Name: rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Wij danken Adam Coster en alle andere leden van de Altschuler en Wu labs voor nuttige feedback en discussies. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institute of Health verleent R01 GM085442 en CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) en de Welch Stichting I-1619 (SJA) en I-1644 (LFW).

1. Voorbereiden van monsters en Imaging <ol><li> Celcultuur <ol><li> Split culturen routinematig en bij 20-70% confluentie handhaven. Een dag voor het experiment groeien HeLa cellen in DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, zie tabel Materials) en aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum) en 1 x penicilline / streptomycine. </li><li> Op de dag van het experiment, split cellen groeien in cultuur (ongeveer 50% confluent). </li><li> Was de cellen met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), blootgesteld aan ongevee...

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

De hier beschreven workflow zorgt voor een snelle en eenvoudige karakterisering en vergelijking van microscopie beelden. We eerst aangetoond hoe deze workflow experiment optimalisatie, bijvoorbeeld kan helpen door snel uitvoeren van kwaliteitscontrole op microscopie beelden. Vervolgens toonden we het potentieel voor het analyseren hoog-gegevens: we konden groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. De groepering van geneesmiddelen was vergelijkbaar met die gevonden met complexere 6, hoewel Pheno...

In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in de imaging-technologie veel labs krijgt de mogelijkheid om high-throughput microscopie. De uitdaging is nu verschoven van een van beeldvorming om een ​​analyse. Hoe kunnen we karakteriseren, vergelijken, en verken de stortvloed van complexe maar subtiele fenotypes die door een typische high-throughput imaging scherm? Een aantal imago-analyse en informatica platforms hebben gebruikers geavanceerde gereedschapskisten gegeven 1-3 voor de extractie van biologische informatie uit grote verzamelingen van afbeeldingen. Toch blijven er nog vele belangrijke hindernissen in het analyseren van gegevens van high-throughput-image-based schermen. Problemen in verband met het kiezen van geschikte karakteriseringen van de beelden en fijnafstelling van algoritmische parameters (het systeem van rente) leiden vaak tot lange insteltijden, vooral voor gebruikers zonder beeldanalyse expertise. Vooral cel segmentatie, het identificeren individuele cellen in eenafbeelding n, is een belangrijk knelpunt in dit verband. Segmentatie kunnen zeer gevoelig zijn voor experimentele parameters zoals het type cel, dichtheid en bio-markers, en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote dataset. Daarom beeldanalyse vaak een onafhankelijke terminal stap uitgevoerd door deskundigen plaats van een integraal deel van het experimentele workflow. Dit voorkomt de snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, een cruciaal onderdeel van assay ontwikkeling. Hier beschrijven we een alternatieve workflow die is geoptimaliseerd voor high-throughput fluorescentiemicroscopie en vermijdt vele van de bovengenoemde problemen. Hiervoor maken we gebruik van PhenoRipper 4, een open-source softwareplatform voor snelle verkenning en analyse van microscopie beelden. Aanzienlijk, PhenoRipper vermijdt veel van de uitdagingen die betrokken zijn bij cel segmentatie door niet te proberen om enkele cellen te identificeren. In plaats daarvan verdeelt PhenoRipper afbeeldingen in pixelblokken subcellulaire grootte en kenmerkt afbeeldingen in termen van de blokken die ze bevatten. Concreet PhenoRipper profielen blokken in termen van marker-colocalization gebaseerde functies en identificeert automatisch 4 de meest representatieve soorten blok in de training beelden. PhenoRipper dan toekent aan elk blok het meest vergelijkbaar type representatieve blok, en tenslotte kenmerkt Afbeeldingen op basis van de aard van de blokken die ze bevatten. Vergelijking met de meer traditionele single-cel-gebaseerde benaderingen, deze aanpak vereist een minimale fine tuning en expertise. Als zodanig, gebruikers hoeven slechts twee parameters: de blokgrootte en een drempel intensiteit (op niet-cellulaire delen van een beeld ontdoen), beide zijn ingesteld met grafische feedback. Belangrijk is dat de hier beschreven workflow aangetoond 4 gemakkelijk schalen naar veel grotere datasets, waarbij de snelheid en de minimale fine tuning biedt grote tijd en betrouwbaarheid winsten. In de praktijk zien we dat deze appvoorn reduceert de tijd die nodig is, zowel voor de installatie en actief door meerdere ordes van grootte 4. De primaire uitvoer van PhenoRipper is een visuele weergave van beeld gelijkenis, waarmee de gebruiker groepen experimentele omstandigheden die veroorzaken cellen vergelijkbare fenotypen laten identificeren. De groeperingen PhenoRipper Typisch voelt hebben vergelijkbare &quot;biologische uitlegbaarheid&quot; die gegenereerd door tijdrovender, cel-gebaseerde methoden 4. In de praktijk betekent dit dat vaak, binnen een half uur van het uitvoeren van een typische 96-well fluorescentie microscopie experiment, een experimentator zonder voorafgaande beeldanalyse ervaring kan een goede weergave over de prestaties van zijn of haar experiment te krijgen. De onderzoeker kan dan beginnen met het verkennen van de relaties tussen de verschillende experimentele condities en in verband deze relaties op de foto fenotypes. We tonen deze workflow hier door het analyseren van de effectenvan drugs in verschillende mechanistische lessen op HeLa-cellen gekleurd voor DNA en cytoskelet markers. Beelden van cellen behandeld met dezelfde klasse van drugs werden gegroepeerd, en slechte kwaliteit beelden (kleuring artefacten, onscherp cellen enzovoort) verscheen als uitschieters, waardoor ze gemakkelijk te identificeren en wellicht gooi. Hoewel deze werkstroom is nuttig voor een groot aantal beeld-gebaseerde testen zijn duidelijk veel situaties waarin een andere aanpak potentieel informatief zijn. Bijvoorbeeld, de uitvoer van PhenoRipper vooral een relatieve vergelijking van fluorescentie patronen in experimentele omstandigheden. Indien een absolute karakterisering van specifieke cel trait plaats is vereist (bijvoorbeeld het aantal spikkels in een cel), wordt een enkele-cel gebaseerde analyse vereist. Niettemin, zelfs in dergelijke situatie PhenoRipper waarschijnlijk veranderingen in deze eencellige fenotypes detecteren en daarom een ​​nuttig instrument voor analyse optimaalmization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

