellmonoskikt saknar ett antal viktiga beståndsdelar i det neuro-glia kärlenhet (NGVU) och är isolerade från blod och kroppsregleringen. Avsaknaden av pericyter 74,16 eller nervceller 17,18 eller de olika beståndsdelarna i den extracellulära matrisen som används för plastbeläggning eller odlingsmediet och serum som används för celltillväxt i de vanligaste och &quot;lättast gjort&quot; in vitro BBB: modeller baserade på endotel celler differentieras med astrocyter kan modulera proteinuttryck in jämförelse med situationen in vivo-75. Dessa modeller kan uttrycka många transportörer som visas in vivo, men inte alla. I vissa fall har transportparametrar först verifieras i isolerade mikrokärl (närmast vivo-situationen i), och sedan studeras i cellkultursystem 76,61. Molekylärbiologisk forskning har gjort det möjligt karakterisering av gen-och proteinuttryck i isolerade mikrokärl och låga passage endothelial cellkulturer från samma art och mellan olika arter, oftast från små djur som gnagare (möss och råttor) eller från ko och gris i jämförelse till människor 77,78,75,15. Transcriptomic jämförelse mellan in vivo och in vitro hjärnan mikrovaskulära endotelceller uppvisade talrika gentranskript som var differentiellt uttryckta och oftast betydligt nedregleras in vitro. Transkript som kodar tillströmning transportörer såsom TfR och proteins inblandade i vesikler människohandel främst nedregleras i odlade hjärn endotelceller, vilket tyder på en allmän minskning av endocytos och vesikulär transport i sådana celler. Kultur manipulation när det gäller renhet (puromycin behandling) och behandling med hydrokortison kan hjälpa till att återställa en mer &quot;in vivo-liknande&quot; genuttryck profilen 77. Transcriptomic studier visade också viktiga skillnader mellan arter som ytterligare försvårar förutsägelser om läkemedelsupptag hos människa baserat på gnagare in vitro BBB: modellerna 75. In vitro BBB: modeller som inbegriper sam-kultur av humana endotelceller och astrocyter har beskrivits 15. Även om det är relevant, dessa modeller är svårare att genomföra regelbundet eftersom de kräver reglerad tillgång till obduktion mänsklig vävnad och det finns olikheter i kvalitet / egenskaper av den mänskliga hjärnan endotelceller beroende på ålder, sjukdomar, och eventuellt medicinsk treatment av givarna. Insatser måste göras för att utveckla nya in vitro-modeller som bättre återger den fysiologiska, anatomiska och funktionella egenskaper in vivo BBB. Samkulturer involverar typer tre-cell är mycket restriktiva och verkar svårt att genomföra rutinmässigt. Hittills har de mest komplexa in vitro BBB: modeller är de dynamiska in vitro modeller (DIV-BBB) som omfattar fartyg liknande organisation med astrocyter och inkluderar ett flöde av medium som efterliknar blodflödet 75,79,80,81,82, 83,84,85. När cerebrala endotelceller exponeras för ett flöde, aktiverar den genererade skjuvspänning mechanotransducers vid cellytan, vilka modulerar uttrycket av involverade i endotelial cellfysiologi, såsom celldelning, differentiering, migration och apoptos 80 olika gener. In vivo skjuvspänning alstras av blodflödet är ansvarig för mitotiskt stillestånd vid cellkontakt, som tillåter upprättandet av ettendotelial cellmonoskiktet i blodkärl 80. Genomisk och proteomik analys av normala mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller visade effekterna av skjuvspänningen i BBB endothelial fysiologi 84. Shear stress är ansvarig för cellöverlevnad, en högre grad av endotelcellsadhesion, effluxpump induktion och bättre polarisering av transportörer 75, reglering av glukosmetabolismen 75,86, oxidation medierad av CYP450 enzymer 75 och regleringen av paracellulära permeabilitet genom att öka uttrycket av gener som kodar för inter junctionala element som occludin och ZO-1 87,75,80 och därmed hög TEER omkring 1,500 - 2,000 ohm-cm 2, närmast känd in vivo parametrar 79,80 Inom bioteknik-och läkemedelsindustrin, rutinmässig screening av droger eller till och med hög throughput screening (HTS) och insatser för att minska djurförsök, leddetill utvecklingen av olika cellinjer som skall användas som ersättning för primärkulturen av cerebrala endotelceller som förblir svårare att ställa upp rutinmässigt. I de flesta fall var primärkulturer av cerebrala endotelceller transduceras med en immortaliserande genen (SV40 eller polyomavirus stor T-antigen eller adenovirus E1A), antingen genom transfektion av plasmid DNA eller genom infektion med hjälp av retrovirala vektorer 88,89,75. Flera endothelial cellinjer av cerebral ursprung har utvecklats såsom RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs eller rBCEC4 råtta cellinjer 88,75, den b.End3 muscellinje 90,75, den PBMEC/C1 - 2 porcin cellinje 87,75 och hCMEC/D3 human cellinje 89,75. Andra modeller är baserade på celler från icke-cerebrala ursprung såsom Madin-Darby canine kidney (MDCK) eller Caco2 cellinjer 12,75. Bland de olika humana cerebrala endothelial cell-linjer har hCMEC/D3 varit allmänt citerad och förbättras som en modell för BBB sedan starten 2005 91,92. Som primära kulturer, cellinjer nuvarande fördelar och begränsningar. De är lättare att hantera än primära kulturer, har en längre livslängd, är väl karakteriserade och möjliggöra reproducerbarhet mellan storskaliga experiment. Däremot kan cellinjer förlora vävnadsspecifika funktioner, förlorar miljölagstiftningen och skaffa en molekylär fenotyp helt annat än celler in vivo 75, 89. Särskilt monolager genereras från cellinjer närvarande reducerad täthet, låg Teer och visa transportör profilen variation 75,89. Således djurförsök eller studier i primära celler är ofta att föredra trots deras extra komplexitet.

