Name: rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Vi takker Adam Coster og alle andre medlemmer af Altschuler og Wu Labs for nyttige tilbagemeldinger og diskussioner. Denne forskning blev støttet af National Institute of Health tilskud R01 GM085442 og CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW) CPRIT RP10900 (LFW) og Welch Foundation I 1619 (SJA) og I-1644 (LFW).

1.. Forberedelse Prøver og Imaging <ol><li> Cellekultur <ol><li> Split kulturer rutinemæssigt og vedligeholde på 20-70% konfluens. En dag inden forsøget, vokser HeLa-celler i DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, se tabel Materialer) og suppleret med 10% FBS (føtalt bovint serum) og 1x penicillin / streptomycin. </li><li> På dagen for eksperimentet opdele celler vokser i kultur (ca. 50% konfluerende). </li><li> Vask cellerne med PBS (fosfatbufferet salt), udsættes for cirka 2 ml trypsin / EDTA (Ethylendiaminte...

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

Den her beskrevne arbejdsgang giver hurtig og nem karakterisering og sammenligning af mikroskopi billeder. Vi først viste, hvordan denne arbejdsproces kan hjælpe eksperiment optimering, for eksempel ved hurtigt at udføre kvalitetskontrol på mikroskopi billeder. Dernæst viste vi dens potentiale til at analysere high-throughput screening data: vi var i stand til at gruppere lægemidler baseret på deres virkningsmekanisme. Grupperingen af lægemidler var sammenlignelig med den, der findes ved hjælp af mere komplekse...

