Name: rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00
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我们感谢亚当·科斯特和Altschuler领导和吴实验室进行有益的反馈和讨论的所有其他成员。这项研究是由美国国家卫生研究所的支持下授予R01 GM085442和CA133253（SJA），R01 GM081549（LFW），CPRIT RP10900（LFW）和韦尔奇基金会的I-1619（SJA）和I-1644（LFW）。

1。准备样品和成像<ol><li>细胞培养<ol><li>分裂的文化常规，并在20-70％汇合维护。一天的实验之前，生长的HeLa细胞在DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基，见表材料）和补充有10％FBS（胎牛血清）和1x青霉素/链霉素。 </li><li>在实验的当天，细胞分裂生长在文化（约50％汇合）。 </li><li>用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤细胞，暴露在几秒钟约2毫升胰蛋白酶/ EDTA（乙二胺四乙酸）的。吸出多余的胰蛋白酶/ EDTA?...

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

这里所描述的工作流程允许快速和容易表征和显微镜图像的对比。我们首先演示了如何这个工作流程可以帮助实验优化，例如通过快速执行质量控制的显微镜图像。接下来，我们展示了其潜力分析的高通量筛选数据：我们可以根据它们的作用机制组药物。药物的分组是可比较的，使用更复杂的方法6中发现，即使PhenoRipper是快几个数量级。 虽然我们已经发现这种方法对...

在过去的十年中，在成像技术的快速发展已经给许多实验室进行高通量显微镜的能力。我们面临的挑战已经转移从成像的一个分析之一。我们如何表征，比较，并探讨通过一个典型的高通量成像屏幕产生的复杂而微妙的表型的洪流？ 许多图像分析和信息平台，给用户先进的工具箱1-3从图像的大集合中提取的生物信息。然而，许多显著障碍仍然在分析来自高通量基于图像的画面数据。涉及选择的图像和算法参数微调的适当表征（对感兴趣的系统）的困难常常导致长的设置时间，尤其是对于用户不进行图像分析的专门知识。特别是，小区分割，识别单个细胞的过程中N个图像，就是这方面的一个主要瓶颈。分割可以是对实验参数如细胞类型，细胞密度和生物标志物高度敏感的，并经常需要对大数据集的重复调节。由于这些原因，图像分析常常是由专家进行的，而不是实验性的工作流程的一个组成部分是独立的，终端的步骤。这排除了分析和实验，检验发展的一个关键部分之间的快速反馈循环。 在这里，我们描述了被优化用于高通量荧光显微镜和避免了许多与上述困难的替代的工作流。为此，我们利用PhenoRipper 4，迅速 ​​地探索和显微图像分析的开源软件平台。显著，PhenoRipper避免许多由不尝试识别单个细胞参与细胞分割的挑战。相反，PhenoRipper把图像分为像素亚细胞大小的块和图像特征在它们所包含的块为单位。具体来说，PhenoRipper型材的标记共定位为基础的功能方面的块，并自动识别4在训练图像中最有代表性的块类型。 PhenoRipper然后分配给每个块最相似的块代表性的类型，最后表征根据它们所包含的块的类型的图像。 较传统的单细胞​​为基础的方法，该方法需要很少的微调和专业知识。这样，用户只需要设置两个参数：块大小和阈值强度（丢弃的图像的非细胞部分），这两者都设置有图形的反馈。重要的是，这里所描述的工作流程已被证明4可以轻松地扩展到更大的数据集，其中的速度和最小的微调提供了大量的时间和可靠性的收益。在实践中，我们发现，这个程序蟑螂降低了对安装和运行了4级的多个订单所需的时间。 PhenoRipper的主要输出是图像相似的视觉表示，从而使用户能够识别的，导致细胞显示相似的表型的实验条件组。 PhenoRipper发现典型的分组具有可比的“生物可解释性”的那些由比较费时，基于细胞的方法4产生。在实践中，这意味着它们通常，在执行一个典型的96 - 孔荧光显微术实验的半小时内，不另行图像分析经验实验者可以得到关于他或她的实验的性能可靠的读出。然后实验者可以开始探索不同的实验条件之间的关系，以及与这些关系到图像的表型。 在这里，我们证明这一点的工作流程，通过分析影响药物在不同的机械类对HeLa细胞染色的DNA和细胞骨架标记。与同一类药物处理的细胞的图像进行组合在一起，质量差的图像（染色文物，失焦的细胞等等）表现为异常值，使它们易于识别和潜在的丢弃。 而此工作流是为大量的基于图像的检测有用的，明显有许多情况下，不同的方法可能是更有益。例如，从PhenoRipper输出为主要的荧光模式跨越的实验条件下的相对比较。如果要求特定的单细胞特征的绝对表征，而不是（在细胞中的斑点的例如数），将需要一个单细胞为基础的分析。然而，即使在这种类型的情况，PhenoRipper是可能检测到的变化在这些单细胞的表型，因此可用于测定OPTI一个有用的工具mization。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

尽管在高通量显微镜的快速发展，定量图像为基础的检测依然构成显著的挑战。虽然各种专门的图像分析工具可用，最传统的图像分析为基础的工作流程，有陡峭的学习曲线（用于分析参数进行微调），并导致成像和分析之间的长期周转时间。特别是，小区分割，识别单个细胞的图像的过程中，是在这方面的一个主要瓶颈。 在这里，我们提出了一个替代，细胞分割自由的基础上PhenoRipper，一个开源软件平台设计的快速分析和显微镜图像的勘探工作流程。这里介绍的管道进行了优化细胞培养免疫荧光显微镜图像，需要最少的用户干预。不到半小时，PhenoRipper可以从一个典型的96孔实验分析数据并生成图像轮廓。用户可以然后直观地探索他们的数据，他们的实验进行质量控制，确保应对扰动和重复检查的可重复性。这有利于分析和实验，这是至关重要的过程中检测优化之间的快速反馈循环。这个协议是有用的不只是作为一个第一遍分析的质量控制，而且还可以被用作一个终端到终端的解决方案，特别是用于筛选。此处所描述的工作流扩展到大的数据集，如由高通量筛选产生，并且已显示出组实验条件下通过表型准确在宽范围的生物系​​统。该PhenoBrowser界面提供了直观的框架，探讨表型的空间和与图片属性生物注解。总而言之，这里所描述的协议将降低门槛采用的基于图像的屏幕定量分析。

在这里，我们测试了这个工作流的分组药物根据其作用机制的能力。将HeLa细胞接种在30孔384 - 孔板的和染色的DNA /肌动蛋白/α-微管蛋白。具体的初级抗体，荧光标记的第二抗体，并且所使用的其他荧光染料列于表材料。井均采用属于三个机制类（组蛋白去乙酰化酶抑制，微管定位和DNA损伤），24小时，并使用萤光显微镜20X物镜放大成像15药物。购入十六画面各孔，共480图像（×3信道）。这里所描?...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

在这里，我们描述了快速分析和探索使用PhenoRipper，最近开发的图像分析平台的荧光显微镜图像的集合的工作流。

快速分析和荧光显微镜图像的探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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