Många läkemedel som utvecklas för behandling av centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar inte kan nå hjärnparenkymet i terapeutiskt relevanta koncentrationer. The BBB skyddar vävnaden hjärnan nervös från fluktuationer i plasmakomposition, från patogena agens, och upprätthåller homeostas hjärnparenkymet genom att begränsa icke-specifikt flöde av joner, peptider, proteiner och även celler in i och ut ur hjärnan 1. BBB: egenskaper induceras och underhålls av intim närhet och överhörning mellan de specialiserade klassen hjärnmikrokärls endotelceller och angränsande delar av neuro-glia-kärl-enhet (NGVU) såsom nervceller, gliaceller (mer exakt astrocyte slut fot), och pericyter ensheathed i basalmembranet, som huvudsakligen består av kollagen typ IV, fibronektin, laminin och proteoglykaner 2,3. Pericyter omfattar ca 22-32% av endotel på kapillär nivå och spela en viktigroll i regleringen av endotel spridning, angiogenes och inflammatoriska processer. Endotelceller bildar ett kontinuerligt skikt, som täcker den inre ytan hos kapillärerna. De är förbundna med varandra medelst TJs, som utgör en bandliknande struktur på den apikala region och att bidra till cell polarisering. Astrocyter reglera BBB: egenskaper och är källor av viktiga reglerande faktorer, såsom TGF-β, GDNF, bFGF och IL-6. Astrocyter med brist på GFAP med ofullständig funktionalitet inte kan reglera BBB: egenskaper 4. Nervceller är inte direkt inblandad strukturellt i bildandet av BBB men också reglerar viktiga aspekter av proteinuttryck och BBB-funktioner 5. I syfte att ytterligare studera strukturen, fysiologi och patologi av BBB ades in vitro-modeller av BBB utvecklats som forskningsverktyg. Brain endotelceller har hämtats från olika arter för att genomföra in vitro BBB: modeller baseradepå låga passage primära kulturer från nötkreatur 6,7, svin 8,9, råtta 10,11,12, mus 13 och även mänskligt 14,15. Dessa modeller är kända för att härma in vivo-BBB, speciellt när samodlades med gliaceller från råtta eller mus och / eller pericyter 16,12, och / eller neuronala föregångarcellhärledda astrocyter 17 och / eller neuroner 18. De &quot;i labb&quot; modeller tillverkas ofta från gnagare eftersom de tillåter in vitro / in vivo-experiment och jämförelser och / eller studier av hjärnans endotelceller framställts av transgena modeller 19. Nyutvecklad in vitro BBB: modeller har också utformats för att hjälpa till att förutsäga hjärnans upptag av potentiella CNS läkemedelskandidater innan in vivo-testning 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB: modeller används vanligen för att jämföra för transport av läkemedel till: i) kända penetration in i CNS eller med low permeabilitet över BBB och inga centrala effekter, och ii) den uppenbara Pe av samma läkemedel som uppmätts i djurmodeller av samma art. De läkemedel, som lätt passerar BBB är mestadels lipofilt och korsa cellmembranen hjärna endotelceller genom lipidmedierad fri diffusion (koffein, karbamazepin, etc.). De negativt transporterade läkemedel såsom digoxin, verapamil eller cyklosporin A aktivt extruderas genom hjärnans endotelceller uttransportörer såsom P-gp. Men många av de nyutvecklade terapeutiska molekyler är bioläkemedel, såsom rekombinanta proteiner, siRNA eller monoklonala antikroppar. De flesta av dem inte passera BBB grund: i) avsaknad av specifika transportörer, och ii) den tätt packade lager av endotelceller, som förhindrar högmolekylära molekyler från att genomgå paracellulär passage. Med dessa gränser &quot;trojansk häst&quot; strategier har genomförts med hjälp av vektorer (antikroppar, peptider) mot kända receptorer på BBB, inblandade in receptor medierad transport eller transcytos (RMT), såsom transferrin (Tf) receptor (TfR), insulinreceptorn (IR), eller medlemmar av LDL-receptorn (LDLR) relaterad receptorfamiljen (LDLR, LRP1). Dessa receptorer har hittats på isolerade hjärn kapillärer och i BBB in vivo 24,25. Transkription profiler för dessa receptorer, i synnerhet de av LDLR familjen, analyserades och jämfördes mellan hjärnans endotelceller och hjärnans endotelceller co-odlade med astrocyter eller i hjärnans kapillärer direkt efter deras extraktion från hjärnan 26. Pardridge 24 öppnas fältet med OX-26 antikropp mot transferrinreceptorn (TfR), följt av antikroppar mot insulinreceptorn och tillväxten insulinreceptorn 27,28. Med dessa antikroppsbaserade vektorer, har ArmaGen Technologies utvecklat en BBB molekylär trojansk häst plattformsteknik för att leverera läkemedel, inklusive proteiner, hela BBB 29. Denlitteraturen är rik på data som visar LRP1 uttryck i hjärnans endotelceller och dess roll som en kraftfull endocytic / scavenger-receptorn. Western blot-analys tydde på att LRP1 uttrycks i fraktioner anrikade på hjärnkapillärerna och i råtthjäma kapillära endotelceller 30. Företag som Angiochem mål LRP1 med peptid vektorer härrörande från aprotinin som främjar en effektiv drog tillströmning över BBB 31. Dock är LRP1 också involverad i aktiv transport av A-beta och dess utflöde / avslut från hjärnparenkymet till blod 32. Sådana uppgifter innebär LRP1 i en dubbelriktad transport över BBB, beroende på dess ligander. biOasis utvecklar Transcend teknik i ett protein melanotransferrin för transport av biologiska läkemedel såsom lysosomala enzymer och antikroppar över BBB 33 medan VECT-HORUS utvecklar peptid vektorer som riktar sig mot LDLR 34. Det finns data som tyder på att LRP och LDLR kan användas för att transportera difftekniker när molekyler såsom lysosomala enzymer 35,36 eller nanopartiklar komplex över BBB 37. Vårt intresseområde är läkemedelstillförsel till CNS med vektormolekyler och vektoriserade drogkandidater för behandling av CNS-sjukdomar. I synnerhet har läkemedelstillförsel över BBB vägas i samband med neuroinflammation, en process som kan variera i omfattning, men det är förmodligen gemensamt för alla CNS-skador och sjukdomar, bland annat hjärninflammation, multipel skleros, Alzheimers sjukdom etc. Neuroinflammation är associerad med BBB inflammation och potentiellt med förändringar i BBB fysiologi och permeabilitet med tanke på att paracellulära och transcellulär transport kan amplifieras i patologiska tillstånd 38,39,40,41,42,43. Till exempel, TNF-α, justera, och andra cytokiner modulerar inflammation, och försök med in vitro-BBB: modeller har visat att de kan förändra den paracellulära egenskaper the endotelcell-monoskikt 38,39,40 och att TNF-α leder också till en ökning av transcellulär transport av LDL 41, holotransferrin 42 och laktoferrin 43. Vårt mål var att utveckla och karakterisera en optimerad och mycket reproducerbar rått syngena BBB-modell med co-kulturer av primära hjärn endotelceller och astrocyter. Vi använde 5 veckor gamla och neonatala Wistarråttor för produktion hjärnans endotelceller och astrocyternas produktion respektive. En utmaning var att upprätta ett protokoll som möjliggör produktion av &quot;vecko reproducerbara&quot; BBB-modeller. För att nå detta mål, var varje steg i produktionsprotokoll som utförs på fasta veckodagar, med början från hjärnmikrokärlsproduktion på onsdagen i första veckan. Dissektioner utfördes nästan varje vecka under de senaste 3 åren. För att ytterligare förbättra reproducerbarheten av kulturerna, var ett kvalitetssäkringssystem inrättas. Alla Reagents och kemikalier refererades i en databas (träder, lager, utgångs sikt, etc.). Modellen karakteriserades efter ett antal kriterier, såsom endotelceller organisation och renhet, TEER, LY permeabilitet, svar på pro-inflammatoriska medel, kvalitativa och kvantitativa uttryck av TJ-proteiner, funktionalitet uttransportörer såsom P-gp, och receptorer involverade i transcytos över endotelceller cellslager såsom TfR eller LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