Ondanks de snelle ontwikkelingen in de high-throughput microscopie, kwantitatieve-image-gebaseerde testen vormen nog steeds belangrijke uitdagingen. Terwijl een verscheidenheid aan gespecialiseerde beeldanalyse tools zijn beschikbaar, de meeste traditionele beeld-analyse-gebaseerde workflows hebben steile leercurve (voor fijnafstelling van analyse parameters) en leiden tot lange doorlooptijden tussen beeldvorming en analyse. In het bijzonder cel segmentatie, het proces van identificatie van afzonderlijke cellen in een beeld, is een belangrijk knelpunt in dit verband. Hier presenteren we een alternatieve, cel-segmentatieloze workflow op basis van PhenoRipper, een open-source software platform dat is ontworpen voor de snelle analyse en verkenning van microscopie beelden. De hier gepresenteerde pijpleiding is geoptimaliseerd voor immunofluorescentie microscopie beelden van celculturen en vereist een minimale tussenkomst van de gebruiker. Binnen een half uur, kan PhenoRipper analyseren van een typische 96-well experiment en het genereren afbeelding profielen. Gebruikers kunnenvervolgens visueel hun gegevens te verkennen, uit te voeren kwaliteitscontrole op hun experiment, verzekeren reactie op verstoringen en check reproduceerbaarheid van herhalingen. Dit vergemakkelijkt een snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, wat cruciaal is tijdens test optimalisatie. Dit protocol is niet alleen nuttig als een eerste doorgang analyse kwaliteitscontrole, maar ook kan worden gebruikt als een end-to-end oplossing, vooral voor screening. De hier beschreven workflow schalen naar grote datasets zoals die gegenereerd worden door high-throughput-schermen, en is aan de groep experimentele omstandigheden aangetoond door fenotype nauwkeurig over een breed scala van biologische systemen. De PhenoBrowser interface biedt een intuïtieve kader om de fenotypische ruimte te verkennen en hebben betrekking beeld eigenschappen aan biologische annotaties. Samen genomen, zal de hier beschreven protocol verlagen de barrières op de aanneming van een kwantitatieve analyse van image-based schermen.

Hier testten we de mogelijkheid van deze werkstroom groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. HeLa-cellen werden uitgezaaid in 30 putjes van een 384-wells plaat en gekleurd voor DNA / actine / α-tubuline. De specifieke primaire antilichamen, fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, en andere fluorescerende vlekken die werden gebruikt zijn vermeld in Tabel Materials. Putjes werden behandeld met 15 geneesmiddelen behoren tot drie klassen mechanistische (histon deacetylase remmende, microtubuli targe...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Research

JoVE Journal

Biology

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Oligomerisatie dynamiek van celoppervlak receptoren in levende cellen door totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie gecombineerd met cijfer-en helderheids analyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

In situ Exploratie van Murine Megakaryopoiesis met behulp van Transmissie ElektronenMicroscopie

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...