Gennem det seneste årti, har hurtige fremskridt i tænkelig teknologi givet mange laboratorier evnen til at udføre high-throughput mikroskopi. Nu har udfordringen flyttet fra en af ​​billedbehandling til en analyse. Hvordan kan vi karakterisere, sammenligne og udforske den syndflod af komplekse endnu subtile fænotyper genereret af en typisk high-throughput imaging skærm? En række image-analyse-og edb-platforme har givet brugere sofistikerede værktøjskasser 1-3 for at udtrække biologisk information fra store samlinger af billeder. Alligevel er der mange væsentlige hindringer fortsat analysere data fra high-throughput billedbaserede skærme. Vanskeligheder forbundet med at vælge en passende beskrivelser af de billeder og finjustering af algoritmiske parametre (til systemet af interesse) resulterer ofte i lange opsætningstider, især for brugere uden image-analyse ekspertise. Især segmentering celle, processen med at identificere de enkelte celler i enn billede, er en stor flaskehals i denne henseende. Segmentering kan være meget følsomme over for eksperimentelle parametre såsom celletype celle tæthed og bio-markører, og ofte kræver gentagne justering for et stort datasæt. Af disse grunde billedanalyse er ofte en uafhængig terminal trin udføres af specialister snarere end en integreret del af den eksperimentelle arbejdsgang. Dette udelukker hurtig feedback cyklus mellem analyse og eksperiment, en afgørende del af assay udvikling. Her beskriver vi en alternativ arbejdsproces, der er optimeret til high-throughput fluorescensmikroskopi og undgår mange af de førnævnte problemer. Til dette formål, gør vi brug af PhenoRipper 4, en open source-software platform for hurtig efterforskning og analyse af mikroskopi billeder. Betydeligt, PhenoRipper undgår mange af de udfordringer, der er forbundet med celle segmentering ved ikke at forsøge at identificere enkelte celler. I stedet PhenoRipper inddeler billederne i pixelblokke af subcellulære størrelse og karakteriserer billeder i form af blokke, de indeholder. Konkret PhenoRipper profiler blokke i form af markør-co-lokaliseringstoppe-baserede funktioner og automatisk identificerer 4 de mest repræsentative blok typer i uddannelsen billeder. PhenoRipper tildeler derefter til hver blok den mest lignende repræsentative blok typen, og endelig karakteriserer billeder baseret på de typer af blokke, de indeholder. Sammenlignet med mere traditionelle single-celle-baserede tilgange, denne tilgang kræver minimal finjustering og ekspertise. Som sådan, kun brugere nødt til at indstille to parametre: blokken størrelse og en tærskel intensitet (for at kassere ikke-cellulære dele af et billede), som begge er sat med grafisk feedback. Vigtigere er det, har arbejdsgangen beskrevet her vist 4 nemt at skalere til meget større datasæt, hvor hastighed og minimal finjustering giver stor tid og pålidelighed gevinster. I praksis finder vi, at denne appskalle reducerer den tid, der kræves både for opsætning og kører af flere størrelsesordener 4. Den primære produktion af PhenoRipper er en visuel repræsentation af billedet lighed, som gør det muligt for brugeren at identificere grupper af eksperimentelle betingelser, der forårsager celler til at vise lignende fænotyper. De grupperinger PhenoRipper finder typisk sammenlignelige &quot;biologisk interpretability&quot; til dem, der genereres af mere tidskrævende, celle-baserede metoder 4. I praksis betyder dette, at ofte, inden for en halv time for at udføre en typisk 96-brønds fluorescens mikroskopi eksperiment, en eksperimentator uden forudgående image-analyse erfaring kan få en pålidelig udlæsning om udførelsen af ​​hans eller hendes eksperiment. Forsøgslederen kan derefter begynde at udforske relationerne mellem forskellige eksperimentelle betingelser, og som vedrører disse relationer til billede fænotyper. Vi viser denne arbejdsgang her ved at analysere virkningenaf narkotika i distinkte mekanistiske klasser på HeLa-celler farvet for DNA-og cytoskeletal markører. Billeder af celler behandlet med den samme klasse af lægemidler blev samlet og dårlige kvalitet billeder (farvningsprocedurer artefakter, ude af fokus celler og så videre), optrådte som outliers, hvilket gør dem lette at identificere og eventuelt kassere. Mens denne arbejdsgang er nyttig til en lang række billed-baserede assays, der er tydeligvis mange situationer, hvor en anden tilgang kunne potentielt være mere informative. For eksempel output fra PhenoRipper er primært en relativ sammenligning af fluorescens mønstre tværs eksperimentelle betingelser. Hvis en absolut karakterisering af en specifik enkelt celle træk blev i stedet kræves (for eksempel antallet af prikker i en celle), vil en enkelt celle-baseret analyse være påkrævet. Men selv i denne type situation, PhenoRipper er sandsynligt at konstatere ændringer i disse encellede fænotyper og derfor være et nyttigt redskab for analyse opticessorens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Trods hurtige fremskridt i high-throughput mikroskopi, kvantitative billedbaserede assays stadig store udfordringer. Mens en række specialiserede billede analyseværktøjer er til rådighed, de fleste traditionelle image-analyse-baserede arbejdsgange har stejle læringskurver (til finjustering af analyseparametre), og resultere i lange ekspeditionstider mellem billedbehandling og analyse. Især celle segmentering, processen med at identificere de enkelte celler i et billede, er en stor flaskehals i denne henseende. Her præsenterer vi en suppleant, celle-segmentering-fri workflow baseret på PhenoRipper, en open source-software platform designet til en hurtig analyse og udforskning af mikroskopi billeder. Rørledningen, der præsenteres her er optimeret til immunfluorescensmikroskopi billeder af cellekulturer og kræver minimal indgriben fra brugeren. Inden for en halv time, kan PhenoRipper analysere data fra en typisk 96-brønds eksperiment og generere billede profiler. Brugerne kanså visuelt udforske deres data, udføre kvalitetskontrol på deres eksperiment, sikre et svar på perturbationer og kontrollere reproducerbarhed gentagelser. Dette muliggør en hurtig feedback cyklus mellem analyse og forsøg, som er afgørende under analyse optimering. Denne protokol er nyttig ikke blot som en first-pass-analyse til kvalitetskontrol, men også kan bruges som en end-to-end løsning, især for screening. Den her beskrevne arbejdsgang skaleres store datasæt, såsom dem der genereres af high-throughput skærme, og har vist sig at gruppere eksperimentelle betingelser ved fænotype nøjagtigt over et bredt område af biologiske systemer. Den PhenoBrowser interface giver en intuitiv rammer for at udforske den fænotypiske plads og relatere billedegenskaber for biologiske anmærkninger. Tilsammen vil protokollen beskrevet her sænke barriererne for vedtagelsen af ​​kvantitativ analyse af billede baseret skærme.

Her testede vi mulighed for denne arbejdsproces for at gruppere lægemidler baseret på deres virkningsmekanisme. HeLa-celler blev podet i 30 brønde i en plade med 384 brønde og farves for DNA / actin / α-tubulin. De specifikke primære antistoffer, fluorescens-mærkede sekundære antistoffer, og andre fluorescerende pletter, der blev anvendt, er anført i tabel Materialer. Brønde blev behandlet med 15 lægemidler, der tilhører tre mekanistiske klasser (histondeacetylase inhibering mikrotubulus målretning og DNA-?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Her beskriver vi en arbejdsgang for hurtigt at analysere og udforske samlinger af fluorescens mikroskopi billeder ved hjælp PhenoRipper, et nyligt udviklet image-analyse platform.

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Et analyseværktøj, der kvantificerer cellemorfologi Ændringer fra Tredimensionelle fluorescensbilleder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualisere Stromule Frekvens med Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis hjælp Automated Fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerization dynamik af celleoverflade receptorer i levende celler ved total intern refleksion Fluorescens mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In Situ Udforskning af Murine Megakaryopoiesis ved hjælp af Transmission ElektronMikroskopi

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Hurtig In Vivo Fiksering og isolering af translationelle komplekser fra eukaryote celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Fluorescens levetid makro imager til biomedicinske applikationer

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Hurtig analyse og udforskningen af fluorescensmikroskopi Images