Blod-hjärnbarriären (BBB) ​​regleras särskilt molekylära och cellulära flöde mellan blodet och nervvävnad. Vårt mål var att utveckla och karakterisera en mycket reproducerbar rått syngena i modell av BBB vitro med hjälp av co-kulturer av primära råtthjärna endotelceller (RBEC) och astrocyter att studera receptorer som är inblandade i transcytos över endotelceller monolager. Astrocyter isolerades med mekanisk dissektion efter trypsin matsmältningen och frystes för senare co-kultur. RBEC isolerades från 5 veckor gamla rått-cortex. Hjärnorna rengöras från hjärnhinnorna och vit substans, och mekaniskt skiljas efter enzymatisk nedbrytning. Därefter fick den vävnadshomogenat centrifugerades i bovint serumalbumin för att separat kärl fragment från nervvävnad. Fartyget fragmenten genomgick en andra enzymatisk nedbrytning av fria endotelceller från deras extracellulära matrix. De återstående kontaminerande celler såsom pericyter var fTTERLIGARE elimineras genom plätering av mikrokärlsfragment i puromycin-innehållande medium. De var sedan passe på filter för samodling med astrocyter odlas på botten av brunnarna. RBEC uttryckte höga nivåer av tight junction (TJ) proteiner såsom occludin, claudin-5 och ZO-1 med en typisk lokalisering på cellgränserna. Den transendoteliala elektriska motståndet (TEER) av hjärn endothelial monolager, vilket indikerar täthet TJs nådde 300 ohm · cm 2 i genomsnitt. De endothelial permeabilitetskoefficienter (Pe) för lucifer gul (LY) var mycket reproducerbar med ett genomsnitt på 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotelceller organiserade i monolager uttryckte transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), visade en polariserad transport av rodamin 123, en ligand för P-gp, och visade särskild transport av transferrin-Cy3 och DiILDL över endotelceller monolager. Avslutningsvis ger vi ett protokoll för att inrätta en in vitroBBB-modell som är mycket reproducerbar på grund av de säkringsmetoder kvalitet, och det är lämpligt för forskning om BBB: transportörer och receptorer.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Ställa upp en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Rat blod-hjärnbarriären (BBB): Fokus på BBB Impermeabilitet och Receptor-medierad transport

Syftet med föreliggande studie var att validera reproducerbarhet en in vitro BBB-modellen som innebär en råtta syngent co-kultur av endotelceller och astrocyter. Den endotelceller cellslager presenterade hög TEER och låg LY permeabilitet. Uttryck av specifika TJ proteiner, var funktionella svar på inflammation och funktionalitet av transportörer och receptorer utvärderas.

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-guidad Rubbning av blod-hjärnbarriären med hjälp Transkraniell fokuserat ultraljud i en råttmodell

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Råttmodell av blod-hjärnbarriären avbrott Tillåt riktade Neurovaskulär Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Stretch i Brain mikrovaskulära endotelceller (cEND) som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisk hjärnskada Modell av blodhjärnbarriären

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxisk Stimulering av Brain Microslices som en<em&gt; In vitro</em&gt; Modell av stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Syre Glukos Deprivation och ny syresättning som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemi-reperfusion skada modell för att studera blodhjärnbarriären dysfunktion

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

En råtta Carotid ballongskada modell för att testa anti-kärlremodellering Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom framkallande ordningen i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Råttmodell och Hela montering Retina Förberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In vitro- analyser för att bedöma blod-hjärnbarriären Mesh-liknande fartygsformation och störning

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Förbättrad metod för inrättandet av ett In Vitro blod - hjärnbarriären modell baserat på svin hjärnan endotelceller

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Endotelcellstranscytosanalys som en in vitro-modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...